Caracterización de los factores que

determinan la expresión de un nuevo

elemento riboregulador (Sm84) en la vida
libre y simbiótica de los rizobios

Julián D’Ambrosio
 INTRODUCCIÓN
• Son α y β proteobacterias capaces de establecer
simbiosis con raíces de plantas leguminosas; se
Rizobios especializan en fijar nitrógeno atmosférico.

• Simbiosis entre Sinorhizobium meliloti y las raíces de

alfalfa: modelo de referencia para el estudio de estas
S. meliloti interacciones.

• Complejo intercambio de señales que conduce hacia

una diferenciación conjunta. Conocerlas puede llevar a
la manipulación y el mejoramiento de las simbiosis con
Interacción
propósitos prácticos.
 INTRODUCCIÓN

• Mecanismos de regulación poco explorados de la

expresión génica orquestados por moléculas de ARN.
Riboregulación

• Cerca de 400 sRNAs en el transcriptoma de S. meliloti

que se expresan bajo diferentes condiciones de
sRNAs crecimiento; pocos caracterizados (MmgR, Sm8).

• Detectado en S. meliloti, de origen ancestral y amplia

distribución en la clase de las alfa-proteobacterias que
Sm84 interaccionan con organismos superiores.
Distribución de
sm84 en alfa
proteobacterias
(recuadro rojo).
Comparación con la
distribución de
otros sRNAs de S.
meliloti (cuadros
grises).

Rankensemeier 2011
 OBJETIVOS

1) Construcción de una fusión transcripcional reportera entre el

promotor del sRNA Sm84 de S. meliloti y GFP. Vectores pTH1705
(Gm) y pTH1947 (Km).

2) Caracterización de los factores que determinan la expresión del

gen sm84 utilizando la fusión psm84::gfp (cultivos RDM).

3) Determinación exacta del sitio de inicio de la transcripción del

sRNA Sm84 en S. meliloti (5-RACE)

4) Caracterización bioinformática de la conservación y estructura

de la región promotora del gen sm84 (alineamientos múltiples y
análisis filogenético).
 METODOLOGÍA
Construcción de la fusión transcripcional psm84:gfp

Amplificación por PCR región promotora de Sm84 (KpnI

+ XhoI)

Clonado en pTH1705 y pTH1947 (KpnI + XhoI)

Transformación en E. coli S17-1

Conjugación biparental a S. meliloti 2011

Selección de clones simples recombinantes con el

plásmido integrado a nivel cromosomal
Locus sm84 en el cromosoma de S. meliloti 2011
Cowie et al 2006
 DESARROLLO
1er intento

~11 kbp
Electroforesis
Electroforesis preparativa
preparativa agarosa 1,5% -
agarosa 0,8% - inserto digerido
pTH1705 digerido (XhoI + KpnI)
(XhoI + KpnI)
~ 225 bp
 DESARROLLO
Screening (PCR) de colonias transformantes

Fwd (pSm84) + Rev (pSm84) > 225 bp Fwd (pSm84) + Rev (lacZmut1) > 1100 bp
 lacZmut

psm84Fw

Cowie et al 2006
 DESARROLLO
2do intento
Fwd (pSm84) + Rev (pSm84) > 225 bp

Screening (PCR) de colonias

transformantes

Cambios: Digestión con NotI

(sitio de corte en MCS) luego
de ligar. Sin desarrollo de
colonias
DESARROLLO
3er intento

Cambios:
 Tratamiento con fosfatasa alcalina
del vector (SAP)
 Ligación con extremos romos
(phusion DNApol)

Electroforesis preparativa agarosa 0,8%

- pTH1705 digerido (XhoI + KpnI) + SAP

Ligación a ciegas > transformación >

screening PCR negativo
 METODOLOGÍA
Cambio de estrategia

Construcción de la fusión
transcripcional psm84::gfp
• Plásmido pSRmig (gfp)
• Digestión simple KpnI
• Kit purificación agarosa
Análisis directo de la
expresión de Sm84 en
distintas condiciones de
cultivo
• Cultivos RDM (exp. y est.)
• Extracción RNA
• Northern Blot
• Cuantificación de sm84 por
RT-qPCR
Bahlawane et al 2008
Valverde 2008
 METODOLOGÍA
Elección de medios de cultivo

Estudio de la expresión de Sm84 en

P rizobios en fase exponencial y
estacionaria mediante qRT-PCR:

- Medio rico TY
- Medio definido RDM:
C TY N .. limitación en P
limitación en C
. limitación en N
. shock de estrés salino (0.3 M NaCl)

NaCl
 Cultivo en TY (A)
Pre-cultivo en TY
Cultivo en variantes de RDM

Estacionaria

DO A partir de
cultivos en fase
Exponencial exponencial:
+ NaCl 0.3M
durante 1 hora

tiempo
¡Muchas gracias!