Valentina Corredor Arias

GRUPO B

Laboratorio #1:
AISLAMIENTO DE ADN

A B
(A) ADN genómico aislado de E. coli. Las flechas indican los puntos de desnaturalización tras
calentamiento a >80°C. (B) Fibras de ADN aislado a partir de sangre periférica.

Objetivo

1. Aislar ADN genómico a partir de una muestra de sangre periférica humana anticoagulada con EDTA.
2. Discutir los principios fundamentales que subyacen al aislamiento.

Introducción

Todas las células nucleadas del cuerpo humano contienen los dos tipos mayores de ácidos nucleicos: ADN y
ARN. Los compartimentos subcelulares en los cuales se encuentran incluyen núcleo, citoplasma y
mitocondrias.

El aislamiento de los ácidos nucleicos es de gran utilidad para múltiples aplicaciones. En términos
básicos el ADN representa el genotipo (genoma) mientras que el ARN representa el transcrito
(transcriptoma). Mientras el primero se usa para evidenciar la herencia de alelos de genes
específicos, el segundo se usa para determinar los niveles de expresión del mismo. Este último se
debe interpretar con cuidado dado que los mecanismos de control de expresión no siempre permiten
la traducción de todo mRNA.

Cualquier tejido puede ser sometido a metodologías de extracción de ácidos nucleicos, en algunos
con mayor dificultad que en otros. La extracción de tales ácidos nucleicos implica romper las
barreras naturales de las células eucarióticas que los contienen, específicamente las membranas
citoplasmática y nuclear. Este procedimiento incluye reducir la cantidad de proteína disponible con
objeto de que el ADN no se superenrrolle y por tanto sea de utilidad en múltiples aplicaciones.
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Entre los ácidos nucleicos es ampliamente conocido que el ADN es más estable y resistente que el
ARN, en parte por ser una doble cadena. El ADN puede durar por siglos como una molécula
deshidratada y estable mientras que la mayor parte del ARN, particularmente el ARN mensajero
(mARN), se degrada en términos de horas. No obstante si no se tiene el suficiente cuidado, durante
el aislamiento se puede inducir la degradación del ADN, ya sea por agentes exógenos (ej: LUV) o
endógenos (ej: ADNasas o Endonucleasas
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La siguiente práctica se realizará en dos fases: 1) Firma de consentimiento informado, extracción de sangre
y consignación de datos en el Banco de ADN del grupo de investigación Instituto de Investigaciones
Biomédicas; y 2) Aislamiento de ADN genómico.

Fase 1: Consentimiento informado, Banco de ADN y extracción de sangre

1. Antes de realizar cualquier procedimiento de laboratorio, los estudiantes deberán leer detenidamente el
documento denominado “consentimiento informado”. Este documento es un permiso en el que los
estudiantes, como propietarios de la muestra, o sus acudientes (en el caso de los menores de
edad) de sangre autorizan a los integrantes del grupo de investigación Instituto de
Investigaciones Biomédicas para el almacenamiento y uso de sus muestras de ADN en proyectos
de investigación. El documento establece todos los derechos y deberes del grupo de
investigación y del donante respecto a la muestra; sin embargo, es necesario hacer tres
aclaraciones:
a. La firma del documento es absolutamente VOLUNTARIA.
b. Usted no recibirá ningún beneficio económico o de otra índole por esta donación.
c. No firmar la impedirá a usted mismo usar su muestra en las subsiguientes prácticas.

2. Posterior a la firma del consentimiento informado, cada estudiante por separado, pasará al
laboratorio de PCR para ser entrevistado por un miembro del grupo de investigación Instituto de
Investigaciones Biomédicas. Esta entrevista es de carácter personal con objeto de recolectar
algunos datos de importancia académica e investigativa acerca del historial clínico personal y
familiar y para la adjudicación de un código único de identificación de la muestra. El código será
de aquí en adelante la forma en el que el grupo de investigación se referirá a su muestra,
conservando así las normas éticas básicas y protegiendo la identidad de la muestra durante la
ejecución de proyecto de investigación. Una vez obtenga su código personal, proceda a la zona
de extracción de sangre.

3. Procedimiento para la extracción de sangre venosa a partir de la vena radial o vena cubital. Las
personas autorizadas para realizar este procedimiento son el docente y la asistente de
laboratorio. Ningún estudiante está autorizado para realizar este procedimiento.

Materiales Cantidad por mesón Total (5 mesones)

Agujas Vacutainer™ 5 25
Capuchones 2 2
Vacutainer™
Tubos Vacutainer™ 5 25
EDTA
Torniquete 2 2
Torundas de 1 1
Algodón paqu paqu
ete ete
Alcohol antiséptico 70% 1 frasco 5
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a. Preparar para extraer 1 tubo de 5 ml de sangre a 2 individuos de cada grupo.

b. Analizar las venas y seleccionar la más apropiada para la venopunción.
c. Desinfectar el área de la venopunción con torundas de algodón impregnadas con
alcohol al 70%.
d. Colocar el torniquete en el antebrazo (fuerza moderada).
e. Destapar la parte inferior de la aguja y ajustarla al capuchón.
f. Canalizar la vena más prominente del brazo, con la aguja inclinada y la pestaña hacia arriba.
g. Permitir que el vacío extraiga al menos 3 ml de sangre total.
h. Extraer el tubo y mezclar por inversión 5 veces.
i. Retirar el torniquete y posteriormente la aguja.
j. Cubrir con algodón y hacer presión hasta inducir coagulación.
k. Marcar el tubo con el código del banco de ADN y colocarlo en la gradilla dispuesta para
ello en cada mesa de trabajo y esperar a la fase 2.
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l. IMPORTANTE: No destape el tubo antes de que sea indicado por el docente.

Fase 2: Aislamiento de ADN genómico

4. Procedimiento para el aislamiento de ADN genómico a partir de una muestra de sangre periférica
anticoagulada con EDTA.

Materi Cantidad/ Total

ales Mesón (5X)
Tubos de ensayo de vidrio, tapa 15 75
negra, reutilizables
Pipetas pasteur desechables 50 250
Tubos eppendorf de 2 ml 20 80

Equipos Ubicación
Centrífuga refrigerada Eppendorf 5804R Cuarto de
extracción de ADN (4007) Centrífuga de alta velocidad
Hermle Z180M Cuarto de PCR (4006)
Baño María Dies D-20K Cuarto de extracción de ADN (4007)
Nevera -20C Cuarto de post PCR (4005)

Reactiv Cantidad por Total (5

os mesón mesones)
RCLB2 50 ml 250 ml
WCLB 3 50 ml 250 ml
PPB4 10 ml 50 ml
Isopropa 15 ml 75 ml
nol
Etanol 50 ml 250 ml
70%
Agua ultrapura 10 ml 50 ml

a. Este procedimiento deber ser realizado por cada estudiante.

b. Transferir 3 ml de sangre a un tubo de 15 ml.
c. Enrazar hasta el “cuello” del tubo con RCLB. Esto puede ser de 10-12 mL de RCLB.
d. Observe inmediatamente la mezcla y defina sus características en términos de densidad
y transluminosidad.
e. Mezclar por inversión constantemente hasta percibir que la muestra en menos densa y
completamente translúcida. Esto puede ser entre 3-5 minutos a TA5.
f. Transferir TODA la mezcla a 3 tubos de ensayo de 5 mL. Es necesario que queden
volúmenes similares en cada uno de los tres tubos.
g. Rotule los tubos con el código de banco de ADN usando un marcador indeleble (no use
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cinta de enmascarar) y coloque los tubos en la gradilla de turnos para centrifugación.

h. Con ayuda del docente o la asistente de laboratorio verifique que los tubos sean
centrifugados en las siguientes condiciones: 3500 rpm – 4°C – 10 minutos.
i. Extraer con cuidado los tubos para no resuspender el paquete de células blancas.
j. Verificar la formación de un paquete de células blancas.
k. Siguiendo el ejemplo del docente, descarte el sobrenadante de los tubos de un solo
golpe y en una sola inversión.
l. Agitar fuertemente para resuspender el paquete de células blancas y posteriormente
adicionar 1 mL de WCLB.

2 Tampón de Lisis de Células Rojas (Red Cell Lysis Buffer). Preparación de 1 L de RCLB: 8,28 gr
de NH4Cl + 1 gr de KHCO3 + 0,37 gr de Na2EDTA. Enrazar a 1L con agua destilada y disolver
durante 1 hora en rotor con magneto.
3 Tampón de Lisis de Células Blancas ( White Cell Lysis Buffer). Preparación de 1 L de WCLB: 9,3 gr
de Na2EDTA + 200 ml SDS 10%. Enrazar a 1 L con agua destilada y disolver durante 1 hora en rotor
con magneto.
4 Tampón de Precipitación de Proteínas ( Protein Precipitation Buffer). Preparación de 300 mL de
PPB: 214,8 gr de Acetato de Amonio. Enrazar a 300 mL con agua destilada y disolver durante 3
horas en rotor con magneto.
5 Temperatura Ambiente.
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m. Agitar vigorosamente durante 15-30 segundos, hasta que la solución se haga espumosa
y posteriormente adicionar 0,5 mL de solución PPB.
n. Agitar vigorosamente y verificar la formación de gránulos. Estos pueden ser muy
grandes o a veces muy pequeños.
o. Rotule los tubos con el código de banco de ADN usando un marcador indeleble (no use
cinta de enmascarar) y coloque los tubos en la gradilla de turnos para centrifugación.
p. Con ayuda del docente o la asistente de laboratorio verifique que los tubos sean
centrifugados en las siguientes condiciones: 3500 rpm – 4°C – 10 minutos.
q. Recuperar el sobrenadante y transferirlo a tubo de ensayo limpio de 15 mL. Este paso
se puede realizar por simple inversión cuidadosa del tubo (pico a pico) o con ayuda de
una pipeta pasteur. Es importante que recupere todo el sobrenadante posible sin dejar
pasar detritos celulares.
r. Adicionar 4 ml de Isopropanol y mezclar por inversión hasta que el ADN haya
precipitado. Esto se observa como la formación de una “telaraña” blanca que por
inversión constante se compacta poco a poco.
s. Adicionar 1 mL de etanol al 70% frio (-20°C) en un tubo eppendorff de 2 mL.
t. Recuperar el ADN con ayuda de una pipeta pasteur y transferirlo al tubo eppendorff. Sea
cuidadoso, el ADN tiende a quedarse adherido a la pipeta pasteur. Si esto le sucede
solicite ayuda del docente.
u. Verificar que exista ADN en el tubo eppendorff, cerciorarse de que quede cerrado y
rotular con el código del banco de ADN.
v. Colocar el tubo en la gradilla de tubos eppendorff dispuesta para ello.
w. Su práctica de laboratorio, en lo que se refiere a los aspectos experimentales ha
finalizado. A partir de este momento cerciórese de:
i. Limpiar y desinfectar adecuadamente el mesón de trabajo.
ii. Quien es el responsable de continuar el tratamiento de las muestras.
x. El procedimiento que continúa se denomina lavados con etanol y resuspensión en agua.
Un integrante del grupo de investigación lo finalizará por usted. Se realiza de la siguiente
manera:
i. Centrifugar: 13000 rpm – TA – 1 minuto.
ii. Descartar cuidadosamente el sobrenadante, sin descartar el ADN.
iii. Adicionar 1 ml de etanol al 70%.
iv. Centrifugar: 13000 rpm – TA – 1 minuto.
v. Descartar cuidadosamente el sobrenadante, sin descartar el ADN.
vi. Adicionar 1 ml de etanol al 70%.
vii. Centrifugar: 13000 rpm – TA – 1 minuto.
viii. Descartar cuidadosamente el sobrenadante, sin descartar el ADN.
ix. Remover el exceso del alcohol con una pipeta.
x. Permitir secar al aire durante 20 minutos.
xi. Cerciorarse de absoluta sequedad.
xii. Adicionar 500 µl de agua ultrapura (mili Q).
xiii. Agitar fuertemente para favorecer la resuspención del ADN.
xiv. Incubar: Baño María – 65°C – 30 minutos.
xv. Almacenar las muestras a -20°C hasta su uso.

Preguntas
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¿Cuál es la diferencia entre los conceptos Hemoglobina y Hematocrito?

La diferencia entre hemoglobina y hematocrito es en la relación volumen soluto, puesto que la
hemoglobina es la cantidad de proteína homónima que se encuentra en la sangre mientras que el
hematocrito se relaciona al volumen de glóbulos rojos en el total de la sangre.
2. ¿Cuál es la influencia de la Hemoglobina y del Hematocrito en el color de la sangre?
La hemoglobina y el hematocrito se relacionan al tono de color de la sangre mediante una reacción
química que se conoce como oxidación, la cual es la que da el tono rojo posterior a unirse el hierro
que se encuentra en la hemoglobina al oxígeno.
3. ¿Se puede inferir algo acerca del contenido de ADN de la muestra a partir del contenido de
la Hemoglobina y/o el Hematocrito?
La mayor cantidad de ADN se encuentra en las células blancas (glóbulos blancos) y no en los
eritrocitos, sin embargo, una pequeña parte se encuentra en los reticulocitos que aun poseen núcleo.
4. De los elementos corpusculados de la sangre, ¿Cuáles sirven como fuente de ADN y por
qué?
poseer núcleo, es acá donde se sitúa el ADN, por el contrario, en los glóbulos rojos (hematíes) y
plaquetas no es posible encontrar núcleo. Los leucocitos son además las unidades móviles del
sistema inmunológico o de protección.
5. ¿El EDTA contenido en los tubos en los que se obtuvo la muestra, funciona como un
anticoagulante?
Si, el tubo EDTA actúa como un potente anticoagulante al unirse al calcio en la sangre, haciendo
que las células sanguíneas se conserven. Se utiliza para la toma de muestras como los
hemogramas, análisis de inmunohematología, pruebas de compactibilidad, etc.
6. ¿Cuál es la observación más notable después de incubar la muestra en RCLB y a que cree
que se debe tal efecto?
La observación más notable es cuando la mezcla adquiere un aspecto de menor densidad
observándose translucida, este efecto se debe a la lisis que ocurre en los eritrocitos dejando los
glóbulos blancos intactos
7. ¿Como es posible que RCLB y WCLB tengan efectos tan diferentes? Explique los
fundamentos bioquímicos
El WCLB solubiliza las membranas celular y nuclear, por lo que participa en la desnaturalización de
los glóbulos blancos (células nucleadas) y la disociación de complejos nucleoproteicos. Mientras el
RCLB solo garantiza un ambiente hipotónico para que se rompa la membrana celular del eritrocito.
8. ¿Cuál es el fundamento bioquímico para que la solución PPB realice su acción?
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La adición de una solución saturada de sales (acetato de amonio), provoca la agregación de la

proteína y debris celular y debris celular. Deja libre al DNA en el líquido sobrenadante.
Una vez que los solventes orgánicos son añadidos se forman dos fases: la fase fenólica, ubicada en
la parte inferior de tubo, la cual contiene proteínas y lípidos. A su vez, la fase superior es la fase
acuosa, donde se ubica el DNA o RNA, según sea el caso. En la interfase entre ambas se localiza
un acúmulo sólido de proteínas. El DNA disuelto en la solución acuosa se precipita con alcohol
absoluto (isopropanol o etanol) añadido.
9. ¿Cuál es el fundamento bioquímico para que los ácidos nucleicos precipiten en presencia de
Isopropanol?
El ADN disuelto en solución acuosa se precipita añadiendo alcohol absoluto, ya que los ácidos
nucleicos son insolubles en soluciones alcohólicas. Esto debido a que el isopropanol posee grupos
alquílicos los cuales permiten que la molécula se de carácter hidrofóbica, mientras que el ADN es
hidrofílico al tener grupos fosfatos, por tanto, se da el efecto de precipitación.
10. ¿En qué se diferencian los efectos del isopropanol y del etanol sobre el ADN?
El ADN es menos soluble en el isopropanol, y cuando se precipita este solvente lo hará antes y en
menor concentración y cuando se precipita con etanol es todo lo contario ya que este al ser más
soluble en el medio, para poder que se precipite el ADN tiene que estar en una concentración mayor
El isopropanol tiene una desventaja que es que precipita más sales y por lo tanto el ADN tiene
menor pureza que con el etanol.
11. ¿Qué se espera del proceso de extraer el alcohol y adicionarle agua al ADN?
Cuando se hace la extracción del alcohol y se agrega agua al ADN, primero el alcohol se evapora,
entonces hay que asegurarse que el botón de ADN no se disuelva, y esto se hace con soluciones
que lo preserven como el agua estéril, la cantidad que se utilice de solución debe ser mínima y esto
es para mantener la concentración adecuada de ácido nucleico, pero suficiente para lograr una
solución homogénea. Los lavados con etanol se hacen para eliminar la cantidad de sales que
traspasan al ADN puro.
12. ¿Cuál propiedad fisicoquímica permite este efecto?
Las propiedades que permiten este efecto son la hidrofobicidad y la solubilidad de los compuestos.
13. ¿Cuál es la vida media del ADN en las condiciones finales en que se deja después de esta
práctica?
Puede mantenerse durante varios meses a -20 grados.

BIBLIOGRAFIA
Valentina Corredor Arias
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1. Barrell, A. (2019, 11 octubre). ¿Qué debemos saber sobre los niveles de hemoglobina?

Medicals News Today. https://www.medicalnewstoday.com/articles/es/326651

2. Laura Patricia Alejos Velázquez,1 María del Consuelo Aragón Martínez,2, 3 Amelia Cornejo
Romero2, 4. (s. f.). Extracción y purificación de ADN. pdf. Recuperado 24 de septiembre de 2021, de
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf

3. Rodríguez A, & Rizo A, & Mora D (2016). Extracción de ácidos nucleicos. Montes A, &
Rodríguez A, & Borunda J(Eds.), Biología Molecular. Fundamentos y aplicaciones en las
ciencias de la salud, 2e. McGraw-Hill. https://accessmedicina-mhmedical-
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