FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO BIOQUÍMICA

Alumno: Código:

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Práctica 4: IDENTIFICACIÓN Y DETERMINACIÓIN DE PROPIEDADES FISICOQUIMICAS

DE LAS PROTEÍNAS.

1. INTRODUCCIÓN Y FUNDAMENTO TEORICO:

Las proteínas son compuestos químicos muy complejos que se encuentran en todas las células
vivas: en la sangre, en la leche, en los huevos y en toda clase de semillas y pólenes. Hay
ciertos elementos químicos que todas ellas poseen, pero los diversos tipos de proteínas los
contienen en diferentes cantidades. En todas se encuentran un alto porcentaje de nitrógeno,
así como de oxígeno, hidrógeno y carbono. En la mayor parte de ellas existe azufre, y en
algunas fósforo y hierro. Las proteínas son sustancias complejas, formadas por la unión de
sustancias más simples llamadas aminoácidos.

La organización estructural de una proteína (Figura 1) viene definida por cuatro niveles
denominados:

ESTRUCTURA PRIMARIA, es la secuencia de amino ácidos de la proteína. Nos indica qué

amino ácidos componen la cadena polipeptídica y el orden en que se encuentran. La función de
una proteína depende de su secuencia y de la forma que ésta adopte.

ESTRUCTURA SECUNDARIA, es la disposición de la secuencia de amino ácidos en el

espacio. Los amino ácidos, a medida que van siendo enlazados durante la síntesis de
proteínas y gracias a la capacidad de giro de sus enlaces, adquieren una disposición espacial
estable, la estructura secundaria. Existen dos tipos de estructura secundaria: la α(alfa)-hélice
que se forma al enrollarse helicoidalmente sobre sí misma la estructura primaria. Se debe a la
formación de enlaces de hidrógeno entre el -C=O de un aminoácido y el -NH- del cuarto amino
ácido que le sigue. En las láminas beta, los amino ácidos no forman una hélice sino una
cadena en forma de zigzag, denominada disposición en lámina plegada. En cualquier caso, las
interacciones se dan entre amino ácidos adyacentes.

ESTRUCTURA TERCIARIA, informa sobre la disposición de la estructura secundaria de un

polipéptido al plegarse sobre sí misma, Esta conformación se mantiene estable gracias a la
existencia de enlaces covalentes como los puentes disulfuro y las interacciones débiles entre
los radicales R de los aminoácidos lejanos

ESTRUCTURA CUATERNARIA, informa de la unión, mediante enlaces débiles (no covalentes)

de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria, para formar un complejo protéico.
Cada una de estas cadenas polipeptídicas recibe el nombre de protómero.

El número de protómeros varía desde dos como en la hexoquinasa, cuatro como en la

hemoglobina, o muchos como la cápsida del virus de la poliomielitis, que consta de 60
unidades proteicas.

Figura 1. Organización estructural de la proteína

2. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA

3. CONSULTAS PREVIAS

1. En qué se fundamenta el reactivo de Biuret? y ¿cómo reacciona el reactivo de Biuret

con las proteínas?
2. Cuál es la ecuación de Heenderson-Haselbach? Explique cada término asociado a
dicha ecuación.
3. Dibuje una estructura primaria (protein backbone) de una secuencia corta donde
identifique:
a) Extremo amino (amino terminal)
 b) Extremo carboxilo (carboxilo terminal)
c) Enlace peptídico
d) El grupo R (también conocido como residuo o aminoácido)*

*Es libre de escoger el aminoácido que desee.

4. METODOLOGIA

3.1 Materiales y equipos

Tabla 1. Listado de materiales y equipos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

Item Cantidad
Gradilla 1
Tubos de ensayo grande con tapa 4
Tubos de ensayo pequeños 12
Vasos de precipitado de 250mL 2
Vaso de precipitados de 150mL 2
Erlenmeyer de 150mL 1
Probeta graduada de 20mL 1
Pipeta graduada de 2mL 1
Pipeta graduada de 5mL 1
Pipeta graduada de 10mL 2
Propipeta 1
Termómetro 1
Pipeta pasteur 2
Varilla de vidrio 2
Embudo de Filtración 1
Espátula 1
Frasco lavador 1
Soporte universal 1
Pinza con nuez 1
Soporte para termómetro 1
Plancha de calentamiento 9 para todo el curso
Erlenmeyer de 250mL con tapa 6 para todo el curso
Frasco ámbar con tapa 1 para todo el curso
Macerador 4

3.2 Reactivos y sustancias:

Tabla 2. Listado de reactivos y sustancias necesarias para el desarrollo de la práctica por

pareja
 Item Cantidad
Huevo, Leche en polvo, caldo de pollo en polvo (o cubo),
pescado, carne molida, jamón y salchicha, jugo de papa, Traído por los
jugo de alguna fruta. estudiantes
Biuret 5 mL
Alcohol etílico comercial 3 mL
Solución de ácido acético al 10% 5 mL
Solución saturada de NaCI 2 mL
Solución de cloruro de calcio al 10% 2 mL
Solución de ácido acético 0.1 M 20 mL
Solución de acetato de sodio 0.1 M 20 mL
Solución de Hidróxido de sodio al 10% 4 mL
Hielo
Papel indicador universal de pH 5 cm
Agua 50 mL

5. PROCEDIMIENTO:

● Realice un orificio pequeño a un huevo y deposite la clara en un vaso de precipitado.

● Prepare 30 mL de una solución de clara de huevo y agua destilada en relación 1:3.

● Filtre la solución anterior usando un embudo y un pedazo de gasa doble. El filtrado que
se denominará solución "A" se usará para los experimentos siguientes.

● Para cada alimento sólido tome aproximadamente 10 gr y agregue 10 mL de agua

destilada en un macerador y macere el alimento hasta homogenizar el liquido con el
alimento o hasta obtener un liquido turbio. Pase la solución a un vaso de precipitado.
Rotule el vaso con el nombre del alimento.

● Para el caldo, solubilícelo en agua destilada según las recomendaciones del fabricante
en un vaso de precipitado y marque el vaso con el nombre del alimento

● Para la leche en polvo disuelva 6 g de leche en polvo descremada, con 50 mL de agua

destilada NOTA: añade el agua poco a poco para evitar que se formen grumos que
podrían dificultar la obtención de una solución homogénea. No debe calentar la leche
para disolverla.

I. Solubilidad

● Enumerar 3 tubos de ensayo pequeños y en cada uno mida y marque el volumen

correspondiente a 1 mL. Adicione en cada uno aproximadamente 1mL de solución A.

● Añada: al primero, 4 mL de agua fría, al segundo 4 mL de agua caliente y al tercero, 4

mL de solución de hidróxido de sodio al 10%. Tápelos, agítelos y anote en la bitácora
sus observaciones sobre la solubilidad de la albúmina de huevo y la temperatura del
agua empleada en cada tubo.
II. Pruebas colorimétricas.

● REACCIÓN DE BIURET. En un tubo de ensayo coloque 1mL de solución "A" y añada

unas cuantas gotas de solución de reactivo de Biuret hasta observar algún cambio en su
coloración.

● Repita el mismo procedimiento para los otros alimentos previamente preparados. Si

tiene dudas, pida indicaciones a su instructor sobre cómo realizar esta parte.

III. Pruebas con sales minerales (de metales).

● Tome 4 tubos y enumere. A cada uno de ellos agregue 2mL de solución "A" (Tabla 3).

● A los tubos 1 y 3 añádeles 2 gotas de ácido acético al 10% y agite (Tabla 3). Continúe
con el proceso monitoreando con el papel indicador, hasta que el medio sea ligeramente
ácido.

● A los tubos 2 y 4 no añada nada extra. Mida aproximadamente el pH con el papel

indicador. Es la solución acida o básica?

● A los tubos 1 y 2 añade 1mL de solución saturada de cloruro de sodio (Tabla 3) y a los
tubos 3 y 4, 2 gotas de solución de acetato de calcio al 10% (Tabla 3).

● Anote sus observaciones en la bitácora.

Tabla 3. Soluciones y cantidades a agregar en cada tubo

Solución Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
Solución A 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
Ácido acético 10% 2 Gotas 2 Gotas
Cloruro de sodio saturado 1 mL 1 mL
Cloruro de calcio 10% 2 gotas 2 gotas

IV. Efecto del calor

● En un tubo de ensayo adiciona 3mL de solución "A".

● Coloca un termómetro en el baño de agua y caliente ligeramente el vaso. Asegúrese

que el termómetro no toque la base del vaso pues no medirá adecuadamente la
temperatura del agua.

● Observe y registre en su bitácora a qué temperatura empezó a coagularse

(precipitación) la proteína.

V. Efecto del alcohol etílico

 ● A un tubo de ensayo que contenga 1 mL de solución "A" agregue 2 mL de alcohol etílico
comercial, anote sus observaciones en la bitácora.

VI. Determinación del punto isoeléctrico.

Preparación de una serie de tubos con solución amortiguadora de acetatos.

● Coloca en una gradilla 6 tubos de ensayo rotulados con números consecutivos.

● Adiciona a cada tubo las soluciones ácido acético y acetato de sodio que indica la Tabla
4. El volumen final de cada tubo deberá ser de 5mL.

Tabla 4. Tubos con diferentes soluciones amortiguadoras

TUBO Acido acético 0.1 M Acetato de sodio 0.1 M

1 5 mL --

2 4 mL 1 mL

3 3 mL 2 mL

4 2 mL 3 mL

5 1 mL 4 mL

6 -- 5 mL

Evaluación del punto isoeléctrico de la leche

• En un tubo de ensayo de 16 x 150 mm adicione 2 mL de la leche rehidratada preparada

inicialmente, y añada 8 mL de agua destilada. Agite cuidadosamente por inversión – esta
solución se denominará Leche diluida.

• Añada 1 mL de la leche diluida a cada tubo de solución amortiguadora que preparó

anterioremente – Tubos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 con las soluciones amortiguadoras

• Mezcle cuidadosamente por inversión todos los tubos y deje reposar por espacio de 10
minutos. Observe y anote el aspecto de las mezclas preparadas en la bitácora indicando en
cuales tubos se observa precipitación

6. RESULTADOS

Para cada experimento realizado, indique: 1) que se está evaluando con este, 2) incluya los
resultados a partir de un registro fotográfico o en tablas, 3) las leyendas de cada imagen o
tabla, y 4) descripción de los resultados presentados
 7. ANALISIS DE RESULTADOS

Para cada experimento explique sus resultados según lo visto en clase y con ayuda de las
siguientes preguntas. Asegúrese de incluir las respuestas

I. Solubilidad

● Cuál es el efecto del NAOH en las proteínas?

● Qué proteína está presente en mayor proporción en la clara de huevo y cuál es su

secuencia de amino ácidos?

● Cual es la temperatura óptima de esta proteína?

● Cómo puede explicar los resultados obtenidos a partir de la información anterior?

II. Pruebas colorimétricas.

● ¿Cómo reacciona el reactivo de Biuret con las proteínas?

● ¿Cuáles de los alimentos analizados poseen proteínas?

● ¿Cómo usaría el reactivo de Biuret para cuantificar la cantidad de proteína contenida

en una muestra?

III. Pruebas con sales minerales (de metales).

● ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la proteína que se encuentra en mayor proporción en

la clara de huevo??

● ¿Qué es el fenómeno de precipitación salina o exsalado?

● Teniendo en cuenta la información anterior explique los resultados obtenidos.

IV. Efecto del calor

● ¿Qué es la desnaturalización de proteínas? Y ¿Por qué ocurre?

● A partir de la temperatura óptima de la proteína de la clara de huevo, cómo puede

explicar los resultados obtenidos?

● Qué relación tiene la desnaturalización de proteínas con la práctica culinaria común de

preparar huevos hervidos?

V. Efecto del alcohol etílico

● ¿Qué características fisicoquímicas posee el alcohol etílico?

 ● ¿Cuál es el efecto de los solventes en la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria
de las proteínas?

● ¿Cómo explica los resultados obtendiso en la práctica?

VI. Determinación del punto isoeléctrico.

● Haciendo uso de la ecuación de Heenderson-Haselbach calcula el pH de cada tubo, e

incluye esta información en la leyenda de la imagen o en la información de la tabla
donde muestra los resultados experimentales.

● Qué es el punto isoeléctrico de una proteína y por qué en este punto se puede observar
precipitación de las mismas?

● Cuál es la proteína principal componente de la leche? Investigue su punto isoeléctrico y

discute si está de acuerdo con lo que encontraste en esta práctica y por qué

● ¿Qué aplicación tiene el conocer el punto isoeléctrico de una proteína?

7. BIBLIOGRAFIA.
• BOATELLA RIERA, Josep. Química y Bioquímica de los alimentos II. Barcelona: Edicions
Univers. Barcelona, 2004. ISBN: 978-84-475-2836-7.
• ALBERTS, B. y col. Biología Molecular de la célula. España: Edit. Omega, 2004.
• BAYNES, John W.; DOMINICZAK, Marek H. Bioquímica Médica. España: Edit. Elsevier,
2007. ISBN: 978-848-086-730-6.
• BERG, Jeremy Mark; STRYER, Lubert; TYMOCZKO, John; MARACULLA, José M.
Bioquímica. Edit. Reverte, 2008. ISBN: 978-84-291-7602-5