Facultad de Ciencias Naturales Exactas y de la Educación

Departamento de Biología
Biología Molecular

UNIVERSIDAD Práctica: Extracción de ADN en hígado bovino Guía No: 03

DEL CAUCA

1. INTRODUCCIÓN

Los ácidos nucleicos son las macromoléculas de información primaria de la célula. Hay dos
clases de ácidos nucleicos, ácido desoxirribonucleico o DNA y ácido ribonucleico o RNA.
Estas moléculas especifican las secuencias de aminoácidos de todas las proteínas, incluyendo
las enzimas. Por lo tanto el repertorio de enzimas y proteínas estructurales determinan los
potenciales bioquímicos y fisiológicos.

Aproximadamente todo el DNA está contenido en el núcleo. El RNA mensajero (RNAm) se

sintetiza en el núcleo y lleva el código contenido en el DNA al citoplasma, específicamente a
los ribosomas. Los ribosomas están conformados por proteínas y un tipo diferente de RNA,
denominado RNA ribosomal (rRNA). La mayoría del RNA de las células es rRNA. Además,
una célula que es activa en síntesis de proteínas tiene una alta concentración de RNA
citoplásmico. Hay un tercer tipo de RNA involucrado en el proceso de síntesis de proteínas, el
RNA de transferencia (tRNA), el cual transporta los aminoácidos individuales a los ribosomas
y codifica el mensaje de los ácidos nucleicos contenidos en el mRNA.

Para extraer, caracterizar y cuantificar varias clases de RNA y DNA se han desarrollado
muchas metodologías. Los ácidos nucleicos a menudo se identifican mediante su espectro de
absorción específico. Un espectro de absorción es una curva que muestra cuanta luz absorbe
una sustancia a diferentes longitudes de onda. Los ácidos nucleicos absorben intensamente en
el intervalo de luz UV, como resultado de los dobles enlaces conjugados en las purinas y
pirimidinas. En esta práctica se ex tr a e ADN de hígado bovino y se comprueba por
determinación espectrofotométrica.

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2. OBJETIVOS

2.1 Aplicar metodología para la extracción de ADN en hígado bovino.

2.2 Comprobar por espectrofotometría la presencia de ADN.

Nota: Se recomienda durante el recorrido silencio y orden, e igualmente no manipular nada

sin la debida autorización del personal encargado.

3. CONSULTAS PRELIMINARES

3.1 ¿Cuál es el fundamento general de la técnica de extracción de ADN?

3.2 Investigar el uso adecuado de la microcentrífuga y espectrofotómetro.
3.3 ¿Cuál es la longitud de onda del ADN?
3.4 Definir fuerza centrífuga relativa o fuerza g (RFC).

4. MATERIALES

MATERIALES ESTUDIANTES CANTIDAD

Hígado de bovino 5 gramos
Bata de laboratorio Individual
Gorro Individual
Guantes Individual
Tapabocas Individual
Marcador Individual

MATERIALES LABORATORIO CANTIDAD

Vidrio de reloj 1
Pinza quirúrgica gruesa 1
Cuchilla con soporte 1
Nevera (icopor) con hielo 1
Gasa 1
Embudo 1
Vaso de precipitado 200 ml 1
Varilla de vidrio 4
Probeta 100 ml 1
Tubos cónicos 12
Tubos eppendorf 50
Pipetas 6
Pipeteadores 3
Recipiente para desechar puntas 3
Recipiente para residuos biológicos 1
Gradilla para tubos de centrifuga / tubos eppendorf 3 de c/u
Micropipetas 100 μl a 1000 μl y 20 μl a 200 μl 3 de c/u
Puntas para micropipetas 100 μl a 1000 μl y 20 μl a 200 μl 3 cajas de c/u

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 5. REACTIVOS

REACTIVOS* CANTIDAD
Amortiguador de citrato salino 1X (SSC) 300 ml
Solución de NaCl 2.6 M frio 300ml
Etanol 95% (frío) 300 ml
Etanol 70 % 50ml

6. EQUIPOS

EQUIPOS* CANTIDAD
Licuadora pre-enfriada 1
Centrífuga Sigma 3-30KS 1
Balanza analítica 2
Vortex 2

7. PROCEDIMIENTO

1. Pese 5 g de hígado de bovino previamente congelado.

2. Mezclar el tejido en una licuadora pre-enfriada en 50 ml de amortiguador de citrato salino
1x (SSC). Homogenice el tejido hasta cuando esté completamente macerado. No sobrepase
el homogenizado y permita que el contenido alcance una temperatura ambiente. El
procedimiento para la trituración requiere de 30 a 60 segundos.
3. Tomar 15 ml de la muestra en tubos cónicos.
4. Tomar 2 ml de la muestra y pasar a tubos eppendorf (4 por grupo); spin 14000 RCF por 0.5
min.
5. Descartar el sobrenadante.
6. Repetir 5 veces en el mismo tubo para colectar la mayor cantidad de ADN.
7. Resuspender el botón con 1, 5 ml de amortiguador de citrato salino.
8. Centrifugar a 4000 x g durante 15 minutos a 4°C.
9. Eliminar el sobrenadante
10. Resuspender el botón con 1, 5 ml de amortiguador de citrato salino.
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11. Centrifugar a 4000 x g durante 15 minutos a 4°C.
12. Añada 1, 5ml de solución salina 2.6 M, resuspender
13. Pasar la muestra a un tubo cónico (Repetir para obtener un total de 3 ml aprox).
*Es importante que la solución salina se mantenga fría (use un baño de hielo) y que la agitación
sea vigorosa. Resuspender.
14. Combine las cuatro extracciones anteriores, tomar muestras de 1,5 ml y centrifugar 20.000
x g durante 20 minutos. Este procedimiento permitirá que se forme un botón con las proteínas
insolubles.
15. Ponga cuidadosamente el sobrenadante en un tubo cónico y añada 2 ml de etanol al 95%
frío por las paredes del tubo.
16. Colecte el DNA mediante agitación cuidadosa de la mezcla.
17. Hacer la lectura en el espectrofotómetro.

Preparación de soluciones
 Citrato salino (dilución 1/10 de SSC): Disuelva 0,078 g de NaCl y 0.294 g de citrato de sodio
para un volumen final de 1litro de agua.
 Amortiguador de citrato salino (SSC) (20X): Es común preparar este amortiguador como una
solución patrón (stock) 20X, para diluirse antes de usarse a 2X, 1X o 0.1X. Para preparar una
solución patrón 20X, disuelva 175 g de NaCl y 88 g de citrato de sodio en 900 ml de agua.
Ajuste el pH a 7.0 con HCl 1N y complete a un volumen final de 1 litro.
 Para uso como SSC 1X, diluya una parte de la solución patrón 20X con 19 partes de agua
destilada. Para SSC 2X, diluya 1 parte de la solución patrón 20X con 9 partes de agua.

BIBLIOGRAFIA

 ADAMS, R.L.P., et al. 1986. The Biochemistry of the Nuclei Acids, 10th ed. Chapman and
Hall,London.
 BRITTEN,R.J. and D.E. KOHNE. 1968. Repeated sequences in DNA. Science 161: 529-540
HANAWALT, P.C. 1994. Transcription-coupled repair and human disease. Science 266: 1957-
1958.
 SEGEL, I.H. 1976. Biochemical calculations, 2nd ed., pp. 324-346. John Wiley, New York.
SLAYTER, E.M. 1970. Optical Methods in Biology, pp. 528-551. John Wiley.