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Práctica 1: Extracción y purificación de ADN de cepas de Enterococcus sp.

OBJETIVOS
Extraer y purificar ADN genómico a partir de cultivo inactivado de (Enterococcus gallinarum.
Enterococcus caseiflavus y Enterococcus fecalis mediante el uso de membranas de silica.

MATERIALES Y REACTIVOS
 Tips amarillos y azules estériles
 Tubos de microcentrífuga 1.5mL estériles
 Proteinasa K (20 mg/mL)
 Etanol absoluto
 Isopropanol
 Dos Cultivos de Enterococcus sp. (M1 y M2)
 Kit de extracción de ADN basado en columnas de sílica
 Recipiente con lejía 0.5% (inactivación de agentes biológicos)
 Micropipetas automáticas
 Baño Maria seco
 Microcentrífuga para tubos de 1.5mL

PROCEDIMIENTO

Extracción y purificación de ADN usando columnas de sílica

1. Centrifugar 1 mL de suspensión bacteriana a 14 000 rpm por 5 minutos. Decantar el

sobrenadante.
2. Lavar el pellet con 1 mL de PBS 1X y centrifugar a 14 000 rpm por 3 minutos. Decantar el
sobrenadante.
3. Adicionar 200 µL de PBS 1X y resuspender el pellet por pipeteo.
4. Adicionar 20 µL de Proteinasa K, 10 µL de Lysis Enhancer. Mezclar vigorosamente.
5. Adicionar 200 µL de Buffer TB y homogeneizar.
6. Incubar el homogenizado a 65 ºC por 20 minutos.
7. Adicionar 200 µL de etanol absoluto y homogeneizar inmediatamente.
8. Transferir 650 µL del homogenizado a una columna colocada sobre un tubo de colección de
2 mL (proveídos por el kit).
9. Centrifugar a 8 000 rpm por 1 minuto. Descartar solo el contenido del tubo de colección.
10. En caso quede volumen del lisado, repetir los pasos 8 y 9.
11. Adicionar 650 µL de Wash Buffer a la columna.
12. Centrifugar a 8 000 rpm por 1 minuto. Descartar el contenido del tubo de colección.
13. Repetir los pasos 11 y 12 hasta completar un total de 2 lavados con el Wash Buffer.
14. Centrifugar una última vez a 13 000 rpm por 1 minuto para eliminar restos de etanol.
15. Descartar el tubo de colección con el filtrado y colocar la columna en un nuevo tubo de
microcentrífuga de 1.5 mL.
16. Precalentar el Elution Buffer 10 minutos a 65 ºC.
17. Adicionar 200 µL de Elution Buffer precalentado, o TE 1X precalentado directamente al
filtro de la columna y dejar incubar por 2 minutos a temperatura ambiente.
18. Centrifugar a 8 000 rpm por 1 minuto. Recuperar el tubo de microcentrífuga de 1.5mL y
colocarlo en hielo.
19. Almacenar el ADN genómico eluido a -20 ºC.

Nota: La solución Wash Buffer provista por el kit debe ser reconstituida con etanol absoluto antes
de ser utilizada en la extracción.
Para un kit de 50 y/o 100 preps: Añadir 56 mL en la solución Wash Buffer a reconstituir.
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Práctica 2: Análisis de ADN por electroforesis

OBJETIVOS

Verificar la integridad del ADN extraído la práctica anterior mediante electroforesis.

Cuantificar por espectrofotometría el ADN extraído en la práctica anterior.
Verificar la pureza del ADN extraído por espectrofotometría.

MATERIALES Y EQUIPOS

 Gel de Agarosa 1% en TBE 1X Fluerescens dye (GeneOn)

 Buffer TBE 1X
 Marcadores de peso molecular 100 bp GenRuler (Thermo Scientific)
 Parafilm
 Equipo de electroforesis horizontal
 Fuente de poder
 Transiluminador UV.

PROCEDIMIENTO

1. Previo a la práctica se ha preparado un gel de agarosa al 1% (p/v) en TBE 1%. Se pesa 1g de

agarosa ultrapura, grado biología molecular por cada 100 mL de buffer TBE 1X. Se calienta
la mezcla en el microondas sin dejar hervir, hasta que la agarosa se disuelva por completo.
Una vez que se encuentra a 45 oC se vierte sobre el molde del gel con un peine para formar
los pocillos.
2. Sobre un trozo de parafilm colocar 2uL de Fluorescens dye y mezclarlo con 3uL de ADN.
3. Colocar la mezcla dentro del pocillo del gel de agarosa que se encuentra sumergido en
buffer TBE 1X, dentro de la cámara de electroforesis.
4. Las ccondiciones electroforéticas para las muestras en el gel de agarosa serán de 45 min a
100 V.
5. Colocar el gel en el transiluminador UV. Fotografiar.

CUIDADO LA RADIACION UV DEL TRANSILUMINADOR DAÑA PIEL Y OJOS, USAR LENTES O

CASCO ADECUADOS PARA EVITAR QUEMADURAS.

Práctica 3: PCR para la detección de bacterias – Amplificación del gen 16S

OBJETIVOS

Determinar la concentración óptima de MgCL 2 y temperatura para la amplificación de un fragmento

de ADN que codifica el 16SRNA

MATERIALES Y EQUIPOS
 Termociclador  DNA control positivo
 Micropipetas 2-20uL, 10-100uL, 100-  H2O PCR
1000uL.  Alcohol 70%
 Puntas autoclavadas  Rack para tubos
 Tubos de microcentrífuga 1.5mL.  Agarosa
 Tubos de 0.2mL  Buffer TBE 1X
 Hot Start Master Mix 2X (Thermo  Fluorescent dye (Thermo Scientific)
Scientific) contiene buffer PCR 2X, MgCl2  Cámaras de electroforesis horizontal
4mM, ADN pol 2U, dNTPs 0.4mM  Termociclador
 Set de Primers Forward y Reverse 10  Fuente de poder
pmol/uL  Transiluminador ultravioleta
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PROCEDIMIENTO

A.- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Nota: todos los reactivos para PCR deben mantenerse a -20°C hasta su uso.

1. Limpiar el área de trabajo con etanol al 70% y lejía previo a la realización de la PCR.
2. Rotular 4 tubos de PCR de 0.2 uL de la siguiente manera: B (Blanco PCR), M1 (ADN 1), M2
(ADN 2).
3. Preparar el mix para el total de reacciones (4X) sin adicionar el ADN según la siguiente
tabla. Utilizar puntas nuevas para cada uno de los componentes a utilizar en la PCR.

Tabla 1. Master mix

Concentración Concentración
Reactivo
Inicial Vol 1RX uL Vol 4Rx final
Hot Star
2X 10 40 1X
Master Mix
Primer 27F 10pmol/uL 0.5 2 5pmol
Primer 1525R 10pmol/uL 0.5 2 5pmol
H2O 7 28
ADN 25 ng/uL 2
Total uL --- 20 ---

4. Alicuotar un total de 18 uL del mix en tubos de PCR de 0.2 uL rotulados.

5. Colocar 2 uL de ADN fuera de la cabina de PCR para los tubos rotulados M1, M2.
6. Colocar 2 uL de Agua de PCR para el tubo rotulado B.
El ADN de las muestras debe colocarse con una punta de plástico nueva para cada una de
las muestras a trabajar.
7. Colocar los tubos de PCR rotulados en el termociclador Veriti (Applied Biosystems)
programado con las siguientes condiciones: 1 ciclo de desnaturalización inicial: 95ºC por 4
minutos, 30 ciclos: 95ºC por 30 segundos, 50ºC/55oC (según indique el profesor) por 45
segundos y 72ºC por 45 segundos, 1 ciclo de extensión final: 72ºC por 5 minutos.
8. Analizar los productos de reacción por electroforesis en gel de agarosa.

B.- Electroforesis del producto de PCR

1. Previo a la práctica se ha preparado un gel de agarosa al 1% (p/v) en TBE 1%. Se pesa 1g de

agarosa ultrapura, grado biología molecular por cada 100 mL de buffer TBE 1X. Se calienta
la mezcla en el microondas sin dejar hervir, hasta que la agarosa se disuelva por completo.
Una vez que se encuentra a 45 oC se vierte sobre el molde del gel con un peine para formar
los pocillos.
2. Sobre un trozo de parafilm colocar 2uL de Fluorescens dye y mezclarlo con 3uL de producto
de PCR.
3. Colocar la mezcla dentro del pocillo del gel de agarosa que se encuentra sumergido en
buffer TBE 1X, dentro de la cámara de electroforesis.
4. Las ccondiciones electroforéticas para las muestras en el gel de agarosa serán de 45 min a
100 V.
5. Colocar el gel en el transiluminador UV. Fotografiar.

CUIDADO LA RADIACION UV DEL TRANSILUMINADOR DAÑA PIEL Y OJOS, USAR LENTES O

CASCO ADECUADOS PARA EVITAR QUEMADURAS.

Práctica 4: Identificación de especies de Enterococcus sp por PCR múltiple

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OBJETIVOS

Identificar las especies de Enterococcus sp a partir del ADN extraido en la primera utilizando una
amplificación múltiple de 3 fragmentos específicos en el gen ddlE (E. fecalis), ddlE, vanC1 (E.
gallinarum) y vanC2-3 (E.casseliflavus) mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCRm).

MATERIALES Y EQUIPOS

 Termociclador  DNA control positivo

 Micropipetas 2-20uL, 10-100uL, 100-  H2O PCR
1000uL.  Alcohol 70%
 Puntas autoclavadas  Rack para tubos
 Tubos de microcentrífuga 1.5mL.  Agarosa
 Tubos de 0.2mL  Buffer TBE 1X
 Buffer PCR 10x  Fluorescent dye (GeneOn)
 MgCl2 25mM  Cámaras de electroforesis horizontal
 dNTPs mix 2mM  Termociclador
 Taq polimerasa (5 U/uL)  Fuente de poder
 Set de Primers Forward y Reverse 18  Transiluminador ultravioleta
pmol/uL

PROCEDIMIENTO

A.- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Nota: todos los reactivos para PCR deben mantenerse a -20°C hasta su uso.

1. Limpiar el área de trabajo con etanol al 70% y lejía previo a la realización de la PCR.
2. Completar la tabla con los volúmenes correspondientes antes de preparar el mix de PCR.

Tabla 1. Reactivos de PCR múltiple para la identificación de Enterococcus sp.

Reactivo [ ] Inicial Vol. 1Rx Vol. 5 Rx

1 Pre master mix PCR 2x 10 uL 50
4 EfaecalisF 18 pmol/uL 0.5 uL 2.5
5 EfaecalisR 18 pmol/uL 0.5 uL 2.5
8 EgalliF 18 pmol/uL 0.5 uL 2.5
9 EgalliR 18 pmol/uL 0.5 uL 2.5
10 EcasseF 18 pmol/uL 0.5 uL 2.5
11 EcasseR 18 pmol/uL 0.5 uL 2.5
13 Agua PCR   5 uL 25
14 ADN 25 ng/uL  2.0 uL
Volumen final   20.uL

1. Se les proporcionará un master mix de PCR para un total de 5 reacciones (M1, ADN cepa
M1; M2, ADN cepa M2; C+, control positivo y B, blanco de PCR) para un volumen final de 20
uL por reacción en base a lo descrito en la tabla previa.
2. Rotular los tubos y alicuotar en tubos de PCR de 0.2 mL, 18 uL del mix de PCR.
3. Adicionar 2 uL de ADN genómico correspondiente a cada uno de los tubos (M1, M2, C+)
menos al blanco de PCR.
4. Colocar los tubos de PCR en el termociclador Veriti (Applied Biosystems) siguiendo las
condiciones: 1 ciclo de desnaturalización inicial: 95ºC por 4 minutos, 30 ciclos: 94ºC por 45
segundos, 55ºC por 60 segundos y 72ºC por 120 segundos, 1 ciclo de extensión final: 72ºC
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por 5 minutos

B.- Electroforesis del producto de PCR

1. Preparar un gel de agarosa al 1%, TBE 1X y colocarlo en la cámara de electroforesis

horizontal.
2. Mezclar en un papel parafinado 2 µL de solución de carga flurescens dye y 3 µL de producto
de PCR.
3. Colocar en uno de los pozos del gel de agarosa, 3 µL de Generuler 100 bp (marcador de
peso molecular).
4. Colocar los 5 µL de la mezcla (paso 2) en los pozos del gel de agarosa al 1%.
5. Proceder a la electroforesis de productos de PCR a 100 voltios por 45 minutos.
6. Apagar la fuente de poder, retirar el gel de agarosa y visualizarlo en un transiluminador UV.
7. Determinar el(los) tamaño(s) del producto de PCR mediante comparación con el marcador
de peso molecular.

INTERPRETACIÓN:
La presencia de un producto de amplificación de 941 pb corresponde a E.fecalis, un producto de
822 pb corresponde a E. gallinarum y un producto de 439 pb corresponde a E. casseliflavus.

BIBLIOGRAFIA

Ausubel F., Brent, Kignston R., Moore D., Seidman J., Smith J. y Struhlk. 2003. Current Protocol in
Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience.
Sambrook, J & D, Russell. 2001. Molecular cloning: Laboratory Manual. Vol 1. Editorial CSHL. EE.UU.
Promega. Protocols and Applications Guide: The Source for Discovery. En:
http://www.promega.com/paguide/
Devereux R and Wilkinson S. 2004 Amplification of ribosomal RNA sequences. Molecular Microbial
Ecology Manual. 2nd ed. 3-01:509-522.
 6

Práctica 5: Análisis de secuencias -Identificación de cepas de Enterococcus sp

OBJETIVO
Identificar género y especie de Enterobacterias mediante el análisis de secuencias completas del
gen 16S rDNA.

PROCEDIMIENTO

ANÁLISIS DE SECUENCIAS

Para poder analizar los cromatogramas del secuenciamiento, estos deben ser analizados mediante
un software que interprete la información. Para ello, utilizaremos el programa MEGA, el cual
permitirá visualizar, editar y analizar la información. Los resultados del secuenciamiento se
encuentran en formato ab1.

1. Abra el programa MEGA.

2. Para abrir un alineamiento debe dar click en Align->Edit/View Sequencer Files (Tracer)

3. Escoja el archivo 5_27F.ab1. Observará picos de distintos colores: el rojo indica T, el azul
indica C, el verde indica A y el negro indica G. El nucleótido correspondiente para cada pico
se encuentra en la parte superior. Sin embargo, los picos se pueden encontrar
sobrepuestos y difíciles de interpretar.

Eliminar el inicio y al final de la secuencia. Para ello, debe seleccionar los nucleótidos (de la
parte superior) que se desea eliminar, presionar el botón suprimir (Supr). Primero borre
desde el nucleótido 1007 hasta el final, y luego borre los 223 primeros nucleótidos.
4. El siguiente paso, es curar la secuencia manualmente. Es decir, que los nucleótidos en la
parte superior, concuerden con el pico que se muestra en la parte inferior. Para ello se
debe hacer una inspección visual de toda la secuencia. Este es un trabajo tedioso que debe
hacerse en cada secuenciamiento; sin embargo, por efectos prácticos se utilizará otro
método. De click en Data->Export Fasta file.
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5. Guarde el archivo como 2_27F.fas. Ahora, diríjase a la herramienta Blast

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y escoja el Nucleotide Blast. Esta herramienta
realiza alineamientos locales contra la base de datos completas del GenBank. Por lo tanto,
alineará su secuencia contra todos los genes reportados hasta el momento. Abra el archivo
5_27F.fas con un editor de texto (Notepad++, bloc de notas o Wordpad), copie la secuencia
de nucleótidos y péguela en el recuadro de texto del Blast.

6. En la parte inferior de la página, de click en el recuadro Show results in a new window y al

botón BLAST.

7. En la sección DESCRIPTIONS, observe los resultados. Muestras todas las secuencias con las
que alineó correctamente. Fíjese principalmente en dos valores: Query cover e Ident (los
otros valores también son muy importantes, pero el motivo de esta práctica no es el Blast,
así que por el momento ignórelos). Query cover se refiere a la cantidad de la secuencia que
abarcó el alineamiento, 100% indica que el alineamiento constó del total de la secuencia.
Ident, indica el porcentaje de alineamientos perfectos encontró (es decir G con G, T con T,
etc). Podrá notar que los mejores alineamientos poseen 100% de cover pero 99% de ident,
esto quiere decir que el total de la secuencia alineo, pero no todos los nucleótidos
alinearon de manera perfecta.
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8. De click en el primer resultado (Enterococcus faecalis strain GX27 16S ribosomal RNA gene,
partial sequence) y lo dirigirá a la sección que muestra los alineamientos.

9. Analice cuidadosamente, y encuentre que nucleótido(s) no alinearon de manera correcta.

10. Una vez identificado el/los cambio(s), regresa al programa MEGA e inspeccione el cambio
de nucleótido, debe confirmar que el color del pico(s) corresponda al/los nucleótido(s).
11. De esta manera, pudo identificar de que organismo se trata esta secuencia (Enterococcus
faecalis) y los cambios en los nucleótidos.
12. Repita todo este proceso para todas las secuencias de la práctica.
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IDENTIFICACION DE GÉNERO Y ESPECIE MEDIANTE BUSQUEDA EN BASES DE DATOS DE GENES

RIBOSOMALES

1. A partir de las secuencias generadas en la parte 3.1, elabore un archivo de texto (*.txt)
donde coloque todas las secuencias completas en formato fasta.
2. En el navegador web coloque la siguiente dirección: https://umr5558-bibiserv.univ-
lyon1.fr/lebibi/lebibi.cgi
3. Ya en la web BIBISERV, observara en la parte central un recuadro para colocar la
información de las secuencias (Input data).

4. Colocar la primera secuencia en formato fasta a analizar.

5. Revisar la base de datos a utilizar: seleccionar la base de datos referente a procariotas SSU-
rDNA 16S stringent.

6. Una vez colocada la secuencia en formato fasta y asignada la base de datos a utilizar
proceder a realizar la búsqueda para lo cual debemos activar la barra verde de búsqueda
(marcada con la flecha)
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7. Una vez obtenidos los resultados iniciales marcar la opción reporte (marcado con la flecha
negra)

8. Interpretar los resultados obtenidos mediante el análisis filogenético de las secuencias más
relacionadas.
9. Repetir el procedimiento con todas las secuencias entregadas.

BIBLIOGRAFIA

 Flandrois J.-P.,Perrière Guy. & Gouy M. (2015) leBIBIQBPP: A set of databases and a
webtool for automatic phylogenetic analysis of prokaryotic sequences. BMC Bioinformatics,
16:251. doi: 10.1186/s12859-015-0692-z
 Devulder G., Perrière G », Bath F. & Flandrois J.P. (2003) BIBI, a bioinformatics bacterial
identification tool. J. Clin. Microbiol. 41(4)1785-1787. doi: 10.1128/JCM.41.4.1785-
1787.2003