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UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE MXICO

FACULTAD DE QUMICA
LABORATORIO DE GENTICA
PRCTICA No. 3
AISLAMIENTO DE ADN GENMICO A PARTIR DE SANGRE VENOSA
OBJETIVO:
-

El alumno aprender los fundamentos tericos para realizar la


extraccin de ADN.
El alumno realizar la extraccin de su propio ADN a partir de sangre
venosa.

MATERIAL:
-

Tubos vacutainer con EDTA (tapn morado)


Jeringa de 3 ml.
Tubos de centrifuga de polipropileno de 15ml con tapn de rosca.
Pipetas Pasteur.
Vortex.
Centrifuga.
Guantes de latex.

REACTIVOS:
(Grado Biologa Molecular)
- MgCl2
- EDTA
- Tris (detergente)
- SDS (dodecil sulfato de sodio)
- Isopropanol
- Etanol
- Acetato de amonio.

METODOLOGA:
i.- OBTENCIN DE LA MUESTRA.
1.- Extraer en tubo vacutainer 3 ml de sangre venosa perifrica.
2.- Homogenizar suavemente la muestra.

II.- LISIS CELULAR.


1.- A un tubo estril con capacidad de 15 ml adicionar 9 ml de solucin de lisis
RCB (5mM de MgCl2 , 1mM EDTA).
2.- Transferir los 3 ml de sangre al tubo anterior. Invertir para mezclar e incubar
por 10 min a temperatura ambiente. Invertir al menos una vez durante la
incubacin.
3.- Centrifugar por 10 min a 2,000 rpm. Retirar el sobrenadante cuidando de no
tocar el botn blanco.
4.- Mezclar vigorosamente en vortex para resuspender los leucocitos en el
sobrenandante residual. Esto facilita la lisis celular descrita en el siguiente
punto.
5.- Adicionar 3 ml de la solucin de lisis celular (10mM de Tris pH 7.5, 1 mM
EDTA, 1% SDS) al tubo que contiene las clulas resuspendidas y pipetear
varias veces para lisar las clulas. Usualmente ninguna incubacin es
requerida, sin embargo, si grumos celulares son visibles despus de mezclar,
incubar a 37C o a temperatura ambiente hasta que la solucin sea
homognea. Las muestras son estables en esta solucin por al menos 18
meses a temperatura ambiente.
III.- TRATAMIENTO CON RNAsa (OPCIONAL)
1.- Adicionar al lisado celular 15 microlitros de solucin de RNAsa (10 mg/ml de
RNAsa (Sigma) en agua bidestilada)
2.- Mezclar la muestra invirtiendo el tubo 25 veces e incubar a 37C por 15 min.

IV.- PRECIPITACIN DE PROTENAS.


1.- Adicionar 1 ml de la solucin de pp de protenas (7.5M de acetato de
amonio).
2.- Mezclar vigorosamente a alta velocidad (vortex) por 20 seg para
homogenizar con el lisado celular.
3.- Centrifugar a 2,000rpm por 10 min. Las protenas precipitadas debern
formar un botn color caf obscuro.

V.- PRECIPITACIN DEL ADN.


1.- Retirar el sobrenadante que contiene al ADN, cuidando de no tocar el botn
de protenas, y depositarlo en un tubo limpio (estril) que contenga 3 ml de
isopropanol.
2.- Mezclar la muestra por inversin suave 50 veces hasta que las fibras de
ADN formen un conglomerado.
3.- Centrifugar a 2,000rpm por 3 minutos. El ADN deber visualizarse como un
botn blanco.
4.- Retirar el sobrenadante y secar el tubo en un papel absorbente. Adicionar 3
ml de etanol al 70%. Invertir el tubo suavemente para lavar el botn de ADN.
5.- Centrifugar a 2,000rpm por 2 minutos. Retirar cuidadosamente el etanol. El
botn puede perderse si el tubo se agita al retirar el etanol.
6.- Secar el tubo en papel absorbente y dejar secar la muestra a temperatura
ambiente por 15 minutos o preferentemente a 65C hasta ver el botn
transparente.

VI.- HIDRATACIN DEL ADN.


1.- Adicionar 250 microlitros de solucin de hidratacin (10mM de Tris pH 7.5, 1
mM de EDTA pH 8:0).
2.- Dejar rehidratando el ADN toda la noche a temperatura ambiente. Mover
peridicamente el tubo para dispersar el ADN..
3.- Almacenar de 2 a 8C.
VII.DETERMINACIN
CONCENTRACIN DE ADN.

ESPECTROFOTOMTRICA

DE

LA

1.- Realizar una dilucin 1/100 de la muestra de ADN a cuantificar.


2.- Determinar la absorbancia de esta solucin a 260 y 280 nm. La lectura a
260 nm permite calcular la concentracin del ADN en la muestra teniendo en
cuenta que 1 unidad de densidad ptica (OD) corresponde a 50 g/ml para
ADN de doble cadena. La proporcin de la lectura a 280 nm (OD 260/OD280) da
un estimado de pureza de la muestra de ADN. Preparaciones puras del ADN
tienen valores > 1.8. Si hay contaminacin con protenas el valor de la relacin
(OD260/OD280) es significativamente menor que 1.8 y no es posible determinar
con exactitud la concentracin de ADN de la muestra.
Concentracin de ADN = A X factor de dilucin X 50

SOLUCIONES PRCTICA DE GENTICA GENERAL

1.- Solucin de lisis RCB (5mM de MgCl2 , 1mM EDTA).


300 ml/ grupo
2.- Solucin de lisis celular (10mM de Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 1% SDS)
60 ml/grupo
3.- Solucin de pp de protenas (7.5M de acetato de amonio).
25 ml/grupo
4.- Solucin

de hidratacin (10mM de Tris pH 7.5, 1 mM de EDTA pH 8:0).

50 ml/grupo
5.-Etanol
6.-Isopropanol