BIOLOGÍA GENERAL

Guía de Práctica N° 4:

Aislamiento de ADN

Integrantes:
NRC : …………………………….. 1.- …………………………………………………………………………….
Docente : ………………………………………………………. 2.- …………………………………………………………………………….
Fecha : ……………………… Duración: 90 min 3.- …………………………………………………………………………….
Tipo de práctica: Individual ( ) Grupal ( ) 4.- …………………………………………………………………………….
5.- …………………………………………………………………………….

Instrucciones: Lee con atentamente esta guía, sigue los pasos que contiene, así como las
instrucciones del docente, realiza tu práctica con seguridad y orden.

1. PROPÓSITO:
Aislar y reconocer cualitativamente la presencia ADN a partir de muestras de tejidos
animales.
1. FUNDAMENTO TEÓRICO
El ADN se encuentra en el interior del núcleo celular, disperso y muy replegado, unido a
proteínas formando la cromatina. Para extraerlo es necesario homogeneizar el tejido y
romper las células para separar los núcleos y romper éste para liberar el ADN, separarlo
de las proteínas y precipitarlo para extraerlo de la solución. Aparecerá como un
agregado de fibras blanquecinas que se adhieren a la varilla de vidrio.
Para la extracción del ADN del núcleo de las células, es necesario homogenizar las
muestras en solución cloruro sódico y sodio duodecil sulfato (SDS). Este tratamiento
favorece la ruptura de la pared y de la membrana celular, además de contribuir a la
desnaturalización de las proteínas.
Con el fin de liberar el ADN de las proteínas, se utilizan una serie de agentes
desnaturalizantes, como el alcohol etílico, se obtienen dos fases: una orgánica y una
acuosa, separadas por una interfase de proteínas desnaturalizadas; en la fase acuosa
se encuentra el ADN. La mezcla de alcohol no solo desnaturaliza las proteínas, sino que
disuelve los lípidos de la muestra y aumenta la separación de las fases.

2. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

3.1. Equipos
Íte Equipo Característica Cantida
m d
1 Equipo baño maría Con sensor digital 1
2 Microcentríguga Velocidad de al 1
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menos 12000
RPM
3 Vortex Con cabezal de 2
goma
4 Micropipetas Capacidad de 4
100-1000 ul
5 Micropipetas Capacidad de 4
20-200 ul
6 Cocinillas (en caso de Eléctricas 4
no contar con baño
maría)

3.2. Materiales
Íte Material Característica Cantida
m d
1 Morteros y pilones pequeños Porcelana 8
2 Microtubos Capacidad de 20
1.5 ml, de
plástico con tapa
adherida
3 Racks para microtubos Para tubos de 1.5 4
ml
4 Caja de puntas azules Para micropipeta 4
(1000 ul)
5 Caja de puntas amarillas Para micropipeta 4
(200 ul)
6 Vasos de precipitado 100 mL y 250 mL 4 c/u
7 Plancha de tecnopor de --
10x10cm
8 Rejilla de asbesto -- 4
9 Guante térmico -- 4
10 Pizetas con agua destilada -- 4
11 Cutter -- 4
12 Lunas de reloj -- 4

3.3 Muestra:
Muestra 01: hígado de pollo Fresca y 1
conservada en
refrigeración
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3.3. Reactivos
Ítem Reactivo Característica Cantidad
1 SDS dodecilsulfato sódico Buffers de lisis celular 30 mL
2 Isopropanol Refrigerado 20 mL
3 Frasco de cloroformo- En proporción 24:1 20 ml
Alcohol isoamílico

3. PROCEDIMIENTOS:
Nota: Previamente se calienta el baño maría a 65°C y se realizan agujeros a la
plancha de Tecnopor, los agujeros deben tener dimensiones equivalentes a la
de los microtubos de 1.5 ml, de tal manera que sirvan como soporte.

Primero: Con ayuda del cutter realizar un corte del hígado de pollo y obtener una
submuestra de 0.5 gr aprox., realizar cortes de la submuestra sobre la luna de reloj hasta
obtener trozos pequeños (este paso debe de realizarse lo más rápido posible). Dispersar
los trozos pequeños del hígado en el mortero.
Segundo: Añadir al mortero 5ml del buffer SDS y con ayudar del pilón triturarlo hasta
obtener una papilla acuosa (homogenato), este paso hace que se rompan las
membranas y queden los núcleos sueltos.
Tercero: Con ayuda de una micropipeta tomar una muestra de 0.7 ml del homogenato
y llevarlo a un microtubo de 1.5 ml y cerrarlo.
Cuarto: El microtubo debe de ser colocado en la plancha de tecnopor y llevado a
baño maría a 65°C por 10 minutos.
Quinto: Una vez retirado de baño maría el tubo, debe de añadirse 0.5 ml de
cloroformo-alcohol isoamílico y asegurarse de cerrar la tapa correctamente,
una vez hecho esto se debe de llevar al vortex el tubo y sacudirlo por 30
segundos.
Sexto: A continuación, el tubo debe de llevarse a la microcentrífuga por 5 min a 12000
RPM (recordar siempre equilibrar el peso en el equipo para evitar daños).
Séptimo: Una vez terminada la centrifugación debe de sacarse el tubo y trasvasar el
sobrenadante a un tubo nuevo evitando tomar residuos de la interfase o la parte
inferior del tubo.
Octavo: Al nuevo tubo que contiene el sobrenadante agregar 650 ml de isopropanol
helado, cerrar el tubo y mezclar. En esta etapa se podrá apreciar filamentos de color
blanco (ADN) dentro del tubo. Para observar el ADN precipitado (pellet) repetir el paso
sexto paso (centrifugación).
Noveno: Una vez terminada la centrifugación debe de sacarse el tubo y escurrir todo el
contenido líquido evitando perder el pellet.
Décimo “opcional”: Dejar secar totalmente el pellet y agregar 0.5 ml de agua destilada
para realizar pruebas de calidad de ADN.
4. RESULTADOS
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Reportar los resultados con figuras (fotos y/o dibujos) obtenidas de los diferentes
procedimientos de la extracción del ADN incluyendo una explicación de la acción de
cada reactivo sobre la muestra biológica.

5. CONCLUSIONES

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6. SUGERENCIAS y/o RECOMENDACIONES

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7. CUESTIONARIO

7.1. ¿QUÉ ES UN GEN?

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7.2. ¿DE QUÉ ESTÁ CONFORMADO?

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7.3. ¿DÓNDE SE ENCUENTRA?

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7.4. ¿CÓMO SE TRANSMITE DE PADRES A HIJOS?

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Referencias bibliográficas consultadas y/o enlaces recomendados:

Ríos-Sánchez E., Calleros E., González-Zamora A., Rubio J., Martínez O.C., Martínez A., Hernández
S., Pérez-Morales R. (2016). Análisis comparativo de diferentes métodos de extracción de
DNA y su eficiencia de genotipificación en población mexicana. Acta Universitaria, 26(4),
56-65. doi: 10.15174/au.2016.1078
González, N., Rodríguez, N., Torres, W., & O'Callaghan, J. (2011). Protocolo sencillo para la
extracción de ADN genómico de tejido de oreja del ratón y la rata, usando la enzima
bromelina. Revista Científica, XXI(3), 233-238.
Cervantes Gonzales, Jorge Luis. (2003). Obtención de ácido desoxirribonucleico (ADN) útil para
análisis genético, a partir de uñas recortadas. Revista Médica Herediana, 14(4), 229-232.
Recuperado en 17 de marzo de 2023, de http://www.scielo.org.pe/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S1018-130X2003000400014&lng=es&tlng=es