ÁNGELA FERNÁNDEZGUTIÉRREZ

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

1. OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

El objetivo de la práctica es realizar diferentes procedimientos de extracción y purificación

de ADN para obtener ADN plasmídico purificado el cúal utilizaremos a lo largo del curso
para realizar diferentes técnicas de biología molecular.

2. MATERIALES USADOS
PRÁCTICA 1

- TRIS - ACETATO DE SODIO - PAPEL DE PESADA Y ESPÁTULAS

- EDTA - ETANOL 100% - VASOS DE PRECIPITADOS

- SDS - AGUA DESTILADA - PROBETAS

- NAOH - BALANZAS - HCL 5M Y NAOH 5M PARA AJUSTAR EL PH

- PHMETRO - PIPETAS PASTEUR - 6 BOTES DE CRISTAL TIPO PYREX

PRÁCTICA 2

-TAMPÓN TAE

- AGAROSA

- RED SAFE 20000 X (AGENTE INTERCALANTE)

- EQUIPO DE ELECTROFORESIS (CAMA, CUBETA Y FUENTE DE ALIMENTACIÓN)

- TUBO EPPENDORF

- CENTRIFUGADORA

- VORTEX

- MICROPIPETA

- TAMPÓN DE LISIS ALCALINA

- ACETATO SÓDICO 2,5 M

- FENOL

- CLOROFORMO

- ISOPROPANOL 100%

- ETANOL 70%

- PUNTAS DE MICROPIPETA

- MUESTRAS DE ADN DE LA MUESTRA ANTERIOR

- PROBETAS

- MARCADOR DE PESO MOLECULAR 500pb-10Kb

PRÁCTICA 3

2
-TUBO EPPENDORF

- CENTRIFUGADORA

- VORTEX

- MICROPIPETA

- TUBOS COLECTORES

- SOLUCIÓN HBC

- DNA WASH BUFFER

- ELUTION BUFFER

- EQUIPO DE ELECTROFORESIS

- PUNTAS DE MICROPIPETA

- PROBETAS

- MUESTRAS DE ADN DE LA PRUEBA ANTERIOR

PRÁCTICA 4

-MUESTRAS DE ADN DE LA PRÁCTICA ANTERIOR

-TAMPÓN TAE

-AGUA DESTILADA

-AGAROSA

-PROBETAS (50ML Y 250ML)

-MARCADOR DE PESO MOLECULAR 500 pb- 10kb

-REDSAFE 20000 X (AGENTE INTERCALANTE)

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- 6X DNA LOADING BUFFER

- EQUIPO DE ELECTROFORESIS

-TRANSILUMINADOR

-TUBOS EPPENDORF

-MICROPIPETAS (P20)

-PUNTAS DE MICROPIPETA

3. PROCEDIMIENTOS

PRÁCTICA 1

100 ml de acetato sódico 2.5M

Sois 27: nos organizaremos en 14 grupos (13 parejas y una persona sola). Cada grupo
preparará uno de los siguientes reactivos stock, que serán los que se utilicen en
sucesivas prácticas.

Las parejas prepararéis los reactivos del 1 al 5 (en nuestro caso de acetato sódico). Antes
de prepararlos, tendréis que hacer los cálculos de los gramos que es necesario pesar de
cada reactivo para preparar las siguientes soluciones. IMPORTANTE: disolver los gramos de
cada reactivo en un volumen de agua destilada correspondiente a la mitad del volumen
final.

Una vez preparadas, las soluciones de Tris, EDTA y acetato de sodio se han de esterilizar en
autoclave a 120°C y 1 bar (= 1 Kg/cm2) de presión durante 20 minutos.

ATENCIÓN: Comprobar que el autoclave tiene agua en el fondo.

En caso contrario, añadir agua

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destilada hasta la rejilla del fondo de la máquina. Asimismo, comprobar que las salidas de
agua y de aire se encuentran cerradas. Si no se toman estas precauciones podría quemarse
la autoclave.

ATENCIÓN: Como norma general, no se deben autoclavar soluciones concentradas de

ácidos (clorhídrico, sulfúrico) o álcalis (NaOH). Como es obvio, estas soluciones son
"estériles" per se. Además, pueden dañar la estructura de acero del autoclave. Tampoco es
necesario autoclavar el SDS ni el etanol.

PRÁCTICA 2 extracción y purificación de ADN plasmídico con solventes orgánicos

Antes de comenzar es necesario preparar las soluciones de trabajo a partir de las

soluciones stock.(En nuestro caso acetato sódico).

a) Tampón de lisis alcalina (10 ml)

NaOH 0.2M

SDS 1%

b) Tampón TE (10 ml)

Tris 10 mM pH8

EDTA 1mM pH 8

Método 1: extracción y purificación de ADN plasmídico con solventes orgánicos

1000 pl

1. En un tubo Eppendorf, añadir 1 ml del cultivo bacteriano y centrifugar 1 minuto a 13000

rpm. Tras la centrifugación, descartar el sobrenadante y repetir el proceso 2 veces más de
forma que, en total, tengamos las células de 3 ml de cultivo.

2. Resuspender todo el pellet de células en 100 ul de tampón TE. Para ello, ayudarse del
vortex o de la micropipeta (pipeteando hacia arriba y hacia abajo para disgregar todo el
pellet de células). IMPORTANTE que todo el pellet se haya disgregado antes de seguir con el
siguiente paso. Asegurarse de que no queden grumos.

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3. Añadir 200 ul del tampón de lisis alcalina recién preparado. Cerrar el tubo y mezclar el
contenido invirtiendo el tubo suavemente dos o tres veces. Dejar 5 minutos a temperatura
ambiente.

4. Añadir 300 ul de la solución de acetato sódico 2.5 M. Cerrar el tubo y agitar suavemente

invirtiendo el tubo varias veces. Dejar el tubo 5 minutos en la nevera a 4°C.

5. Centrifugar 10 min a y 13000 rpm.

6. Recuperar el sobrenadante y transferirlo a un tubo Eppendorf nuevo.

7. Añadir un volumen de fenol/cloroformo (aproximadamente 500 ul, 1/2 volumen de fenol

y 1/2 de cloroformo). Mezclar vigorosamente con el vortex y centrifugar 5 minutos a

13000 гр.

8. Tras la centrifugación se habrán formado dos fases. Transferir el sobrenadante (fase

acuosa superior) a un nuevo tubo Eppendorf nuevo. En este paso hay que tener mucho

CUIDADO DE NO COGER NADA de la fase orgánica inferior.

9. Añadir un volumen de cloroformo (aproximadamente 500 pl). Mezclar bien en el vortex y

centrifugar 5 minutos a 13000 rpm. Tras la centrifugación se habrán formado dos fases.

Transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf nuevo. En este paso hay que tener mucho

CUIDADO DE NO COGER NADA de la fase orgánica inferior.

10. Añadir un volumen de isopropanol 100% (aproximadamente 500 pl). Mezclar bien en el
vortex. Centrifugar 10 minutos a 13000 rpm.

11. Eliminar el sobrenadante e invertir el tubo para drenar la mayor cantidad posible de

isopropanol.

12. Añadir 1 ml de etanol al 70%. Mezclar bien con la pipeta separando el pellet del fondo
del tubo. Volver a centrifugar 10 minutos 13000 rpm.

13. Eliminar el sobrenadante y secar el pellet con el tubo abierto a temperatura ambiente.

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14. Resuspender el pellet en 30 ul de tampón TE conteniendo 20 g/ml de ARNasa. Rotular el
tubo y almacenar a -20°C.

PRÁCTICA 3 extracción y purificación de ADN plasmídico mediante cromatografía de

adsorción (kit comercial E.Z.N.A Plasmid DNA I)

1. En un tubo Eppendorf, añadir 1 ml del cultivo bacteriano y centrifugar 1 minuto a 13000

2.

rpm. Tras la centrifugación, descartar el sobrenadante y repetir el proceso 2 veces más de

forma que, en total, tengamos las células de 3 ml de cultivo.

Resuspender todo el pellet de células en 250 ul de tampón solución | (contiene ARNasa).

Para ello, ayudarse del vortex o de la micropipeta (pipeteando hacia arriba y hacia abajo
para disgregar todo el pellet de células), IMPORTANTE que todo el pellet se haya
disgregado antes de seguir con el siguiente paso.

3. Añadir 250 ul de solución Il. Cerrar el tubo y mezclar el contenido invirtiendo el tubo
suavemente varias veces hasta observar un lisado claro. Dejar el tubo a temperatura

ambiente durante 2-3 minutos

4. Añadir 350 ul de solución III. Cerrar el tubo y mezclar el contenido invirtiendo el tubo
suavemente varias veces hasta observar un precipitado blanco.

5. Centrifugar 10 minutos a 13000 rpm. Mientras tanto, preparar las columnas de

adsorción.

Para ello, introduce una columna en uno de los tubos colectores que viene con el kit.

6. Tras la centrifugación, se observará un pellet blanco correspondiente a los restos

celulares y un sobrenadante donde está el ADN plasmídico. Transferir el sobrenadante (con

CUIDADO DE NO COGER NADA del pellet blanco) a la columna.

7. Centrifugar 1 minuto a 13000 rpm.

7
8. Quitar la columna del tubo colector, tirar el contenido del tubo colector y volver a
introducir la columna en el tubo colector vacío.

9. Añadir 500 ul de solución HBC.

10. Centrifugar 1 minuto a 13000 rpm.

11. Quitar la columna del tubo colector, tirar el contenido del tubo colector y volver a
introducir la columna en el tubo colector vacío.

12. Añadir 700 ul de DNA Wash Buffer.

13. Centrifugar 1 minuto a 13000 rpm.

14. Quitar la columna del tubo colector, tirar el contenido del tubo colector y volver a
introducir la columna en el tubo colector vacío.

15. Centrifugar 2 minutos a 13000 rpm para secar la columna y eliminar los restos de DNA

Wash Buffer.

16. Transferir la columna a un tubo Eppendorf nuevo.

17. Añadir 30 ul de Elution Buffer al centro de la membrana blanca (IMPORTANTE que el

elution buffer entre en contacto con la membrana. Para ello hay que evitar que el líquido
añadido se quede por las paredes de la columna).

18. Incubar 1-2 minutos a temperatura ambiente.

19. Centrifugar 1 minuto a 13000 rpm. Ahora en el tubo Eppendorf tendremos el ADN
purificado.

20. Rotular el tubo Eppendorf con el ADN y almacenar a -20°C.

El resultado de ambas purificaciones se observará en otra práctica mediante una

electroforesis en gel de agarosa.

PRÁCTICA 4

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Para llevar a cabo esta práctica, realizaremos 5 geles de agarosa para toda la clase, por lo
que nos dividiremos en 5 grandes grupos.

1. Preparación del gel de agarosa

Para preparar el gel de agarosa, cada grupo realizará lo siguiente:

Diluir el tampón TAE 10X hasta 1X en un volumen final de 250 ml.

- Pesar la agarosa correspondiente para preparar un gel de 50 o 75 ml (dependiendo del

molde) al 0,7% de agarosa.

Añadir la agarosa pesada a los 50-75 ml de tampón TAE 1X.

Llevamos la solución de agarosa al 0,7% en tampón TAE 1X a ebullición calentando varios

minutos en el microondas hasta que la agarosa se haya disuelto por completo. Una vez
disuelta, dejamos enfriar hasta unos 55°C.

- Añadimos los ul necesarios de agente intercalante (RedSafe) 20000X hasta una

concentración final de 1X y agitamos suavemente para que se mezcle bien con toda la
disolución.

- Vertemos la solución de agarosa en una cama.

- Hacemos los pocillos donde cargaremos las muestras con un peine.

- Dejamos solidificar el gel.

2. Preparaciones de las muestras de ADN

Mientras solidifica el gel, cada uno de forma individual preparará sus dos muestras (una de
cada método de extracción de la práctica anterior).Para ello:

-Rotulamos 2 tubos eppendorf (uno para cada una de las muestras) como “método 1” y
“método 2” a cada tubo añadimos:

-2 ul del ADN correspondiente.

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-3 ul de agua destilada. Volumen total: 6 ul

-1 ul de 6X DNA Loading Buffer.

3. Electroforesis

Añadimos tampón TAE 1X en la cubeta de electroforesis y sumergimos el gel en él.

IMPORTANTE: asegurarse de que el tampón cubre completamente el gel de agarosa.

Retiramos los peines, quedando los pocillos al descubierto.

Con la micropipeta, cargamos los pocillos con los 6ul las muestras de ADN que hemos
preparado. IMPORTANTE: cargar la muestra lentamente dentro del pocillo evitando que se
salga o que suba por la aparición de burbujas.

Una vez cargadas todas las muestras, tapamos la cubeta y conectamos la fuente de
alimentación a los electrodos. Ajustamos la intensidad de corriente y el tiempo de
electroforesis: 120 V durante 45 minutos aproximadamente.

4. Revelado

Sacamos el gel de agarosa de la cubeta y lo colocamos sobre el transiluminador.

Encendemos la lámpara UV y observamos las bandas correspondientes al ADN (haced una

foto)

4.RESULTADOS

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En el gel podemos observar que en el método 1 el ADN ha recorrido menos trayecto al
haber más cantidad y ser el fragmento de ADN (Plásmido) más largo, mientras que el el
método 2 el ADN ha avanzado más al ser más corto y tener menos cantidad, ya que
recordemos que la agarosa tiene una estructura porosa y cuanto mayor cantidad de

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plásmido y más grande sea la molécula de ADN más lento y menor trayectoria recorrerá. A
partir del marcador de peso molecular podremos medir la cantidad de pares de bases que
contiene el fragmento de ADN.

5.CONCLUSIONES
A partir de los resultados podemos concluir que en el método 2 el ADN se degrada
mientras que en el método 1 no, también podemos observar cómo obtenemos mayor
cantidad de ADN con el método 1 que con el método dos al haberse degradado este, con lo
cual también podemos afirmar que el ADN del método 2 es de peor calidad que el ADN del
método 1 entre los problemas que han podido causar su degradación se encuentran entre
otros: Se cargó demasiada cantidad de ADN, el ADN contenía demasiadas sales, el adn
estaba contaminado con proteína, las moléculas de ADN de pequeño tamaño se
difundieron durante la tinción, el ADN se ha desnaturalizado, la contaminación con
nucleasas o para un ADN superenrollado había poca cantidad.

6.PROPUESTAS DE MEJORA
Para evitar la degradación del ADN durante la electroforesis en gel de agarosa, es
importante seguir algunas prácticas clave:

1. Manejo cuidadoso del ADN: Utiliza puntas de pipeta estériles, trabaja en una superficie
limpia y utiliza guantes para evitar la contaminación con nucleasas que podrían degradar el
ADN.

2. Uso de tampones adecuados:Utiliza tampones y soluciones libres de nucleasas para la

preparación del ADN y la electroforesis.

3. Evitar la exposición a la luz y al calor: Mantén las muestras de ADN en condiciones

apropiadas, lejos de la luz y el calor excesivos, ya que estos factores pueden contribuir a la
degradación del ADN.

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4. Minimizar el tiempo de exposición: Trata de cargar las muestras de ADN rápidamente en
el gel de agarosa y evita la exposición prolongada a condiciones que puedan favorecer la
degradación.

Siguiendo estas prácticas, puedes minimizar la degradación del ADN durante la

electroforesis en gel de agarosa.

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