Técnicas Instrumentales

TÉCNICAS INSTRUMENTALES AVANZADAS I

GRADO EN BIOTECNOLOGÍA

Práctica:
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC): Análisis
Cuantitativo de Pigmentos Bioactivos.

Competencias específicas:
Realizar separaciones cromatográficas de compuestos bioactivos de interés
biotecnológico y alimentario.

Lugar de realización:
Laboratorio A3, Depart. Bioquímica y Biol. Molecular A. Facultad de Veterinaria

Profesor
- Dr. Fernando Gandía Herrero

Consideraciones generales:
- Los alumnos deberán acudir al laboratorio provistos de: bata, cuadernillo de prácticas,
rotulador de vidrio y calculadora.
- Este material se deposita en abierto al amparo de la convocatoria para promover proyectos
y acciones de innovación y mejora en la Universidad de Murcia para el curso 2017/2018 (R-
700/2017), con el proyecto “Proyección en abierto de actividades docentes con productos
cotidianos para el alumnado relacionados con la promoción de la salud”.

PRECAUCIONES

- El acetonitrilo y el metanol son dos disolventes orgánicos inflamables y tóxicos,

así que se evitará su contacto directo.
- En todo momento deberán seguirse las recomendaciones del manual de
“Seguridad en el Laboratorio” de la Universidad de Murcia, disponible en el
área de Recursos de la asignatura.

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1. INTRODUCCIÓN

Las técnicas cromatográficas se basan en la separación de moléculas por efecto

de su distribución entre una fase estacionaria (fija o confinada) y una fase móvil. Las
moléculas se separan por la distinta velocidad de desplazamiento en función de la
afinidad que tengan por la fase estacionaria y la fase móvil.

La Cromatografía Líquida de Alta Resolución (High Performance Liquid

Chromatography, HPLC) es la técnica analítica de separación más ampliamente
utilizada, siendo idónea para la separación de especies no volátiles (incluyendo de
interés industrial y farmacológico). Implica la utilización de un equipamiento específico
y la separación se produce trabajando con alta presión en columnas con matrices
formadas por esferas de 3 - 10 μm de diámetro.
La cromatografía de reparto en fase reversa utilizando sistemas HPLC constituye
la técnica cromatográfica con mayores aplicaciones. En ella la fase estacionaria,
normalmente derivatizada con grupos C-8 ó C-18 es más hidrofóbica que la fase móvil.
La fase móvil suele ser agua con proporciones variables de disolventes orgánicos
miscibles, como acetonitrilo (MeCN) o metanol (MeOH). Esta técnica se aplica a gran
variedad de compuestos bioactivos de interés, incluyendo las betalaínas. Las betalaínas
son pigmentos vegetales característicos de plantas del orden de las Caryophyllales con
potente actividad antioxidante y capturadora de radicales libres. En animales se ha
demostrado la inhibición de la formación de tumores con concentraciones muy bajas de
los pigmentos en la dieta. La molécula más representativa de la familia de las betalaínas
es la betanina, de color violeta (λmax = 536 nm) y naturalmente presente en la raíz de la
remolacha roja, entre otras fuentes.

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2. MATERIAL Y REACTIVOS

- Equipo de HPLC (bombas, inyector, horno, detector de absorbancia,…)

- Columna cromatográfica C-18 para HPLC (250 x 4.6 mm, partículas de 5 μm)
- Balanza
- Vasos de precipitados y tubos
- Viales de HPLC y filtros
- Centrífuga
- Pipetas Pasteur y varillas
- Pipetas y micropipetas

- Agua destilada
- Tampón de extracción de muestras (Fosfato 20 mM, pH 6.0, con ác. ascórbico 10 mM)
- Fase móvil A (Agua mQ + 0.05 % ác. trifluoroacético (TFA) filtrada)
- Fase móvil B (Acetonitrilo (MeCN) + 0.05 % ác. trifluoroacético (TFA))
- Muestras y patrones. Entre las muestras a analizar, trabajaremos con:

3. PROCEDIMIENTO
Basado en la publicación: “Determination of Beet Root Betanin in Dairy Products by
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)”. Gandía-Herrero, F. et al. (2012).
Journal of Chemical Education, 89, 660-664. DOI: 10.1021/ed200397q

3.1. Preparación de las muestras.

En función del tipo de muestra:
- Patrón
A partir de un patrón de betanina de concentración 3 μM, preparar diluciones
para hacer una recta de calibrado con las concentraciones 0.6 μM (80 μL agua + 20 μL
patrón), 1.2 μM (60 μL agua + 40 μL patrón), 1.8 μM (40 μL agua + 60 μL patrón), 2.4
(20 μL agua + 80 μL patrón) y 3 μM (100 μL patrón).

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- Muestras sólidas o semisólidas

En un vaso de precipitados, pesar una porción de muestra de aproximadamente 3
g. Añadir tampón de extracción a razón de 4 mL por cada gramo y agitar hasta tener una
mezcla homogénea.

- Muestras líquidas
Seguir los mismos pasos, pero sin añadir tampón de extracción.

TODAS LAS MUESTRAS: Transferir a un tubo de ensayo. Centrifugar a 16.000g

durante 20 min (IMPORTANTE: Equilibrar bien los tubos). Recoger el sobrenadante en
un vaso limpio.

Después:
IMPORTANTE: Filtrar TODAS las muestras a través de filtros de nylon de 0.45
μm de tamaño de poro.

3.2. Preparación del equipo de HPLC y equilibrado de la columna.

- Antes de usar el equipo, purgar las líneas que se van a utilizar con las fases móviles
correspondientes, cada una durante 10 minutos. Prestar atención a posibles
incompatibilidades entre los disolventes previos y los que se van a utilizar.
- Realizar lavado del inyector con MeOH 50% en agua.
- El lavado de los pistones se realiza con MeOH 50% en agua. Comprobar que hay
disolvente y que no hay burbujas en el tubo.
- Equilibrar la columna durante al menos 30 minutos con los disolventes a utilizar.

3.3. Introducir 150 μL de cada muestra en los viales de HPLC.

- IMPORTANTE: Tener precaución de que no quede ninguna burbuja en el vial.

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3.4. Programación de la elución e inyección de las muestras.

- Utilizar la siguiente elución en gradiente para el análisis (flujo de 1 mL/min).

tiempo % disolvente A % disolvente B
0 100 0
15 65 35
20 65 35

- Inyectar en el sistema 25 μL de cada muestra preparada.

3.5. Obtención de los cromatogramas e integración de picos.

- Seguir la elución cromatográfica a la longitud de onda máxima del compuesto a

determinar, 536 nm.
- Comparar los cromatogramas obtenidos para las muestras con los del patrón.
- Determinar las áreas de pico para betanina en cada una de las muestras y en todas las
diluciones preparadas de los patrones.

3.6. Recta de calibrado.

- Utilizar las áreas de pico determinadas para los patrones de concentración conocida
para realizar una recta de calibrado, representando área de pico frente a concentración.

3.7. Análisis de resultados.

- Identificar los picos correspondientes a betanina en las muestras problema.

- Utilizar la recta de calibrado para determinar la concentración de betanina en las
muestras. Presentar los datos en mg/g. (El P.m. de betanina es 550 g/mol).

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4. RESULTADOS. Responde a las siguientes cuestiones.

- Representa la recta de calibrado para la determinación de betanina total, en el
ordenador (hoja Excel o similar) o en papel milimetrado.

- Determina la concentración de betacianina en cada una de las muestras preparadas.

Presentar los datos en μM y en mg/mL. (El P.m. de betanina es 550 g/mol).

- Si otro pigmento eluye con un tiempo de retención mayor que betacianina, ¿es más
hidrofóbico o más hidrofílico? Razona tu respuesta.

- Reflexiona acerca del uso de aditivos en alimentos y sobre las características ideales
de un colorante para uso alimentario.

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Práctica:
Refractometría: Determinación de la concentración de sacarosa de
distintas bebidas refrescantes

Competencias específicas:
Análisis de la concentración de azúcar de diferentes alimentos de alto consumo entre la
población juvenil.

Lugar de realización:
Laboratorio A3, Depart. Bioquímica y Biol. Molecular A. Facultad de Veterinaria

Profesor
- Dr. José Manuel López Nicolás

Consideraciones generales:
- Los alumnos deberán acudir al laboratorio provistos de: bata, cuadernillo de prácticas,
rotulador de vidrio y calculadora.
- Este material se deposita en abierto al amparo de la convocatoria para promover proyectos
y acciones de innovación y mejora en la Universidad de Murcia para el curso 2017/2018 (R-
700/2017), con el proyecto “Proyección en abierto de actividades docentes con productos
cotidianos para el alumnado relacionados con la promoción de la salud”.

PRECAUCIONES

- En todo momento deberán seguirse las recomendaciones del manual de

“Seguridad en el Laboratorio” de la Universidad de Murcia, disponible en el
área de Recursos de la asignatura.

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1. INTRODUCCIÓN

Cuando la composición de una sustancia cambia, también lo hace su índice de

refracción. Así pues, una medida del índice de refracción puede dar información sobre
la composición de una sustancia. Por ejemplo, cuando una sustancia se disuelve en un
líquido, el índice de refracción aumenta. Así, para determinar la concentración de la
solución, puede emplearse una medida del índice de refracción de una solución de
azúcar en agua.

Existen numerosos usos y, por lo tanto, los refractómetros se calibran con una o
más escalas para adecuarse a las aplicaciones determinadas. En el caso de los
instrumentos ópticos, se visualiza una escala por medio del ocular y se obtienen lecturas
cuando el límite hace intersección con la escala.

Además de la escala del índice de refracción, la escala de uso más extendido en

un refractómetro es la escala de Brix. Esta escala o porcentaje de azúcar es la más
reconocida internacionalmente y establece una relación entre la concentración de
sacarosa en el agua a 20 ºC con el índice de refracción de la solución (p/p). La mayoría
de los productos alimenticios son más complejos que una solución de sacarosa; muchos
otros ingredientes solubles pueden contribuir al índice de refracción total. Sin embargo,
la escala de Brix continúa usándose como patrón.

En el caso de los productos sin base de sacarosa, el término “Brix aparente” es

estrictamente más correcto.

De manera más general, los refractómetros se usan para medir un índice de

refracción de sustancias puras (líquido) como característica única o se usan para medir
la concentración de una sustancia disuelta en otra. Por lo tanto, la refractometría es una
técnica ideal para el control de calidad en muchas industrias. Los refractómetros tienen
un uso más extendido en las industrias de alimentos y bebidas, en los que el contenido
de sólidos disueltos de los productos alimenticios líquidos se mide como un “valor de
Brix”.

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2. MATERIAL Y REACTIVOS

- Refractómetro
- Sacarosa
- Agua destilada
- Matraces aforados
- Pipetas y micropipetas
- Vasos de precipitados
- Bebidas energéticas
- Papel milimetrado
- Regla
- Entre las muestras a analizar, trabajaremos con:

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3. APARATOS

Protocolo del refractómetro

A) MEDIDA DE LA MUESTRA:

1) Prepare agua destilada o del grifo a temperatura ambiente.

2) Se enciende el refractrómetro pulsando el botón START. Aparece en la
pantalla [LLL].
3) Coloque aproximadamente 0.3ml de agua sobre la superficie del prisma.
4) Presionar la tecla ZERO.
5) En la pantalla aparece 000 tras parpadear 3 veces. Si la pantalla lee “AAA”,
añada más agua sobre la superficie del prisma y presione ZERO de nuevo.
6) Se quita el agua y se seca con papel de celulosa.
7) Se añade la muestra a temperatura ambiente.
8) Se pulsa la tecla START. El valor de la medida de ºBrix se mostrará en
pantalla después de que la flecha parpadee 3 veces.
9) Se limpia con agua y papel de celulosa.

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B) PRECAUCIONES:
− No utilizar ninguna herramienta metálica cuando coloque la muestra. El metal puede
dañar la superficie del prisma.
− La muestra debe estar a temperatura ambiente. Evitar que la muestra o el agua estén
a 40ºC.
− Dejar completamente limpio el refractómetro.

C) MENSAJES DE ERROR:

• [AAA] Error de ajuste a cero:

o Hay insuficiente o nada de agua sobre el prisma mientras se realiza el
ajuste a cero.
o Se está utilizando otra sustancia distinta al agua para hacer el ajuste a
cero.

• [LLL] Error de colocación de la muestra, medición o batería:

o Hay una cantidad insuficiente de muestra sobre el prisma para
realizar la medición.
o La potencia de las pilas está baja. Si las pilas n o se reemplazan, el
instrumento puede apagarse.

• [HHH] Fuera de rango:

o El valor medido de la muestra está fuera del rango de medición.

• Error de temperatura ambiente:

o El refractómetro está diseñado para ser usado en un rango de
temperatura ambiente entre 10-40ºC. Si se usa fuera de ese rango, el
valor (%)Brix se mostrará con una flecha parpadeante. Cuando se
está midiendo una muestra a una temperatura mayor que 40ºC, la
flecha parpadeante puede verse aunque la temperatura ambiente esté
entre un rango de 10-40ºC. El valor Brix estabilizado obtenido
después de repetidas mediciones puede ser usado como un valor de
medición preciso.

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4. PROCEDIMIENTO

A) Se prepararán 50 mL de una disolución de sacarosa de partida de

concentración 0.300 g/mL en agua destilada. A partir de esta disolución se
preparan por dilución otras ocho disoluciones de 5 mL de concentraciones
0.300, 0.250, 0.200, 0.160, 0.140, 0.120, 0.080 y 0.040 g/mL. Para hacer
estas disoluciones se utilizarán las pipetas necesarias y tubos de ensayo de 5
mL.
B) Usando el refractómetro se determinarán los grados Brix de cada
una de las disoluciones preparadas.

Concentración de sacarosa
Grados Brix
(g/mL)

0.04
0.08
0.120
0.140
0.160
0.200
0.250
0.300

C) A continuación, se realizará una recta de calibrado representando

los grados Brix (eje Y) frente a la concentración de sacarosa (Eje X).

D) Posteriormente se determinarán los grados Brix de 2 muestras de

zumo de frutas, otros productos azucarados o similares. ANTES DE ESO, se
medirá la densidad del bote con la bebida sin abrir (Vcilindro = h * 2 * π *
r2), asi como si flota o no flota.

E) Realizaremos una cata sensorial para determinar cualitativamente

cuál de los productos presenta un mayor dulzor global.

F) Finalmente, y mediante el uso de la recta de calibrado se calculará

el contenido en sacarosa de las muestras proporcionadas.

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5. RESULTADOS. Responde a las siguientes cuestiones.

A) Representar la recta de calibrado solicitada en el apartado C del procedimiento

en el ordenador (hoja Excel o similar) o en papel milimetrado.

B) Discutir si se correlaciona la densidad con la flotabilidad obtenida.

C) Determinar los grados Brix y la concentración de sacarosa de las muestras de

alimentos proporcionadas.

D) Argumentar por qué el “dulzor” es mayor en unos o en otros productos.

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