BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO

CLÍNICO
Fecha: 21/08/2015
FORMATO GUIA DE
LABORATORIO Versión: 01
BLC-GLB-015-UDES

GUIA DE LABORATORIO No. 3

Cuantificación y evaluación de la calidad del ADN genómico

Nombre del Profesor : Ana Elvira Farfán García

Nombre del Curso: Biología molecular y genética
Código del curso: 172301-A1
Horas totales (desarrollo de la práctica): 3

1. Introducción
En la actualidad se están desarrollando ensayos biomoleculares que utilizan cantidades
progresivamente menores de material genético (microvolumen), lo que evita el uso de instrumentos
convencionales basados en cubetas o capilares para la cuantificación de ácidos nucleicos. El
espectrofotómetro UV-Vis permite medir la absorbancia de una solución homogénea a una
determinada longitud de onda. La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una
disolución es directamente proporcional a la concentración de las especies absorbentes y a la
longitud de la cubeta que contiene la muestra. La medida de concentración del ADN en el
espectrofotómetro de microvolúmenes es directa sin la necesidad de utilizar cubetas o capilares.

La ecuación de Beer-Lambert se usa para correlacionar la absorbancia medida con la

concentración mediante la siguiente fórmula: A = ε * b * c
Donde:
A= La absorbancia representada en unidades de absorbancia (A)
ε= Coeficiente de absortividad molar dependiente de la longitud de onda (coeficiente de extinción)
con unidades de litro/mol-cm
b= La longitud de la trayectoria en cm (longitud del paso óptico que contiene la muestra)
c= La concentración del analito en moles/litro o molaridad (M)

Absorbancia:
intensidad muestra (luztransmitida)
A=−log
intensidad blanco(luz incidente)

En el esquema “l” representa la longitud

El sistema utiliza la tensión superficial de la gota para mantener el volumen de muestra en el

pedestal durante el ciclo de medida. Para poder realizar las medidas utiliza diferentes caminos
ópticos (1.0 mm; 0,2 mm; 0,1 mm; 0,05 mm) la longitud de onda de los cuales varía
automáticamente con la concentración de la muestra. El cambio de caminos ópticos a tiempo real
durante la lectura de la muestra permite un amplio rango dinámico de medida de ADN de doble
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cadena.

El sistema de retención de muestras en microvolumen NanoDrop (Thermo Scientific NanoDrop

Products) funciona combinando tecnología de fibra óptica y propiedades naturales de tensión
superficial para capturar y retener pequeñas cantidades de muestra. Además, el sistema emplea
longitudes de trayectoria más cortas, lo que da lugar a una amplia concentración del ácido nucleico
lo que evita el uso de diluciones. La reducción del volumen de muestra necesario para el análisis
espectrofotométrico mejora la calidad y da mayor confianza en los resultados obtenidos.

El protocolo de cuantificación de ácidos nucleicos de microvolumen utiliza un sistema integrado de

retención de muestras como alternativas a los protocolos tradicionales basados en cubetas
(macrovolumen). Este es un método de absorbancia A260 directa que usa un espectrofotómetro de
microvolumen.

2. Competencias
2.1 Competencia general
Identifica los principios básicos de la cuantificación de ácidos nucleicos

2.2 Competencias específicas

 Conoce los reactivos, materiales y equipos empleados en un proceso de cuantificación de
ácidos nucleicos.
 Elabora los procedimientos necesarios para la medición del ADN en un espectrofotómetro.
 Interpreta los resultados obtenidos en cuanto a cantidad y calidad del ADN.

3. Listas
3.1 Lista de Equipos
Nanodrop 2000c Thermo Scientific
Micropipeta de 0,5 a 10 ul
Computador con software Nanodrop
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3.2 Lista de materiales y reactivos

Reactivos:
Agua molecular
ADN extraído

Materiales: Puntas para micropipeta de 0,5-10 μl, papel de arroz, gradillas

El estudiante debe traer: Guantes, tapabocas, gorro desechable.

4. Procedimiento
Se distribuirán en 5 grupos de 4 estudiantes para cada uno de las prácticas. Cada grupo trabajará
en una sección del laboratorio.

Cuantificación del ácido nucleico de microvolumen usando un espectrofotómetro NanoDrop

2000c

1. Para comenzar, limpie las superficies ópticas superior e inferior del sistema de retención de
muestras del espectrofotómetro de microvolumen pipeteando 2 a 3 μl de limpie el agua desionizada
sobre la superficie óptica inferior.

2. Cierre el brazo de la palanca, asegurándose de que el pedestal superior entre en contacto con el
agua desionizada. Levante el brazo de la palanca y limpie ambos. Limpie con una toallita de
laboratorio limpia, seca y sin pelusa (preferiblemente papel de arroz).

3. Abra el software NanoDrop y seleccione la aplicación Nucleic Acid. Utilice una pipeta calibrada
de pequeño volumen para la medición mediante la dispensación de 2 μl de tampón (o agua grado
molecular o el buffer en el que se haya recuperado el ADN) sobre la superficie óptica inferior. Baje
el brazo de la palanca y seleccione "Blank".

4. Una vez completada la medición en blanco, limpie ambas superficies ópticas con una toallita de
laboratorio limpia, seca y sin pelusa.

5. Elija la constante apropiada para la muestra que se va a medir.

Tabla 1. Índices típicos de concentración de ácido nucleico para mediciones de absorbancia A280
directa usando un espectrofotómetro de microvolumen NanoDrop.

Tipo de muestra Opción a seleccionar Constante usada para calcular

la concentración
dsDNA DNA-50 50
ssDNA DNA-33 33
RNA RNA-40 40
Oligo Custom 15-150

6. Dispense 2 μl de muestra de ácido nucleico en el pedestal óptico inferior y cierre el brazo de la

palanca. Debido a la medida del volumen independiente, la muestra sólo necesita cerrar la brecha
entre las dos superficies ópticas para realizar una medición.
7. Seleccione "Medir" en el software de la aplicación. El software calcula automáticamente la
concentración de ácido nucleico y las proporciones de pureza. Después de la medición de la
muestra, revise la salida espectral.
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A=ε*b*c

C= A * ε /b

b = 1 cm (está normalizado)

ε= DNA doble cadena: 50 ng-cm/µL, DNA cadena sencilla: 33 ng-cm/µL, RNA: 40 ng-cm/µL

Absorbancia 260 nm x 50 = XX ng/µl

1

Ejemplo: 5.3 x 50 = 265 ng/µl

Si la muestra que se va a medir está diluida deberá multiplicarse por el factor de dilución.

Límites de detección: Este equipo detecta desde 2 ng/ µl de ADN doble cadena hasta
aproximadamente 15000 ng/µl.

8. El software calculará automáticamente la concentración de ácido nucleico y las proporciones de

pureza. Después de la medición de la muestra, revise la imagen del espectro para evaluar la
calidad de la muestra.

9. Una muestra típica de ácido nucleico tiene un perfil muy característico.

Figura 1. Una muestra típica de ácido nucleico tendrá un perfil muy característico.

10. Fuentes comunes de contaminantes asociados con técnicas específicas de aislamiento de

ácidos nucleicos incluyen fenol/trizol y extracción por columnas. En el caso de la extracción con
métodos que utilizan fenol/trizol, la contaminación por reactivos residuales puede estar indicada por
espectros anormales entre 220 y 240 nm como por desplazamientos en la región de 260 a 280 nm.
Por el contrario, la guanidina residual en los métodos de extracción por columna pueden contribuir
a un pico cercano a 230 nm y un desplazamiento en el canal de 230 nm a aproximadamente 240
nm.
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Figura 2. Los desplazamientos en los picos y valles de las muestras B y C en comparación con la
muestra A ilustran cómo los contaminantes pueden afectar la espectros de muestras de ácidos
nucleicos.

11. Para evaluar con precisión la calidad de la muestra, las relaciones 260/280 y 260/230 deben
analizarse en combinación con la calidad espectral global. El ADN puros típicamente produce una
relación 260/280 de aproximadamente 1,8 y el ARN de aproximadamente 2,0. Esta relación
depende del pH y la fuerza iónica del tampón utilizado para realizar las mediciones del blanco y de
la muestra. Las soluciones ácidas sub-representarán la relación entre 0,2-0,3, mientras que una
solución básica sobre-representará la proporción de 0,2-0,3. Relaciones de pureza
significativamente diferentes pueden indicar la presencia de proteína, fenol u otros contaminantes
que absorben fuertemente en o cerca de 280 nm.

La relación de pureza 260/230 es una segunda medida de la pureza del ADN. Valores para un
ácido nucleico "puro" comúnmente se observan en el intervalo de 1,8-2,2 y son más altas que los
de la relación 260/280. Las razones de pureza que son significativamente más bajas que los
valores esperados pueden indicar la presencia de contaminantes y por lo tanto que la técnica de
extracción utilizada requiere mayor optimización.

12. Los espectrofotómetros NanoDrop también pueden utilizarse para cuantificar proteínas
utilizando absorbancia directa o mediante ensayos colorimétricos de proteínas. Para asegurar
formación apropiada de la columna y reproducibilidad, se recomiendan muestras de 2 μl para
muestras de proteínas.
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5. Resultados y discusión
Después de la medición de la muestra. Realicen el pre-informe y discutan los resultados.

6. Conclusiones
Incluya tres conclusiones de la práctica

7. Evaluación/Autoevaluación
Preguntas para resolver durante la sesión de laboratorio
Para el desarrollo de la práctica es necesario que consulte de forma independiente.
1. ¿Cuáles factores influyen en la concentración de los ácidos nucleicos?
2. ¿Cuáles factores influyen en la calidad de los ácidos nucleicos?
3. Explique, ¿de dónde se obtiene el factor 50 para el cálculo de la concentración del ADN?
4. Establezca las diferencias entre los radios 260/280 y 260/230 del espectro.
5. ¿Cómo se calcula la calidad del ADN?
6. Analice los resultados de la muestra de cada grupo y compárela con una muestra control.
7. Revise el espectro obtenido y emita conclusiones con respecto a la calidad del ADN y a la
cantidad.
8. ¿Cuáles otros métodos existen para la medición de la cantidad y calidad del ADN? Explíquelos
y destaquen ventajas y desventajas entre éstos.

9. Bibliografía- Webibliografía

Manual Nanodrop 2000 Thermo Scientific