Ingeniería Genética y Regulación

Herramientas para la manipulación del DNA

Dr. David J. Mendoza Aguayo

djmendoza@iteso.mx
 Ingeniería Genética y Regulación
Herramientas clonación estándar

Plásmidos
Inserto
Enzimas de restricción
Ligasas
Fosfatasas alcalinas
Polimerasas
 Ingeniería Genética y Regulación
Inserto
Se refiere a la fracción nucleotídica de un ORF, mismo que será el gen de referencia en el
proceso de clonación.
 Ingeniería Genética y Regulación

polimerasa
La proteína referente al proceso de síntesis nucleotídica es sin lugar a dudad la polimerasa. Sin
esta “herramienta” sería imposible concebir a la ingeniería genética tal y como hoy la
conocemos. Tajantemente, de no haber “domesticado” a esta enzima, sería imposible llevar a
cabo procesos como la PCR.

Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Taq DNA Polymerase, recombinant (5 U/µL)
 Ingeniería Genética y Regulación
Polimerasas
 Ingeniería Genética y Regulación

holoenzimas
• σ70(RpoD) : "housekeeping sigma factor” o también llamado “primary sigma factor”, encargado
de la transcripción de los genes involucrados en el crecimiento celular.
• σ19 (FecI): factor sigma del citrato ferroso, regula el transporte de metales a la célula.
• σ24 (RpoE): Promueve la expresión de genes resistentes al estrés térmico.
• σ28 (RpoF): Promueve la expresión de flagelos en bacterias.
• σ38 (RpoS): Responsable de que la célula entre a fase estacionaria.
• σ54 (RpoN): Factor de limitación de nitrógeno.
 Ingeniería Genética y Regulación
Plásmidos
 Ingeniería Genética y Regulación
Plásmidos

Según el tipo de promotor:

• Vectores inducidos: Son activos en respuesta a un estímulo en específico.

• Vectores constitutivos: Vectores que se activan en cualquier circunstancia.

 Ingeniería Genética y Regulación
Plásmido inducible
X-Gal
 Ingeniería Genética y Regulación
Plásmido constitutivo
4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide hydrate
(MUG)
Promotores empleados en la expresión de proteínas heterólogas

Promotor Referencia
ADH1 Bennetzen and Hall 1982; Hitzenman et al. 1981

CUP 1 Karin et al. 1984

ENO Holland et al. 1981

GAL1/GAL10 Johnston and Davis 1984

GAP3 Holland and Holland 1980; Edens et al. 1984

HSP90 Finkelstein and Strausberg 1983

MFα1 Kurjan and Herskowitz 1982; Brake et al. 1984

PDC1 Schmitt et al. 1983; Kellermann et al. 1986

PGK Dobson et al. 1982; Tuite et al. 1982

PHO5 Meyhack et al. 1982; Kramer et al. 1984

PYK Burke et al. 1983

TRP1 Dobson et al. 1982

Modificado de Gellinssen et al. 1992

 Ingeniería Genética y Regulación
Enzimas de restricción

Proteínas que reconocen un grupo de secuencias nucleotídicas, siendo altamente especificas.

Estas enzimas actúan como “tijeras moleculares”. Sus secuencias en general son palindromes.

EcoRI (10 U/µL)

EcoRI
 Ingeniería Genética y Regulación
Enzimas de restricción
 Ingeniería Genética y Regulación
Ligasas

Estas enzimas tienen la capacidad de enlazar fragmentos nucleotídicos mediante enlaces

fosfodiéster. Utilizan al ATP como cofactor, es una molécula representativa del proceso de
replicación del DNA.

T4 DNA Ligase (5 U/µL)

 Ingeniería Genética y Regulación
Enlaces fosfodiéster
 Ingeniería Genética y Regulación
Fosfatasa alcalina

Estas proteínas son capaces de eliminar los grupos fosfatos resultantes de un proceso de
digestión. El propósito principal de esta “herramienta” se centra en el proceso de clonación,
donde su tarea es evitar la re-circulación de vectores, por medio de la eliminación del grupo
fosfato.

CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase), 20 U/µL

 Ingeniería Genética y Regulación
Fosforilasa
Estas proteínas son capaces de añadir grupos fosfatos. El propósito principal de esta
“herramienta” se centra en el proceso de clonación, donde su tarea es ayudar al proceso de
ligación.

T4 Polynucleotide Kinase (10 U/µL)

 Ingeniería Genética y Regulación
Fosforilación y desfosforilación
 Ingeniería Genética y Regulación
Clonación (estándar).
 Ingeniería Genética y Regulación
Clonación (TA).

Para lograr clonar con esta técnica es necesario amplificar tu DNA (inserto) empleando una taq
polimerasa, ya que estas enzimas tienen la cualidad de siempre añadir una adenina al extremo
3´de cada amplificación. Por otro lado, el plásmido, debe ser digerido dejando un corte romo
para posteriormente añadir un fragmento de timina (ddTTP) mediante el uso de una
transferasa.
 Ingeniería Genética y Regulación
Clonación (TA).

Este sistema aprovecha la interacción

adenina-timina para poder llevar a cabo el
proceso de clonación.
OVERLAPPING
 Ingeniería Genética y Regulación
Clonación (Gibson).

La técnica de Gibson consiste en amplificar el gen de interés añadiendo una secuencia de

hasta 15 pb adyacente al plásmido en el que se va a clonar. Además de esto existe todo un
arsenal de proteínas (polimerasas, ligasas, exonucleasas y endonlucleasas) que deben ser
consideradas para esta técnica.
 Ingeniería Genética y Regulación
Clonación (Gibson).
 Ingeniería Genética y Regulación
Clonación (Overlap extension PCR).

Para esta técnica es necesaria la amplificación del gen de interés flanqueado 5’ de los primers
con secuencias homologas al vector de interés (14-17 pb). Una vez amplificado el inserto, este
se considera un megaprimer para una segunda amplificación por PCR en donde el plásmido
será el molde para la integración del inserto. Este proceso no precisa el uso de ligasas, kinasas,
etc, el ingrediente más importante es la polimersa (este debe ser de alta fidelidad para evitar
errores de amplificación).
 Ingeniería Genética y Regulación
Clonación (Overlapping PCR).
 Ingeniería Genética y Regulación
Clonación (Overlap extension Dpn I).

Para esta técnica es necesaria la amplificación del gen de interés flanqueado 5’ de los primers
con secuencias homologas al vector de interés (14-17 pb), además de la amplificación del
plásmido de interés. Una vez amplificado el inserto y el plásmido estos se digieren por
separados con DpnI para su posterior transformación en el hospedero.
 Ingeniería Genética y Regulación
Clonación (Overlap extension Dpn I).
 Ingeniería Genética y Regulación
Transformación