Tema 4

El RNA como regulador de la expresión génica

-Edición de RNA.

-Control de la calidad de RNA.

-SnRNA y regulación de la trancripción. RNAs

sncRNAs y el mecanismo de silenciamiento génico. reguladores
El RNA antisentido en la regulación de la traducción.
lncRNAs y circRNA
Aplicaciones del RNA antisentido.

-RNomicas.
Bibliografía:
-Lodish 6ª Edn (y/o anteriores), y enlaces del Lodish en el Moodle de la asignatura.
-Artículos y presentación sobre microRNAs y otros RNA reguladores.
3.Edición de
RNA.
Edición de RNA

?
Edit RIA information
Edit RNA information

MFP
Edición de RNAs
Modificación de la secuencia del RNA.
• La edición del RNA puede ocurrir a través de: Inserción, Deleción o
por modificación nucleotídica
-Desaminación específica de sitio
• Formación de inosina: Forma más común de Edición de RNAs en
mamíferos. Desaminación de adenosina (edición A-->I).
• Formación de Uridina: Forma menos frecuente en mamíferos.
Desaminación de citidina (edición C-->U).

Pre-mRNA que
ADAR (1-3)
La desaminación
generan sustituciones:
de A -> Inosina
•receptor de glutamato
•receptor de serotonina 2C

Adeosina
Edición RNA
-Ins/del de U con gRNA
• Inserción de secuencias de poli U extensas y deleción de segmentos usando RNAs
guías. Edición de RNA en Tripanosoma. Se ha descubierto un gRNA ó RNA guía que
actúa de molde en esta edición

5´- G-C-A A-G-G-U-C-A -G C U A U C A premRNA no editado

gRNA
C G-U-U C-C A-G U C G A U A G U (RNA guia)
GG AU AA
AG GG 5´
G GA
Edición

5 4 3 2 1

G U U U U U C AA U G G U U U U U C U U A G C U A U C A

Mecanismo de edición de de RNAs en pre mRNAs de tripanosoma

Edición de RNA visión general. Cotranscripcional

Nuclear y
cotranscripcional
Edición del pre mRNA apo-B
Apo-B: codifica para dos formas alternativas de lipoproteína
sérica: Apolipoproteína B (Apo-B)

ApoB100 (500 kDa) se expresa en hepatocitos

ApoB48 ( 240kDa) se expresa en células epiteliales de intestino

ApoB-48 se corresponde con el extremo amino de apoB100

Hígado Intestino

CAA->UAA
CAA
5´ UAA 5´ UAA
An An

Apo-B100 ApoB48
N- -C

Se une a Se une a
lípidos receptores LDL Lodish
 Regulación post-transcripcional

Localización subcelular

Traducción (otro apartado específico de la asignatura)

Estabilidad / Degradación (núcleo y citoplasma)

Control de la calidad de RNA.

Localización subcelular

Transporte desde el núcleo (en azul) a zonas periféricas.

a-reconocimiento del RNA por proteínas específicas, formación de complejos RNPs
g-traducción local

Transporte de RNA
y control local de la síntesis de proteínas

Kindler et al (Annual Review of Cell and developmental Biology)

2005 vol21: 223-245
●Introducción
Estabilidad del mRNA
Viene determinada por secuencias presentes en el propio RNA, éstas pueden
ser reconocidas por factores específicos.

Elementos ricos en AU (ARE)

Secuencias

Regulación de la estabilidad del mRNA

a través de la región 3´-UTR

Proteínas

Proteínas Puf
Estabilidad del mRNA
En las regiones 3´-UTR de los RNAs se localizan secuencias que
determinan la estabilidad del mRNA

Elementos ricos en AU (AU-Rich Elements: ARE)

-Secuencias con un número variable de copias del pentámero AUUUA que se

localizan dentro de las regiones 3´-UTR.

-Regulan el acortamiento de la cola poli(A) a través de factores que se unen

específicamente a su secuencia.
Estabilidad del mRNA

Proteínas Puf

-Proteínas de unión al RNA a través del tetranucleótido UGUR (R= A o G) que se

localizan en el citoplasma.

-Causan una disminución de la expresión en todos los casos analizados hasta el

momento. Eliminación de la cola poli (A) en levaduras.
Control de la calidad del RNA

Tanto los mRNAs como los RNA no codificantes incorrectamente sintetizados son
eliminados de la célula gracias a varias alternativas de degradación de RNA.

Las principales razones de degradación de RNAs tienen que ver

con:
1-La tasa de recambio de RNA (mRNA turnover)

2-El procesamiento de RNA. Ej. los pre-RNA ribosómicos

3-Control de calidad (transcritos defectuosos)

 Degradación de mRNA

Los mRNAs son eliminados de la célula vía 3 rutas diferentes:

-degradación dependiente de desadenilación
-degradación independiente de desadenilación
-degradación dependiente de endorribonucleasas

Las tres vías comparten algunos factores

y también tienen componentes específicos.
Vías de DEGRADACIÓN de mRNAs
Visión general
Resumen Lodish

Vías dependientes
de desadenilación

Dcp(1 y 2)= subunidades de Decapping enzyme, elimina el extremo 5´-cap

 Degradación 5´3´ visión general
Disociación de factores 5´y 3
Pab1
RNA en proceso de traducción CBC 5´
3´ eIF4E 3´
5´

Pab1
CBC
eIF4E

Complejo
5´ Dcp
1
5´
3´ 2
Complejo
Degradación 5´->3 Lsm
3´ Complejo
Lsm

Dhh1 Pat1
Xrn1
Dhh1 Pat1

Degradación 5´->3´ del mRNA según Tharun y Parker, 2001; y Coller y Parker, 2004.
Degradación de mRNA dependiente de desadenilación

Es la principal ruta de degradación de mRNA en eucariotas

desadenilasas

Lsm actúa desde el

extremo 3´como Exonucleasas
moduladores de Dcp

DCP= Decapping protein

Degradación 3´->5´ del RNA
La degradación 3´->5´ depende de un complejo de exonucleasas, denominado
EXOSOMA (Mitchell et al., 1997).

El exosoma de levaduras, presente tanto en el núcleo como en el citoplasma, está compuesto por al
menos diez subunidades, todas ellas son exorribonucleasas con actividad 3´->5´ y/o proteínas de unión al
RNA (Mitchell et al., 1997; Mitchell y Tollervey 2000).

Otras rutas de degradación del mRNA

La degradación NMD (Nonsense Mediated mRNA Decay)
es propia de mRNAs que presentan mutaciones sin sentido o con defectos en el
proceso de corte-empalme que introducen en la ORF codones de paro
prematuros, impidiendo la síntesis de proteínas incompletas o potencialmente
deletéreas (Entes y Kulozik 1999; Mitchell y Tollervey, 2000; Gatfield et al., 2003).

NSD (NonStop mRNA Decay) y sigue la vía común 5´->3´.

Vías de DEGRADACIÓN de mRNAs
Visión general
Resumen Lodish

Vías dependientes
de desadenilación

Dcp(1 y 2)= subunidades de Decapping enzyme, elimina el extremo 5´-cap

 Complejo de degradación 3´->5´de RNAs: el EXOSOMA

Cap

Core ring

Base
catalítica

Rrp4p/Ski6
Modelo de cintas del exosoma humano Rrp4Dp
Rrp41p
Presente también en Archaea Diferentes
Rrp42p
Rrp43p asociaciones
9-11 subunidades diferentes
Rrp44p
formando anillo Rrp45p
Rrp46p
Mtr3p
Csl40/Ski4p
 Pontocerebellar Hypoplasia Type 1b

Fasken et al., enetics January 1, 2017 vol. 205 no. 1 221-237;

 En revisión

Diferentes
asociaciones

Papeles del exosoma en el núcleo

(procesamiento y degradación)
Papeles del exosoma en el citosol

Diferentes
asociaciones

Ski
complex
Exosome

Exosome

Exome
 Exosome-RNA Exosome (vesicle)
https://www.exosome-rna.com/

https://www.exosome-rna.com/the-role-of-exosomes-in-cancer-metastasis/

Exosomes are small membrane

vesicles with a size ranging from 40-
100nm. They can serve as functional
mediators in cell interaction leading to
cancer metastasis. Most studies of the
pathogenesis of metastasis focus on
genetic or phenotypic changes of the
cancer cell itself, however, there is
growing evidence that cancer cells
communicate with each other and the
surrounding stroma leading to
metastasis. ...
 Bicapa
lipídica

Contenido de un exosoma/ Content in an exosome

http://ac.els-cdn.com/S1044579X1730024X/1-s2.0-
S1044579X1730024X-main.pdf?_tid=769dd4ac-f906-11e6-b4d3-
00000aacb360&acdnat=1487771863_920b799cd4aa7de9c428667e55f
 Exome

The exome is the part of the genome formed by exons, the sequences which when
transcribed remain within the mature RNA after introns are removed by RNA splicing. It
consists of all DNA that is transcribed into mature RNA in cells of any type as distinct from
the transcriptome, which is the RNA that has been transcribed only in a specific cell
population. The exome of the human genome consists of roughly 180,000 exons
constituting about 1% of the total genome, or about 30 megabases of DNA.[

NHLBI Exome Sequencing Project (ESP)

Exome Variant Server
Home

The goal of the NHLBI GO Exome Sequencing Project (ESP) is to discover novel genes
and mechanisms contributing to heart, lung and blood disorders by pioneering the
application of next-generation sequencing of the protein coding regions of the human
genome across diverse, richly-phenotyped populations and to share these datasets and
findings with the scientific community to extend and enrich the diagnosis, management
and treatment of heart, lung and blood disorders.
Tema 4

El RNA como regulador de la expresión génica

-Edición de RNA.

-Control de la calidad de RNA.

-SnRNA y regulación de la trancripción. RNAs

sncRNAs y el mecanismo de silenciamiento génico. reguladores
El RNA antisentido en la regulación de la traducción.
lncRNAs y circRNA
Aplicaciones del RNA antisentido.

-RNomicas.
Bibliografía:
-Lodish 6ª Edn (y/o anteriores), y enlaces del Lodish en el Moodle de la asignatura.
-Artículos y presentación sobre microRNAs y otros RNA reguladores.
Pequeños RNAs y silenciamiento génico

Antecedentes
A comienzos de la década de los 90 descubrieron, en un amplio
número de especies, que “añadiendo” a las células pequeñas porciones de DNA se
podía anular la actividad de los genes seleccionados. Se inició el uso del RNA
antisentido para bloquear genes concretos.

RNA no traducido

Ej: maduración del tomate

Andrew Fire y Craig Mello llevaban a cabo experimentos en C. elegans
(inicialmente por separado), microinyectando pequeñas cantidades de RNA
monocatenario.

Ambas hebras con sentido

No deberían unirse al RNA celular al no ser complementarias,
Sin embargo funcionaban igual de bien que las copias antisentido

Pensaron que tendrían un contaminante de doble hebra.

Cuando inyectaron deliberadamente dsRNA a los gusanos

consiguieron “apagar” los genes diana
Explicación general
Procesamiento (corte) de doble
hebra por DICER en fragmentos de aprox. 20 bp

siRNA (short interfering RNA)

Hebra antisentido
siRNA se disocia

Complejo de silenciamiento RNA-inducido:

RISC (RNA Induced Silencing Complex)
Varias proteínas

El complejo se une a su RNA

complementario

Corte del RNA

Degradación del RNA
La revolución del RNAi

Clase de RNAs bicatenarios de 21-22 nucleótidos en longitud

Generados a partir de RNAs bi-hebra. Los si RNAs silencian los genes
Short Interfering RNAs promoviendo el corte de los RNAs con secuencias
SiRNAs exactamente complementarias
o reclutando proteínas inhibidoras de (o dirigiendo la modificación de)
DNAs con secuencias complementarias exactas.

microRNAs Una clase de 19-25 nucleótidos, los RNAs monohebra son codificados
(miRNAs) por los genomas de la mayor parte de de los organismos multicelulares estudiados.
Algunos están evolutivamente conservados y están regulados durante el desarrollo.
Silencian ciertos genes celulares en el estadío de la síntesis de proteínas.
 Otros

Tiny non-coding RNAs Una clase de RNAs de 20-22 nucleótidos, codificados por el
(tncRNAs) genoma de C. elegans. No están conservados evolutivamente,
Pequeños RNAs no codificantes pero algunos están regulados durante el desarrollo.

Small modulatory RNA RNA de doble hebra (dsRNA), identificado a inicios del 2004 en
(smRNA) ratón, que permite la expresión de genes neurona-específicos
únicamente en las neuronas adultas.

Desde esta fecha han proliferado diferentes tipos y nombres de pequeños RNAs

-Además también tenemos los lncRNAs (Long non-coding RNAs) con papel regulador
Ej en el silenciamiento de los genes del cromosoma X (Xist RNA)

-piRNAs (Pwi-interacting RNA) (Drosophila). Transposones.

Porcentage estimado de expresión (Palazzo et
al.,2015; Romano et al., 2017)
 miRNA
microRNA
NSCLC
non-small cell lung cancer Glosario de RNAs
piRNA reguladores
Piwi-interacting RNA

sncRNA
small non-coding RNA
snoRNA
small nucleolar RNA
snoRNP
small nucleolar ribonucleoprotein
sncRNA
small non-coding RNA
tRNA
transfer RNA
tRFs
transfer RNA-derived RNA fragments
tsRNA
tRNA-derived small RNAs
Efectos en la traducción

miRNA gene
(cellular)

RISC
 Detalle

La ribonucleasa Drosha
reconoce y corta el
Pri-miRNA

Pre-miRNA
Nature
Neurofibromin 1
is a miRNA
Target in Neurons
Maria Paschou &Epaminondas Doxakis
2012 PLOSone microRNAs complementarios a 3´-UTRs
Maria Paschou &Epaminondas Doxakis
2012 PLOSone
Tema 4

El RNA como regulador de la expresión génica

Edición de RNA.

Control de la calidad de RNA.

SnRNA y regulación de la trancripción.

sncRNAs y el mecanismo de silenciamiento génico. RNAs
El RNA antisentido en la regulación de la traducción. reguladores
Aplicaciones del RNA antisentido.

RNomicas.

Bibliografía:
-Lodish 6ª Edn (y/o anteriores), y enlaces del Lodish en el moodle de la asignatura.
-Artículos y presentación sobre microRNAs y otros RNA reguladores.
Efectos en la traducción

miRNA gene
(cellular)

RISC
dsRNA

Ej: Sistema de defensa ante genomas exógenos

virus RNA

En algunas especies hay

Drosophila
mamíferos un proceso de AMPLIFICACION
de miRNA

Antisense
Strand + RISC
Ej:
virus RNA C. elegans
y plantas
Amplificación

RdRP=RNA polimerasa
RNA dependiente
Rojo: hebra antisentido
Efecto en el estado de la cromatina

Ago1 (RISC) recluta

remodeladores
de cromatinaestado represivo

RITS, RNA Induced

Transcriptional
silencing
Proteinas Argonautas
(AGO)

Anatomy of RISC: how do small RNAs and chaperones

activate Argonaute proteins?
Kotaro Nakanishi
First published: 16 May 2016
https://doi.org/10.1002/wrna.1356
Aplicaciones de microRNAs
Control de la expresión génica
Investigación: silenciar genes específicos
Clínica y terapéutica

Ver enlace en el tema 4 del Moodle sobre aplicaciones en agricultura

microRNAs for crop Improvement.
Ali Raza , Sidra Charagh ,Benjamin Karikari, Rahat Sharif , Vivek Yadav, Muhammad Salman Mubarik, Madiha Habib, Yuhui Zhuang,
Chong Zhang, Hua Chen, Rajeev K. Varshney, Weijian Zhuang (2023) https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2023.107857 (Plant physiology and
Biochemistry)
 Transcriptomica
Proteomica
-OMICAS
Metabolómica
Rnomica

Análisis moleculares a gran escala

 Microarrays /DNA Chips

1-Implantar en una celda el oligonucleótido sintetizado

Link en el Moodle sobre hybridación

https://media.springernature.com/original/springerstatic/image/c
hp%3A10.1007%2F128_007/MediaObjects/ga_TCC007.gif
2-Síntesis in situ
 -Ómicas

Experimento con un Microarray de DNA para análisis de transcriptomas

Hay que comparar dos condiciones

Alternativa-ver animaciones del Lodish sobre construcción y aplicación de arrays de DNA

El analizador de imagen tiene el mapa de coordenadas
en el array.

Spot position MTP coord. ORF Gen

13A01 A1- A1 YAL001C TFC3
A-1
13A02 B1- A1 YBL001C
A-2
13A03 A1- A2 YAL002W VPS8
A-3
13A04 B1- A2 YBL002W HTB2
A-4
13A05 A1- A3 YAL003W EFB1
A-5
13A06 B1- A3 YBL003C HTA2
A-6
13A07 A1- A4 YAL004W
A-7
13A08 B1- A4 YBL004W
A-8
13A09 A1- A5 YAL005C SSA1
A-9
 Ejemplo de datos procesados en formato Excell.

ORF gene functional category description Ratio

YKL038W RGT1______(glucose) transport transcriptional regulator of glucose transporters 11,25798463

YOR377W ATF1______acetate ester biosynthesis alcohol acetyltransferase 3,632782638

YPR155C NCA2______ATP synthesis regulates Atp6p and Atp8p synthesis 4,425821408

YLR295C ATP14_____ATP synthesis F1F0-ATPase complex, subunit h 7,959753021

 RADIOACTIVOS FLUORESCENTES

DOWN-REGULATED UP-REGULATED
CM CM/CD CM CM/CD

HHT1 ATP4

OMS1
ENO1

PDC1 SPS4

ADH1 SKN7

TAT2
SUA7

Ejemplos de resultados
●Introducción

RNomicas: ejemplo aplicado a proteínas PUF

Regulación de la estabilidad del mRNA a

través de la región 3´-UTR

Proteínas Puf

-Proteínas de unión al RNA a través del tetranucleótido UGUR (R= A o G) que se

localizan en el citoplasma. Causan una disminución de los niveles de RNA.
Las proteínas PUF (Wickens M et al., 2002)
están presentes en D. melanogaster, C. elegans, S.
cerevisiae, etc
- Son proteínas de unión a regiones 3´-UTR

CSP1 CSP2

40 aminoácidos
Núcleo de aminoácidos
básicos y aromáticos

Región menos conservada

(Wickens M et al., 2002)

-S. cerevisiae: PUF1-PUF5.
R secuencia de unión: UGUR, los nucleótidos
flanqueantes dan la especificidad de unión.
R la expresión, la degradación del mRNA.
R aumenta la desadenilación o bien la eliminación
del extremo 5´-CAP, marcando al mRNA para
su degradación.

-¿Procesos en los que intervienen?

R PUF5: división celular (Wickens M et al., 2002)
Rnomicas-
aplicación para estudio de proteínas que unen RNA (RBP)

Extracto de
levaduras

Cromatografía

(Gerber AP et al., 2004)

Resultados

(Gerber AP et al., 2004)

-PUF1: mRNAs que codifican para proteínas asociadas a membrana.

-PUF2: mRNAs que codifican para proteínas asociadas a membrana.
-PUF3: mRNAs citoplasmáticos que codifican para proteínas
mitocondriales
-PUF4: mRNAs que codifican para factores de procesamiento de
RNA en el nucleolo.
-PUF5: mRNAs que codifican para modificadores de la cromatina