BIOMOLÉCULAS

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR I

Marzo del 2022

RESUMEN
 El ADN es un ácido nucleico que contiene las instrucciones genéticas usadas en el desarrollo y
funcionamiento de todos los organismos vivos y algunos virus; también es responsable de la
transmisión hereditaria y el ARN es un ácido nucleico formado por una cadena de ribonucleótidos.
Está presente tanto en las células procariotas como en las eucariotas, y es el único material genético
de ciertos virus. La principal diferencia de estas es que el ADN está formado por dos cadenas largas
que se enrollan entre sí en una espiral, en cambio el ARN está compuesto por una única cadena con
estructura lineal y de menor longitud. Al extraer el ADN y ARN los incubamos durante 1 semana para
así poderlos observar en la electroforesis.
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un
campo eléctrico.La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido, a
través de una matriz porosa, o bien en disolución.Todas las proteínas tienen la misma estructura
química central y están formadas por una cadena lineal de aminoácidos. Lo que diferencia a una
proteína de otra es la secuencia de aminoácidos que la componen, y esta secuencia se denomina
estructura primaria de una proteína.

ABSTRACT
DNA is a nucleic acid that contains the genetic instructions used in the development and functioning
of all living organisms and some viruses; is also responsible for hereditary transmission and RNA is a
nucleic acid made up of a chain of ribonucleotides. It is present in both prokaryotic and eukaryotic
cells, and is the sole genetic material of certain viruses. The main difference between these is that
DNA is made up of two long chains that are wound around each other in a spiral, while RNA is made
up of a single chain with a linear structure and shorter length. When extracting the DNA and RNA,
we incubated them for 1 week in order to be able to observe them in the electrophoresis.
Electrophoresis is a technique for separating molecules according to their mobility in an electric field.
The separation can be carried out on the hydrated surface of a solid support, through a porous matrix,
or in solution. All proteins have the same central chemical structure and are made up of a linear chain
of amino acids. What differentiates one protein from another is the sequence of amino acids that
compose it, and this sequence is called the primary structure of a protein.

INTRODUCCIÓN
Las biomoléculas consisten en compuestos y enlaces químicos, propios de todos los organismos vivos
tales como:lípidos, carbohidratos, proteínas , aminoácidos, ácidos nucleicos constituyentes del
material genético, y las vitaminas.
Propiamente, este módulo se orienta al material genético (ADN Y ARN), y las proteínas,
examinando los procesos de extracción, separación, purificación, y análisis realizados en las
prácticas de laboratorio, correspondientes a: Extracción de ADN, Extracción de ARN, Electroforesis
de ADN y ARN, y Estabilidad de las Proteínas; también podemos apreciar como es el funcionamiento
y estructura de las proteínas, su consistencia y como algunos cambios quimicos o fisicos pueden
alterarlas y causar daño en ellas.

MATERIALES Y MÉTODOS / METODOLOGÍA

Extracción de ADN
MATERIALES Y REACTIVOS
• Una Cebolla • Tubos plásticos de 50 ml (estériles)
• Morteros • Gradillas para tubos de 15 ml
• Probetas • Embudo
• Papel filtro o Whatman No. 1 REACTIVOS:
• Tubos de 1.5 ml (estériles) • Agua destilada (dH2O)
• Gradillas para tubos de 1.5 ml • Hielo
• Micro-pipetas • Etanol al 100% (enfriado previamente a -
• Agitadores de vidrio o asa microbiológica 20°C)
estéril • Buffer de extracción: ver anexo
• Tubos de ensayo de 20 ml (estériles)
Metodología
Tomamos una cebolla de huevo, con la cual se inicia con la homogeneización de sus tejidos. Este
procedimiento puede darse de manera mecánica y/o química, con la función de de romper uniones
celular y facilitar la interacción con la posterior lisis. En este caso, se homogeneizó la muestra
mecánicamente. Para ello se utilizó un mortero y se agregó nitrógeno líquido, inhibiendo la
formación de cristales en los tejidos celulares y, consecuentemente, la degradación del ADN por
ADNasas. Por otro lado, y simultáneamente se realizó un buffer de lisis celular; este
buffer,compuesto por soluciones básicas y detergentes, permitió la liberación de los ácidos nucleicos
destruyendo las paredes celulares de la cebolla, y posteriormente se adicionaron tanto la la muestra
como el buffer en un tubo del facón, el cual se dejó en baño maría por 15 minutos.El material genético
se purificó haciendo uso de papel filtro y un embudo,donde al filtrar la muestra queda una solución
denominada lisado. Posteriormente, se requirió etanol para precipitar el ADN, reduciendo las fuerzas
repulsivas que están entre las cadenas de la molécula, y permitiendo que ésta se pliegue sobre sí
misma haciéndola insoluble.La muestra se refrigeró por 10 minutos para visualizar la nube de ADN
en el sobrenadante , y finalmente se centrifugó para que el ADN permanezca en el fondo del tubo y
separado del etanol, el cual se puede eliminar por evaporación.

Extracción de ARN:
Metodología:
En esta práctica utilizamos patas de mosquito para la extracción del ARN, se macero en el mortero, y
se agregaron por cada 100mg de tejido 700 ul de trizol, homogeneizamos la muestra con vortex e
incubar por 5 minutos, se adiciono el reactivo TRI y mezclamos nuevamente, se centrifugó a 12000
RPM a 4°C, después del centrifugado se transfiere a una pipeta la fase acuosa que es la que contiene
el ARN, precipitamos el mismo añadiendo la fase acuosa a su vez 0,5 ml de isopropanol y
nuevamente se incuba durante 5 min, hacemos centrifugado con las misma configuración ya usada
para así poder observar si hay un precipitado blanco en el fondo del tubo que corresponde al ARN,
procedemos a eliminar el sobrante por completo y agregamos 1 ml de etanol al 75% para luego
decantar y secar el precipitado al aire durante 10 min, finalmente resuspender el ARN en 20 ul de
agua DEPC.

MATERIALES:
• Pipetas Pasteur REACTIVOS:
• Micropipetas • Reactivo comercial TRI con fenol y
• Tubos de 1,5 ml tiocianato de guanidina
• Puntas estériles para micropipeta • Cloroformo
• Vortex • Isopropanol puro
• Congelador (-20°C) para preservar material • Etanol al 75% preparado con agua ultrapura
animal y el ARN aislado de las células • Agua pura libre de ARNasas

Electroforesis de ADN y ARN

Metodología:
Se inició con la preparación de la muestra, adicionando 2 μl de buffer se carga ,5 μl de las muestras de
ARN en los pozos, además de la muestra del marcador de peso molecular. Este
El buffer de carga aumenta la densidad de la muestra , facilitando el acceso a los pozos de gel de
agarosa.Para la preparación del gel de agarosa, se diluyó el polisacárido en TBE 1X,se calentó hasta
que se hubiera fundido, y consecutivamente se dejó enfriar a 50°C . Por consiguiente, se agregó
bromuro de etidio, un intercalante que se utiliza como colorante fluorescente para la visualización de
los fragmentos de la muestra en la cámara.
Se procedió a fijar el molde (peine) en la bandeja de la cámara para después verter el gel de agarosa,
y dejar polimerizar y endurecer este. El gel, toma su función como fase estacionaria, que permite el
paso de los fragmentos del material genético, permitiendo su separación y diferenciación en rango del
tamaño. Antes de empezar a correr la muestra, se embebió la fase estacionaria ( gel de agarosa), en
una fase móvil (Buffer TBE 1X) . Posteriormente se procedió a retirar el molde cuidadosamente y
cargar las muestras y el marcador de peso molecular en los pozos con la micropipeta.Finalizando, se
conectó la cámara y sus respectivos electrodos a la fuente de poder para correr la muestra por 30
minutos, y trás haber pasado tiempo se ubicó el gel encima de un transiluminador y se encendió una
lámpara de luz ultravioleta , permitiendo la visualización de las bandas que resultaron del proceso
electroforético.
Materiales • Agarosa de punto de fusión normal.
• Fuente de poder • Buffer TBE 10X.
• Plato de Calentamiento o Parrilla Eléctrica • Solución stock de bromuro de etidio,
• Cámara de electroforesis para minigeles 10mg/ml.
• Transiluminador de luz ultravioleta • ARN aislado
• Viales de 1.5 ml • Marcador de peso molecular 1000 pb.
• Micropipeta de 20μL • Solución tampón (azul de bromofenol,
• Caja pequeña de Therazaki glicerol, silencianol y formamida).
Reactivos

ESTABILIDAD DE LAS PROTEÍNAS EN SOLUCIÓN

Metodología: Para esta práctica usamos un huevo separamos la clara del huevo, lo batimos durante
unos minutos, filtramos la mezcla para así repartirla en los 12 tubos de ensayos para agregar la
solución de albúmina, el procedimiento fue diferente para cada tubo 4 que fueron del 1 al 4
respectivamente se pusieron en baño maria para así observar una mejor reacción de la mezcla, el resto
de tubos se dejó a temperatura ambiente.
MATERIALES • HCl concentrado
• Tubos de ensayo • Etanol comercial
• Gradilla • HNO3 concentrado
• Lienzo para filtrar. • NaOH 6.0N
REACTIVOS • Acetato de plomo al 2%
• NaCl al 5% • CH3COOH concentrado
• Buffer pH 4,7 • Nitrato de plata al 2%
• HCl 0,05M • Sulfato de cobre (II) al 2%
• NaOH 0,05M • Cloruro de hierro (III) al 2%

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
 Extracción de En esta práctica no tuvimos ningún inconveniente
ADN para hacer la extracción del ADN, se puede ver
que se creó un precipitado ya que el alcohol
disminuye la constante dieléctrica del solvente
acuoso provocando así una disminución en la
solubilidad del ADN que en presencia de altas
concentraciones de sales se precipita.

Extracción de En esta práctica no pudimos observar el pellet,

ARN posiblemente porque a la hora de realizar la
extracción manual puede haber un exceso de
manipulación durante los diferentes procesos que
realizamos como en la extracción, centrifugación,
disolución etc.., probablemente el se degrado y
perdimos el material que se tenía previsto

Electroforesis de En la electroforesis no se logró observar el ARN

ADN y ARN por la cantidad o la concentración de ARN en la
muestra cargada al gel eran insuficientes otra
posibilidad es que el ARN se ha salido por el
extremo del gel durante la electroforesis, o que el
ARN de la muestra se haya degradado durante el
procedimiento, impidiendo ver las bandas de
este; y con el ADN pudimos ver una banda en
cada una de las muestras indicando la
concentración de este

Estructura de las Al agregar reactivos como HCl, etanol,

proteínas HNO3,estas cadenas se separan y forman
cadenas que conectan una cadena con otra, este
proceso químico hace que la solución se vea
diferente, y los cambios físicos como la
coagulación se observan y cambian. Este
proceso se llama desnaturalización y puede
ocurrir por una variedad de razones, como la
exposición a altas temperaturas de las tuberías 1
a 4 que pasan por un baño de agua y luego se
colocan en el congelador, lo que provoca
condensación. También se pueden desnaturalizar
con agentes químicos como el uso de sal, la sal
actúa como depurativo de la sangre frente a las
proteínas, reduciendo la fuerza iónica,
provocando así la desnaturalización.

PREGUNTAS PARA EL REPORTE Y DISCUSIÓN

Extracción de ADN
a.¿Por qué la cebolla y el banano son una buena fuente para la obtención de grandes cantidades de
ADN? Explique.

R//:La cebolla y el banano son una buena fuente para obtener grandes cantidades de ADN ya que
poseen genomas muy grandes, por ejemplo: el genoma de la cebolla es unas dieciséis veces más
grande que el genoma del tomate y cinco veces más grande que el de los humanos.
El banano, por su parte, puede ser diploide, triploide o tetraploide y se sabe, además, que tiene
alrededor de 14000 genes más que los seres humanos.

b. ¿Qué tipos de ADN podemos identificar dentro de una célula?

En las células eucariotas el ADN lo podemos encontrar en el núcleo, en
las mitocondrias y en los plastidios; en los procariotas lo encontramos en citoplasma y en los
plásmidos.
c. ¿Cuáles son las estructuras de la célula que sirven como barrera para llegar al ADN? ¿En nuestro
procedimiento de extracción cómo logramos eliminar o separar estas barreras?

R//:En eucariotas, como las plantas, para llegar al ADN es necesario romper la pared celular, la
membrana citoplasmática y la envoltura nuclear; en animales no hay presencia de pared celular, por
lo que solo es necesario romper la membrana citoplasmática y la envoltura nuclear; en los hongos es
necesario eliminar la pared celular, la membrana citoplasmática y la envoltura nuclear. En algunos
procariotas, como las bacterias gram positivas, es necesario romper la pared de peptidoglicanos y la
membrana citoplasmática.

d. ¿Por qué debemos modificar el protocolo de extracción de ADN cuando trabajamos con células
procarióticas? Explique.
El método de extracción de ADN que se elige depende, en parte, del organismo que se va a estudiar,
así que el protocolo es diferente para animales, plantas, hongos y procariotas.
Las plantas tienen una pared celular compuesta de celulosa, los hongos de quitina y las bacterias de
peptidoglucanos. Para romper la pared celular de
Para los vegetales es necesario utilizar métodos mecánicos, químicos o enzimáticos antes de hacer
la lisis de la membrana; las células animales no poseen pared celular, por lo tanto, basta con agregar
el detergente y agitar para degradar la membrana citoplasmática.
En procariotas, cuando se trabaja con bacterias gram positivas, el protocolo debe incluir el uso de
una lisozima que ayude a degradar la pared de peptidoglicanos que las protege; en el caso de las
bacterias Gram-negativas no es necesario.

Extracción de ARN
a. ¿Por qué se requiere agua ultrapura en este procedimiento?

R//: Ya que las RNasas están en todas partes y pueden destruir el ARN libre si no se protege.
El uso de agua pura y libre de nucleasas ayuda a proteger el ARN y nuestros resultados.
b. Durante la extracción de ARN se emplea tiocianato de guanidina. ¿Qué propiedades
químicas tiene este compuesto que permite la extracción del ARN en el protocolo utilizado?

R//: Ayuda a evitar que las enzimas RNasas y DNasas actúen y desnaturalizan el ARN ya que estas
podrían dañar el extracto.
c.¿Qué son las ARNasas y en qué organismos se pueden encontrar?

R//: Es un enzima que cataliza la hidrólisis de ARN, son ribonucleasas abreviadas con ARNasa,
pueden dividirse en endonucleasas y exonucleasas. Además, la ARNasas se encuentran en todos
los organismo vivos.
d. Los ácidos nucleicos, al tener un esqueleto de fosfato cargado negativamente, son polares.
Luego de la lisis celular con el reactivo de TRI y de la adición de cloroformo, los ácidos nucleicos
son solubles en la fase acuosa superior. Sin Sin embargo, a pH ácido, el ADN se recupera en la
fase orgánica inferior. ¿Qué carga global adquiere el ADN a pH ácido?
R// carga negativa ¿A pH ácido, el ADN es más o menos polar y por lo tanto es más o menos
soluble en agua, que a pH neutro? R//: A pH ácido la carga del ADN sigue siendo negativa. En pH
ácido es menos polar por la concentración de las cargas que con un pH neutro que permite que el
ADN esté más íntegro.

e. ¿Qué tipo de ARN se obtiene en este tipo de extracción?

R//: ARNm, ARNt, ARNr
f. Describa lo observado luego de realizar la electroforesis de la muestra de ARN extraído; ¿cuántas
bandas puede observar; a qué corresponde cada una?
R//La electroforesis nos permite ver cuántos fragmentos diferentes de ARN están presentes en una
muestra y cuán grandes son unos con respecto a otros, pero en este caso no pudimos observar la
concentración de estos fragmentos, por ende no podemos definir cuántas bandas se observan ni
especificar cada una de estas.

Electroforesis ADN y ARN

a. ¿Cómo funciona el Bromuro de Etidio?
R//:El Bromuro de Etidio es un agente intercalante que se usa comúnmente en la electroforesis de
gel de agarosa como aclarador de nucleótidos. Al ser expuesto a la luz ultravioleta emite luz roja-
anaranjada.

b. ¿En qué consiste la electroforesis en gel de poliacrilamida y cuál es su uso?

R//: la acrilamida entra en una reacción de polimerización con la bisacrilamida, la cual es iniciada tras
la presencia de persulfato de amonio y de la molécula TEMED, permitiendo así formar un polímero
más estrecho que los obtenidos por agarosa. Se utiliza principalmente para la separación de
proteínas.

c.¿Cómo se debe preservar el ADN y el ARN extraído en las prácticas anteriores hasta el momento
de hacer la electroforesis; ¿Por qué?
R//: A priori del montaje de la electroforesis, para que se preserve el ADN y el ARN es necesario
que estén en enfriamiento, debido que la baja temperatura mantendría integra sus estructuras,
prohibiendo así la desnaturalización de esta moléculas..

d. ¿Cómo se determina el peso molecular de una muestra problema, corrida en un gel de agarosa?
R//:Es posible determinar el peso molecular de una muestra de electroforesis con los marcadores de
peso molecular. Estos, sirven para reconocer los diferentes tamaños de los fragmentos de la
muestra.

e. ¿Cómo se diferencia en un gel de agarosa un ARN puro e íntegro de un ARN contaminado o

degradado?
R//: Las bandas del ARN puro se verán definidas o nítidas, mientras que para el caso del ARN
contaminado estas bandas se verán difuminadas o borrosas

f. ¿Qué es un espectrofotómetro y cómo se puede utilizar para medir la cantidad y pureza del ARN
aislado?
R//: Son instrumentos capaces de medir la cantidad de luz que es absorbida por una muestra, hay
varios tipos de espectrofotómetros, puede ser de absorción atómica o espectrofotometría de masa,
para medir la cantidad y pureza de ARN aislado se puede comparar la luz que absorbió la muestra
esto permite saber la cantidad del ARN

Estructura de las proteínas

a. ¿Qué es la precipitación con solventes?

R//:Es la precipitación de una proteína por la adición de un solvente orgánico como etanol o
acetona, a una solución acuosa de proteínas, produciendo agregados de moléculas
proteicas que tienden a precipitar

b. ¿Qué es la precipitación con sales (salting out) y para qué se usa en biologı a
́ molecular?

R//:Basado en las interacciones electrolito-no electrolito, en el cual a altas concentraciones salinas algunos
solutos como proteínas o polímeros precipitan debido al aumento de las interacciones hidrofóbicas entre
ellos. La adición de sales elimina el agua de la proteína hidratada, dejando las regiones hidrofóbicas
en libertad de combinarse intermolecularmente

c. Describa las observaciones del laboratorio y discuta estas en términos

moleculares.
R//Pudimos observar la presipitaciion y algunas reacciones, donde hubo cambios de color, y de
temperatura, también pudimos ver la cuagulacion; el nacl tiene un pH algo y sus grupos ionizables
están desprotonados y la carga neta es de signo negativo, al agregarlo a la clara de huevo, las
cadenas de proteínas que hay se encuentran enrolladas de forma esferica.

d. Clasifique los resultados como coagulación o precipitación. ¿Cuál es la diferencia a nivel

molecular?
R//: la diferencia a nivel molecular es que cuando se presenta una proteína desnaturalizada los
cationes se unen a las proteínas negativas lo que hace que se formen coágulos, y al aumentar la
temperatura los coágulos se agrandan. Por otro lado, la precipitación se debe a la cantidad de
residuos básicos o ácidos que tienen las proteínas expuestas en los solventes.

e.Realice un dibujo que represente los procesos de coagulación y precipitación a

nivel molecular.

f. Los procesos realizados en el laboratorio “sacan” las proteínas del agua, pero
existe una técnica llamada liofilización (freeze drying) que saca el agua de las
proteínas. Consulte en qué consiste esta técnica, cuál es su principio físico, cómo
Cómo funciona el equipo y cuál es su costo promedio.
R//: Es un proceso en el que una muestra completamente congelada se coloca al vacío para eliminar
el agua u otros disolventes de la muestra, permitiendo que el hielo pase directamente de sólido a
vapor sin pasar por una fase líquida, junto con el mínimo aporte de calor que se requiere, es ideal por
las propiedades de conservación a largo plazo que proporciona a la integridad de la estructura
biológica y química de la muestra.
Congelando las muestras a 40 grados bajo cero, la bomba de vacío se enciende automáticamente y
crea un vacío alrededor de las muestras, a medida que las bandejas se calientan gradualmente
ocurre un proceso llamado sublimación que elimina el agua de las muestras que se tengan.
Un freeze drying industrial cuesta alrededor de US $3,456,000. Los freeze drying más populares para
uso doméstico cuestan entre $1.995 y $5.090 dólares, según el tamaño y el estilo, e incluyen un kit
inicial de accesorios.

CONCLUSIONES
Existen diversos métodos para alcanzar una aproximación a la comprensión y el estudio de las
biomoléculas - ARN,ADN,y proteínas-, partiendo desde la recolección de las muestras a
analizar,liberando el material genético de la células de un organismo, la visualización de la
interacción y desnaturalización de las proteínas con respecto a diferentes reactivos, hasta el análisis
de muestras por medio de la electroforesis.

BIBLIOGRAFÍA

L. (2020, February 25). Introduction to freeze drying. Labconco.

https://www.labconco.com/articles/introduction-to-freeze-drying

Millrock Technology, Inc. (2021, September 10). Freeze Dryer Basics: What Is a Freeze

Dryer and How Does It Work? https://www.millrocktech.com/lyosight/lyobrary/what-is-

a-freeze-dryer/

Alejos Velázquez , L. Aragón Martinez,M. Cornero Romero,A.

Extracción y purificación del ADN

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf

Fierro Fierro,F. Electroforesis de ADN

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/electroforesis.pdf

ANEXOS

Muestra de ADN
Tubo de ensayo estructura de proteínas con albúmina y NaOH