Análisis del trascripto por PCR

RACE (amplificación rápida de los extremos 5’ y 3’ del ADNc)

Técnica que utiliza la alta sensibilidad de la PCR

Conocer la secuencia de longitud completa de un transcrito de ARN,

regiones 5′ y 3′ no traducidas. Siempre y cuando tengamos conocimiento de

una secuencia parcial, denominada “Etiqueta o Marcador de Secuencia

Expresada” o EST.

Identificar Sitios de transcripción

heterogéneos.

 Identificar transcripciones alternativas

de un gen.
 RLM-RACE (RNA ligase-mediated RACE)
GENERACER Kit de INVITROGEN

Estrategia: añadir fragmentos de secuencia conocida (secuencia molde

extra) en los extremos de todos los ADNc para luego amplificar los
extremos del ADNc de interés con cebadores específicos.

PASOS
1- Purificación ARNm pirofosfatasa (TAP)

2-Decapping

3- RT. Generación de una biblioteca ADNc (biblioteca GENERACER)

4- Amplificación por PCR

5-Secuenciación

6- Análisis de secuencias
 RLM-RACE (RNA ligase-mediated RACE)

3- RT. Generación de una biblioteca ADNc (biblioteca GENERACER)

A) LIGACIÓN DE UN oligoRNA de 44 pb (kit) al extremo 5´de

todos y cada uno de los RNAm de la muestra
GeneRacer™ RNA Oligo
5′-CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3′ .

GeneRacer RNAm
RNA Oligo

Ligasa
 RLM-RACE (RNA ligase-mediated RACE)
3- RT. Generación de una biblioteca ADNc (biblioteca GENERACER)

B) Transcripción reversa del RNA modificado mediante el uso de un

cebador oligo dT GenRacer que posee además del oligo dT una
secuencia de específica de 36 pb
GeneRacer™ Oligo dT Primer
5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)24-3′ (60 bases)

Generación de una biblioteca de cDNA RACE-ready donde todos los

cDNA tienen fragmentos de secuencia conocida de 44 y 36 pb hacia
el extremo 5´y 3´respectivamente
 4-AMPLIFICACIÓN POR PCR
Esquema de amplificación de los extremos 5’ y 3’:

EST del GEN 3´GT

TARGET (GT) 3´GT nested

5´GT
5´GT nested 3´
5´
1ª Biblioteca cDNA GenRacer 1ª 2ª Biblioteca cDNA GenRacer
amplificación Cebador 5´CL Cebador 3´CL
Por PCR
Cebador GenRacer 5´ Cebador GenRacer 3´

2ª Producto 1ª amplificación 5´ Producto 1ª amplificación 3´

amplificación Cebador 5´CL nested Cebador 3´CL nested
Por PCR Cebador GenRacer 3´ Nested
Cebador GenRacer 5´ Nested

5-CLONADO Y SECUENCIACIÓN DE BANDAS

 6- Análisis: mediante herramientas bioinformáticos

ENSAMBLE DE SECUENCIAS

EST

::::::::::::::::: ::::::::::::::
SECUENCIA 5´
SECUENCIA 3´
5´ 3´

(T)24
cDNA correspondiente al gen TARGET