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UNIVERSIDAD DEL VALLE NORMA: VERSIÓN:

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

FECHA DE REVISIÓN: 08-2020

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

ELECTROFORESIS Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

ELABORADO POR: REVISADO POR: APROBADO POR:

Godoy-Galindo Departamento de Química

1. OBJETIVOS
• Familiarizar al estudiante con las técnicas y estrategias habituales para la purificación
y el análisis proteínas de interés.
• Desarrollar estrategias de purificación de proteínas con criterios de eficiencia.

2. INTRODUCCIÓN
En estudios a microescala, como es habitual en laboratorios de bioquímica, se requieren
materiales volumétricos que permitan succionar y transferir volúmenes pequeños de
soluciones (0.2 µL – 10000 µL). Para estos casos, es usual el empleo de micropipetas
(ver Figura 1). En el mercado se encuentra una gran variedad de micropipetas, que se
diferencian en los rangos de volúmenes de empleo y en su función (volumen fija,
volumen ajustable, multicanal, entre otras). Es de destacar que el uso de micropipetas
permite emplear distintos líquidos sin tener que lavar el aparato: para ello, se emplean
puntas desechables, de plástico, que habitualmente son estériles.

Figura 1. Micropipetas monocanal de volumen ajustable.

Ref: https://grupodidacta.com/product/soporte-redondo-para-seis-micropipetas-marca-dragon-lab/?lang=en

Una purificación de proteínas es una serie de procesos que permiten aislar un solo tipo
de proteína de una mezcla compleja. La purificación de proteínas es vital para la
caracterización de la función, estructura, interacciones de la proteína de interés. Hay
varios pasos en el proceso de purificación; puede liberarse a la proteína de la matriz
que lo confina, separar las partes proteica y no proteica de la mezcla, y finalmente
separar la proteína deseada de todas las demás. Este último paso puede ser el aspecto
más laborioso de la purificación de proteínas.
Por otra parte, la electroforesis de gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) es un
procedimiento en el cual las proteínas son desnaturalizadas con dodecil sulfato de sodio
(SDS), un detergente aniónico aplicado a muestras de proteína para linealizarlas e
impartirles una carga negativa, como se observa en la Figura 2. La unión de SDS a la
cadena polipeptídica, en la mayoría de las proteínas, confiere una distribución uniforme
de carga por unidad de masa, lo que resulta en un fraccionamiento por tamaño (masa
molar) durante la electroforesis.

Figura 2. Proceso de desnaturalización de la proteína con SDS.

Para realizar la electroforesis se necesitan dos tipos de gel, de concentración y de

resolución. El gel de concentración (conocido también como gel de apilamiento) es
el encargado de alinear todas las muestras de proteínas, permitiendo que estas se
concentren en una banda apretada durante los primeros minutos de electroforesis antes
de entrar en el gel de resolución. El proceso de separación de las macromoléculas de
acuerdo a su tamaño ocurre en el gel de resolución, el cual tiene un intervalo óptimo de
separación dependiente del porcentaje de monómero utilizado para su preparación.
Para la preparación de los geles mencionados anteriormente, se necesita de un iniciador,
un monómero, un agente entrecruzador y un catalizador, los cuales son el persulfato de
amonio (APS), la acrilamida, la bisacrilamida y el TEMED (N, N, N, N'-
tetrametilendiamina) respectivamente. El tamaño de los poros creados en el gel es
inversamente proporcional con la cantidad de acrilamida usada. Un gel de poliacrilamida
7% tiene poros más grandes que un gel de poliacrilamida 12%. Los geles con un bajo
porcentaje de acrilamida se usan típicamente para resolver las proteínas grandes y geles
con altos porcentajes de acrilamida se utilizan para resolver proteínas pequeñas. Para
obtener una resolución óptima de proteínas, el gel de concentración se agrega sobre la
parte superior del gel de resolución, el primero, tiene una menor proporción de
acrilamida (7% para un mayor tamaño de poro), un pH más bajo (pH 6.8) y un contenido
iónico diferente respecto al gel de resolución.

3. MATERIAL
Computador con conexión a internet.
4. PROCEDIMIENTO

4.1. Antes de la práctica

Claramente, debe leer el material compartido por el profesor, los cuales son:
• La guía de la práctica presencial de electroforesis SDS-PAGE para proteínas: énfasis
en procedimientos generales (el orden lógico, no el detalle) y cuidados a tener para
evitar accidentes o muertes.
• http://www.agbooth.com/pp_ajax/index.html?locale=es (en el botón ayuda) para
explorar los conceptos claves en purificación: SDS-PAGE, Isoelectroenfoque,
Electroforesis 2D, Tratamiento con calor, Fraccionamiento con sulfato de amonio,
Cromatografía de intercambio iónico, Cromatografía de interacción hidrofóbica,
Cromatografía de filtración por gel y Cromatografía de afinidad.

4.2. Uso de micropipetas en estudios biológicos

a. Diríjase al portal labXchange para ver con más detalle las partes y el uso adecuado
de una micropipeta:
https://www.labxchange.org/library/pathway/lx-pathway:2cd1b2af-481a-4b2e-ad51-
5904c2ec16fe/items/lx-pb:2cd1b2af-481a-4b2e-ad51-5904c2ec16fe:lx_simulation:994080b0
b. En todo estudio biotecnológico se emplean micropipetas, vea el vídeo en español
para introducirse al manejo adecuado de una micropipeta:
https://youtu.be/q0b0AWKe5IY?t=14

Recuerde la importancia de realizar mantenimiento, verificación y calibración

del material.
c. Teniendo un conocimiento general de las micropipetas, vaya a la ventana de
simulación del link y realice las actividades del nivel 1:
https://www.labxchange.org/library/pathway/lx-pathway:2cd1b2af-481a-4b2e-ad51-
5904c2ec16fe/items/lx-pb:2cd1b2af-481a-4b2e-ad51-5904c2ec16fe:lx_simulation:43defd7f

4.3. Electroforesis de proteínas

“is the motion of dispersed particles relative to a fluid under the influence of a spatially
uniform electric field”
4.3.1. Preparación de geles de resolución y concentración:
Diríjase al link para visualizar el procedimiento experimental
https://www.youtube.com/watch?v=_8xftsCIwYo (vea hasta 4:05)

Ref: http://www3.uah.es/chemevol/index.php/sds-page-electroforesis-en-gel-de-poliacrilamida/

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DIFERENCIAS ENTRE ELETROFOFESIS SDS-PAGE Y NATIVA:

Ref: https://www.youtube.com/watch?v=DDOGADWIHBw

4.3.2. Procedimiento de la electroforesis:

a. Preparación de muestras de proteína: https://youtu.be/K8VFwhYLLm0

b. Postura de las muestras:
-General: https://youtu.be/_8xftsCIwYo?t=292
-Postura de muestras (detallada y con consejos): https://youtu.be/X8afXNdpSt0?t=27

c. Ejecución de la electroforesis:

¡Precauciones para evitar electrocuciones!

-General en lo experimental: https://youtu.be/_8xftsCIwYo?t=381
-Modelo microscópico SDS-PAGE: https://youtu.be/i_6y6Z5UvwE?t=241
-Ejemplo de Electroforesis en proceso de la práctica:
https://drive.google.com/file/d/1qZ_5ek2RMD2Y9qZxg__BtgZLHOsRa7zB/view?usp=s
haring
-Ejemplo de Revelado de proteínas en geles tipo PAGE:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3149902/ (vea desde 6:30)

RESULTADO PRÁCTICA 2019-II

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4.3.3. Otras técnicas electroforéticas: Isoelectroenfoque (IEP) y Electroforesis
2D (proteómica):
a. Conceptual IEP: https://youtu.be/aQ00nH0kPSk?t=363
Detalle experimental: https://www.youtube.com/watch?v=C8g0VKz_Sc4

b. Conceptual 2D (IEF+SDS-PAGE): técnica clave en proteómica

https://youtu.be/FHvblg338Gg?t=113

Ref: https://www.creative-proteomics.com/blog/index.php/two-dimensional-gel-electrophoresis-2-de/

Resultado experimental 2D:

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4.3.4. Ejecución de electroforesis (virtual): Realice el experimento virtual del link
https://www.labxchange.org/library/items/lb:LabXchange:227cccb5:lx_simulation:1

NOTA: Se dan las respuestas que son requisito previo para la realización de la práctica
de SDS-PAGE pues están enfocadas en otra temática. Una vez las responda como se
indica si podrán ejecutar la electroforesis:

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4.4. Purificación de proteínas
Tenga en cuenta los conceptos de Atotal, Aespecífica, Eficiencia y Grado de purificación.

4.4.1. Observe algunas técnicas de purificación (comunes).

a. Precipitación selectiva con (NH4)2SO4 (hasta 2:30):
https://www.youtube.com/watch?v=430AHdr-yw8
b. Diálisis:
https://www.youtube.com/watch?v=NKAJTmaP7Jg
c. (SEC) Modelo del gel de filtración:
https://youtu.be/S89mAyh6yHU?t=7
d. Cromatografía de intercambio iónico:
https://www.youtube.com/watch?v=sgE0xtWH3sU (separando hemoglobina y
catalasa, de intercambio aniónico)
e. Interacción hidrofóbica: Se aplica un gradiente inverso de sal
https://www.youtube.com/watch?v=hQfVjfjJCK8&list=PL7_N-H8d6RiO-
Xu4Bo5SaXgL7XLeKDhon&index=2
(práctica que hay disponible es la purificación de la proteína G fluorescente según kit
de Biorad).

4.4.2. Laboratorio virtual de purificación:

Vaya a las siguientes fuentes para aplicar los conceptos aprendidos en purificación de
proteínas:
(artículo): https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/bmb.21082
Programa online: http://www.agbooth.com/pp_ajax/index.html?locale=e

a. Comience escogiendo el problema. Ej: Default mixture, la 3

b. Anote bien la información que dan de las proteínas porque después no es fácil
encontrarla.
c. Desde el comienzo vaya haciendo SDS en 1D o 2 D (para dejar de ver el gel,
ocúltelo) ¿Cuántas proteínas se ven en cada paso?
d. El western blot permite ver cuál de todas es la proteína objetivo y además saber
el pI de la proteína de interés para tener criterio de purificación por intercambio
iónico ¿Qué pI y PM tiene la proteína que se le asignó?
e. Si la proteína precipita a una saturación baja de sulfato de amonio es porque es
más hidrofóbica, así que es buena idea después usar con esta cromatografía de
interacción hidrofóbica.
f. Escoja técnicas de purificación según su criterio (se arranca con sulfato de amonio
por barata y rápida o calor si la proteína es termófila).
g. Cuando se hace una cromatografía, hay que revisar la parte de fracciones, medir
actividad (para saber cuáles son las fracciones de interés) y tomar decisiones:
por ejemplo, para saber juntarlas se da en “verificar” de modo que contemple
todo el pico donde se concentra la actividad. Ej: Default mixture prot 3: Q-seph

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 a pH 5.5 (justo encima del pI y se hace gradiente de sal… con el de pH no se
logra tan bien ¿Por qué?).
h. La idea es lograr purificaciones a homogeneidad en el menor número de pasos y
tiempo posible. Pero me interesa (y mucho), los errores que se van cometiendo
en el camino de optimizar la purificación.

5. PARA INCLUIR EN EL INFORME:

a. Anexe los resultados obtenidos de las simulaciones de “manejo de micropipetas” y
“electroforesis de proteínas”.
b. Análisis de geles SDS-PAGE obtenidos en una práctica 2019-II en Univalle:
Con las imágenes de dos geles entregadas por el profesor, determine de forma
cualitativa peso molecular relativo de cada muestra problema.
Para eso, haga una curva de calibración donde grafique el Log (PMpatrones) vs. “Rfs”. Por
interpolación hallará el PM de las proteínas asociadas en las bandas que se observan en
el gel (escoja las dos más intensas en cada carril). Dentro de los análisis que hagan
respondan esta pregunta: ¿Qué se puede analizar del efecto de la adición del DTT para
cada muestra estudiada?
Tutorial que puede ser de ayuda para esta parte:
https://www.youtube.com/watch?v=R5GLNF1Lod4
c. Actividad 1 Purificación: adjunten el link de un video (de 5 min o menos) donde
se ilustre el concepto de purificación mediante cromatografía de afinidad; comente
sobre este en una pequeña reseña de 100 palabras máximo.
d. Actividad 2 Purificación (virtual): Ejecuten la simulación de la purificación de dos
proteínas en diferentes mezclas asignadas por el docente para cada grupo
(pregunte), empleando el programa online Protein Purification. Recuerden: me
interesa (y mucho) que muestren algunos de los “errores” que se van cometiendo
en el camino de optimizar la estrategia de purificación hasta lograr aquella estrategia
con el menor costo posible y el mayor rendimiento. Deberán describir y justificar en
cada caso por qué escogieron cada tipo de purificación y las condiciones particulares
aplicadas en cada uno de ellos. Señalen además las limitaciones de la herramienta
frente a los resultados que se esperarían en la “realidad”.

6. BIBLIOGRAFÍA:
1. https://www.labxchange.org/library/clusters/abe
2. http://www.agbooth.com/pp_ajax/index.html?locale=e
3. Otros recursos complementarios de aplicación o refuerzo de lo aprendido en electroforesis:
http://biomodel.uah.es/lab/SDS-PAGE/inicio.htm
4. Electroforesis capilar (para quien esté interesado este el primer video de una serie):
https://www.youtube.com/watch?v=wStV1rFjHOo
5. Consideraciones en la expresión y purificación de proteínas de membranas:
https://www.thermofisher.com/co/en/home/life-science/protein-biology/protein-purification-isolation/5-steps-
fundamental-protein-preparation.html?CID=EM5075304-DIREFFECT-Biocompare-
20200930&imt=1&utm_campaign=TF+5+Steps+Protein+Prep&utm_source=Biocompare+-
+Protein+Prep+Webinar&utm_medium=Email&utmcontent=Product

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