BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

4. LAS TÉCNICAS DE PCR

Elena Rodríguez
Curso 2022/2023
4.3. PCR estándar o convencional

La PCR estándar, convencional o básica es la forma más simple de PCR, en la que se amplifica un único
fragmento de ADN, con un único par de cebadores y en un único proceso de amplificación a tiempo final.

4.3.1. La mezcla de reacción

Necesarios para que la PCR se
Tampón que contiene todos los reactivos: desencadene de forma adecuada.

• Aporta el pH y la concentración salina adecuados para la óptima Reactivos disueltos

actividad de la ADN polimerasa con un máximo de fidelidad. ▪ Cloruro magnésico.
▪ Desoxinucleótidos trifosfato.
• Suelen ser tampones a base de Tris con cloruro de potásico (KCl), ▪ Cebadores.
a un pH de entre 8,3 y 9,0. ▪ ADN polimerasa.
▪ ADN molde.
• Se suministra en forma concentrada (2x, 5x o 10x) junto con la
▪ Otros aditivos y potenciadores.
ADN polimerasa.
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4.3. PCR estándar o convencional

▪ Cloruro magnésico:

• Las ADN polimerasas termoestables requieren iones de magnesio (Mg2+) como cofactor, que se
aportan a la mezcla de reacción en forma de cloruro magnésico (MgCl2).
- La ausencia o una concentración excesivamente baja de Mg2+ libre en la mezcla de reacción
determina la actividad de la ADN polimerasa.
- Una concentración excesivamente alta determina una menor fidelidad en la replicación.

• Cada ADN polimerasa tiene una concentración óptima de Mg2+ libre para su buen funcionamiento.
➢ Taq polimerasa → concentración final de MgCl2 en la mezcla de reacción de 1,5mM.

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▪ Desoxinucleótidos trifosfato:

• La mezcla de reacción debe contener los cuatro desoxinucleótidos que componen las moléculas
de ADN en forma de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) para que la ADN polimerasa pueda
usarlos como sustrato (incorporarlos a las cadenas en crecimiento).
- Los cuatro dNTPs deben estar presentes en la misma concentración, en caso contrario
disminuye la fidelidad de la enzima.
- Se suministran concentrados en una concentración total de 10mM (2,5mM de cada dNTP).
- La concentración final estándar de la mezcla de reacción de cada dNTP es 200mM.

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▪ Cebadores:
• La concentración final de cada cebador en la mezcla de reacción debe ser la misma y debe
establecerse de forma experimental para cada pareja.
• Concentraciones finales de entre 200 y 400nM de cada cebador suelen dar buenos resultados.

▪ ADN polimerasa:
• La elección de una u otra ADN polimerasa dependerá de la fidelidad requerida en la amplificación,
de la longitud del fragmento que se va a amplificar y de la secuencia que se va a amplificar.
• Se suministran concentradas en soluciones con un 50% de glicerol y los fabricantes indican su
concentración óptima de trabajo (entre 1 y 2,5 unidades en un volumen de reacción final de 50 μl).
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▪ ADN molde:
• Contiene el fragmento de interés que se quiere amplificar. Normalmente se utiliza ADN purificado.
• Para que la PCR se desarrolle de manera óptima, hay que tener en cuenta tanto la calidad como la
cantidad de ADN molde.

Calidad del ADN molde: En condiciones ideales debe cumplir los siguientes criterios:
• Alto grado de integridad: alto peso molecular, no degradado ni fragmentado y sin mellas.
• Cociente A260/A280 entre 1,7 y 2,0: garantiza que no está contaminado con proteínas.
• Libre de contaminantes: pueden inhibir la reacción de PCR (por inactivación de la ADN
polimerasa o por secuestro del Mg2+ libre).
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Origen Contaminante
Tejido muscular Mioglobina
Piel Melanina
Heces Sales biliares
Tejidos vegetales Polisacáridos
Tejidos animales Colágeno
Muestra
biológica Suelos y vegetales Ácido húmico
Contaminantes del ADN molde, Hemoglobina
Sangre
inhibidores de la PCR. (grupo hemo)
EDTA
Pueden ser introducidos en la mezcla Sangre anticoagulada Citrato sódico
de reacción como contaminantes del Heparina

ADN molde. SDS

Acetato sódico
Fenol
Reactivos empleados en la
Cloroformo
extracción y purificación de ADN
Isopropanol
Etanol Elena Rodríguez
Xilol Curso 2022/2023
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Cantidad del ADN molde:

• La cantidad idónea para obtener los mejores resultados en una PCR dependerá de la complejidad
del ADN que se estudia:

– ADN plasmídico: entre 0,1 y 1 ng.

No es aconsejable sobrepasar los 10
– ADN genómico bacteriano: entre 1 y 10 ng. ng de ADN/μl de mezcla de reacción
(500 ng de ADN molde para un
– ADN genómico humano: entre 100 y 300 ng. volumen de reacción final de 50 μl).

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▪ Otros aditivos y potenciadores:

• Se añaden a la mezcla de reacción cuando el rendimiento de la PCR es bajo o aparecen amplificados

productos no deseados, debidos a la presencia de contaminantes o a la naturaleza del ADN molde o
de los cebadores y a su secuencia.

• Actúan como potenciadores de la PCR, aumentando el rendimiento de la reacción o disminuyendo

la aparición de productos no deseados.

• Tienen diferentes mecanismos de acción y no ejercen los mismos efectos beneficiosos en todas las
PCR. Su uso se debe limitar a los casos problemáticos, estudiando su efecto de forma experimental.

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Aditivos utilizados en PCR. Aditivos Mecanismo de acción

DMSO
Relación entre los aditivos y su Disminuyen la Tm del ADN
Formamida
posible mecanismo de acción para molde
Betaína
aumentar el rendimiento de la PCR. Gelatina
Estabilizan la Taq ADN
Glicerol
polimerasa
Polietilenglicol (PEG)
Une y bloquea inhibidores
Albúmina bovina (BSA)
de la PCR
Sulfato amónico Facilita la desnaturalización
Previenen la agregación de la
Detergentes no iónicos
ADN polimerasa

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Requiere:
4.3.2. Preparación de las muestras 1. Ajustar el volumen de reacción.
2. Elaborar la mezcla “master”.
1. Ajuste del volumen de reacción: 3. Establecer los controles + y -.

• Decidir el volumen final de la mezcla de reacción (normalmente 25 o 50 μl).

• Calcular los volúmenes de cada reactivo que se añadirá a la mezcla (se suministran concentrados),
dependiendo de la concentración final que queramos obtener.

• La diferencia entre la suma de los volúmenes de cada componente y el volumen final de la mezcla
de reacción se completa con agua estéril grado PCR.

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2. Elaborar la mezcla “máster” (master mix):

• La posibilidad de producir errores de pipeteo muy elevada: las reacciones de PCR se realizan en
volúmenes muy pequeños y los componentes se suministran concentrados, las cantidades que se
van a pipetear son muy pequeñas (entre 0,5 y 5μl).

• Las distintas PCR se realizarán en condiciones diferentes: normalmente se realizan múltiples

reacciones simultáneamente, los posibles errores cometidos en cada tubo son distintos.

• Es preferible preparar una sola mezcla de reacción: para conseguir que la composición de la mezcla
de reacción sea homogénea para todas las pruebas que se realicen simultáneamente.

La mezcla ”máster” incluye todos los componentes excepto el ADN molde.

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• Cálculo de la cantidad de cada componente:

- Se multiplica la cantidad necesaria para una reacción por el número de muestras que se
van a procesar simultáneamente + 1.
- En el número de muestras hay que incluir los controles positivo y negativo de la técnica.

Cantidad componente = Cantidad una reacción x N.º de muestras (con C+ y C– ) + 1

• Completada la mezcla máster, se reparte la cantidad adecuada a cada tubo de reacción y se añaden
los respectivos ADN molde.

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Volumen N.º de Volumen Concentración

Reactivo
/tubo tubos final final

Ejemplo de mezcla máster estándar Tampón 10x 5 μl 11 55 μl 1x

para realizar 10 PCR. MgCl2 50 mM 1,5 μl 11 16,5 μl 1,5 mM

200 μM
Para realizar los cálculos suponemos que cada dNTPs 10 mM 4 μl 11 44 μl
(cada uno)
PCR se va a realizar en un volumen de mezcla Cebador F
1 μl 11 11 μl 400 nM
(20 pmol/μl)
de reacción final por tubo de 50 μl y que la
Cebador R
cantidad de ADN molde por tubo es 1 μl. (20 pmol/μl)
1 μl 11 11 μl 400 nM

En consecuencia, hay que realizar los cálculos Taq ADN

polimerasa 0,5 μl 11 5,5 μl 1,25 U/50 μl
para preparar 11 tubos (10 + 1) con 49 μl de (2,5 U/μl)
mezcla de reacción cada uno. Agua estéril
36 μl 11 396 μl
mQ
Total 49 μl 11 539 μl

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1 pmol/μl = 1 μM V inicial x C inicial = V final x C final Curso 2022/2023
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▪ Control positivo y control negativo:

Además de las muestras problema en las que tendrá lugar la reacción de PCR, en cada tanda se preparan
un control positivo y un control negativo de la técnica:

Tubo con mezcla máster al que se le añade ADN molde

Control positivo control que contiene el fragmento que se quiere amplificar.

Tubo con mezcla máster en el que se sustituye el ADN

Control negativo
molde por un volumen igual de agua de grado PCR, de
o blanco
manera que no habrá ADN presente en la reacción.

Una vez que las muestras y los controles están preparados, se llevan al termociclador para iniciar la PCR.
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4.3.3. Programación del termociclador

El termociclador es el aparato en el que se lleva a cabo la PCR. Permite programar los ciclos repetitivos
con varias temperaturas y tiempos de incubación para que se desarrollen de forma automatizada.

• La programación del termociclador para amplificar un

1. Desnaturalización inicial.
fragmento de ADN mediante PCR estándar incluye tres
etapas principales. 2. Ciclos de replicación.
3. Extensión final.
• Terminan con una incubación final para el mantenimiento
de los productos de la reacción hasta su retirada de la 4. Mantenimiento.
máquina.
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1. Desnaturalización inicial.
• Es la etapa que inicia la reacción de PCR.
• Consiste en calentar la mezcla de reacción a 94-95°C durante varios minutos para asegurar la
completa desnaturalización de todas las moléculas bicatenarias de ADN presentes en la mezcla.

2. Ciclos de replicación.
Para esta etapa se programan:
2. Ciclos de replicación.
• Las temperaturas y los tiempos de incubación
• Desnaturalización.
de cada una de las fases del ciclo básico de PCR:
• Hibridación.
• El número de veces que se va a repetir el ciclo
• Extensión.
(n° de ciclos de replicación). Elena Rodríguez
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Cuanto más abundante sea el fragmento que

El n° de ciclos de replicación va a depender del
se va a amplificar, menor número de ciclos de
número inicial de copias del fragmento que se
replicación serán necesarios para acumular
quiere amplificar en la muestra de estudio.
una cantidad suficiente de amplicones.

– Normalmente el número de ciclos oscila entre 25 y 35. Cantidad Número

ADN molde de ciclos
– Se puede aumentar hasta 40 para moldes escasos o problemáticos.

– Por encima de 40 aumenta considerablemente la probabilidad de que aparezcan productos

no deseados inespecíficos y la ADN polimerasa pierde actividad por el tiempo acumulado a
temperaturas de desnaturalización.
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3. Extensión final.

• Es la etapa que finaliza la reacción de PCR.

• Consiste en una incubación única a la temperatura óptima de polimerización de la ADN

polimerasa durante 5-10 minutos, para asegurarnos de que todos los productos de PCR
están completos y en forma de doble hélice.

4. Mantenimiento.

• Última incubación a 4°C sin límite de tiempo para mantener las muestras hasta que se
retiren del termociclador, anulando la actividad de la enzima.

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Protocolo de programación de un termociclador.

Para amplificar mediante PCR estándar un fragmento
de 500 pb con Taq ADN polimerasa.

Etapa Fase Temperatura Tiempo N.º de ciclos

Desnaturalización inicial 95 °C 3 min Incubación única
Desnaturalización 95 °C 30 seg
Ciclo de replicación Hibridación de cebadores 57 °C 30 seg 30 ciclos
Extensión 72 °C 45 seg
Extensión final 72 °C 7 min Incubación única
Esquema de programación de un termociclador
Mantenimiento 4 °C ∞ Incubación única para realizar una PCR estándar

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4.3.4. Análisis de los productos amplificados

• Finalizada la PCR se recuperan las muestras amplificadas del termociclador y se analiza el resultado
(detección de los productos amplificados).

• Se analiza mediante una electroforesis en gel (agarosa 0,5-2,0% y marcador de tamaños):

– Una única banda del tamaño adecuado indica que la PCR ha funcionado correctamente.
– Varias bandas de distintos tamaños indica la presencia de productos de amplificación no deseados.
➢ Se debe a que durante la PCR se han amplificado inespecíficamente fragmentos de ADN
distintos de la diana específica.
➢ Hay que repetir la reacción variando la programación del termociclador o la composición de
la mezcla de reacción hasta conseguir un resultado específico. Elena Rodríguez
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▪ Resultado positivo:
• Si la PCR se realiza con fines exclusivos de detección, la observación de una banda específica es
suficiente para afirmar que la secuencia diana está presente en la muestra (resultado positivo).
• Si existieran problemas de contaminación en la mezcla máster:

¿Cómo descartar un falso positivo?

– En cada tanda de PCR se procesa simultáneamente un control negativo o blanco (C-),

en el que el ADN molde se sustituye por agua de grado PCR.
➢ La calle correspondiente al blanco debe aparecer limpia, sin bandas.
➢ Si se detecta alguna banda indicaría contaminación (de algún reactivo o pipeta), lo que
invalida los resultados de la tanda.
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▪ Resultado negativo:
• La ausencia de banda específica en una muestra problema indica, a priori, que la muestra no
contiene la secuencia diana y, por tanto, el resultado sería negativo.
• No es suficiente para afirmar que el resultado es negativo, puesto que algún reactivo puede no
funcionar correctamente o la muestra puede contener inhibidores de la PCR.

¿Cómo descartar un falso negativo?

– Validar la mezcla de reacción: mediante el control positivo de la técnica (C+), que se

procesa simultáneamente con las muestras.
➢ Si todos los reactivos funcionan bien, en el control positivo se observará la banda específica.
➢ En caso contrario hay algún problema en la mezcla máster y se invalida la tanda.
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Electroforesis en gel de agarosa para visualizar el

resultado de una PCR.
• Línea 1: blanco (no se observa ninguna banda).
• Línea 3: marcador de tamaños (incrementos de 100 pb).
• Líneas 4-15: muestras problema. Todas las muestras
contienen la secuencia investigada de 630 pb (resultado
positivo). No se observan bandas inespecíficas de
productos no deseados.

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Electroforesis en gel de agarosa de dos PCR en la que se detectan productos no deseados.

• Electroforesis A: se observa en todas las muestras una banda inferior a 100 pb (flecha) correspondiente a dímeros de cebadores.
• Electroforesis B: se observan múltiples bandas inespecíficas de diferentes tamaños en todas las muestras.

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