UNIVERSIDAD NACIONAL DE MAR DEL PLATA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

BIOQUIMICA I

TRABAJO PRACTICO: EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Introducción:
Existen varios métodos para la determinación cuantitativa de proteínas, entre los cuales, los
fotocolorimétricos y espectrofotométricos son los más utilizados debido a su rapidez y
sencillez. Dentro de éstos se selecciona el más adecuado en base a su sensibilidad y a la
pureza del extracto sobre el que se realizará la determinación.

a) Método de Biuret: Los compuestos que poseen dos o más enlaces peptídicos, dan
un color púrpura característico cuando son tratados con una solución diluida de sulfato
cúprico en medio alcalino. La aplicabilidad del método se basa en que para todas las
proteínas el N° de uniones peptídicas por unidad de peso es constante. Esta reacción
suele aplicarse cuando la concentración de proteínas varía entre 0,5 y 5 mg/ml, por lo cual la
principal limitación es su escasa sensibilidad, junto con la necesidad de cierto grado de
purificación del extracto.

b) Método de Lowry (o de Folin-Ciocalteus modificado): Es 10 a 100 veces más

sensible que el anterior y depende de los residuos tirosina y triptofano de la proteína. Se
realiza en dos etapas: el ión Cu++ en medio alcalino da la reacción de Biuret y luego el
reactivo arsenomolíbdico interacciona con los grupos hidroxifenólicos de los aminoácidos
mencionados produciendo la formación de óxidos inferiores de molibdeno de color azul. La
medición se suele realizar a 500nm y la sensibilidad del método depende de la composición
en aminoácidos de las proteínas, ya que aquellas que sean más ricas en tirosina y triptofano
darán un valor de absorbancia mayor (el color obtenido puede ser distinto al de la proteína
usada como estándar). Debe prestarse atención al pH final el cual no debe ser mayor de 10.

c) Método de Warburg-Christian: (para estimación de proteínas por medición en el

UV). La mayoría de las proteínas también exhiben una absorbancia de la luz UV máxima a
280 nm debida a la presencia de tirosina y triptofano. Como el contenido de estos
aminoácidos varía dentro de límites razonablemente estrechos, el pico de absorbancia a 280
nm ha sido usado por Warburg y Christian como medición rápida y ligeramente sensible del
contenido de proteínas. Pero debe tenerse en cuenta que los ácidos nucleicos que pueden
estar presentes en el extracto, también tienen una fuerte banda de absorción a esa longitud
de onda pero su absorbancia es aún mayor a 260 nm. Lo opuesto ocurre con las proteínas.
En base a esa diferencia, se puede eliminar por cálculo la interferencia de ácidos nucleicos

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 en la estimación de proteínas.

d) Técnica de transmitancia de la luz: se basa en el pasaje de radiación IR (de mayor

longitud de onda y menor energía que la visible) en forma directa a través de una muestra de
un grosor elevado (por ejemplo 2 cm). Al medirse los cambios en las características de dicha
radiación se puede determinar en forma precisa y exacta el contenido de proteínas. Para
este tipo de determinación es necesario un equipo especial, que puede a su vez determinar
simultáneamente el porcentaje de materia grasa, humedad, azúcares, almidón, fibra y aceite.
Las principales ventajas de esta técnica son que no es destructiva, es rápida
(aproximadamente 20 segundos por muestra) y no necesita preparación previa de la muestra
por lo cual también es económica. Con este equipo pueden procesarse quesos, carnes y
granos.

2.- Objetivos del trabajo:

Extraer proteínas de semillas de soja y cuantificar su contenido proteico por el método de
Lowry.
Objetivos específicos:
Calcular:
1- la concentración de proteínas del extracto proteico (en mg/ml)
2- los mg de proteína/g de tejido
3- el porcentaje proteico en tejido y comparar el porcentaje obtenido con los datos
bibliográficos y discutir las posibles fuentes de error.

3.- Material utilizado:

- Reactivo A: Carbonato de sodio al 2% en agua destilada.

- Reactivo B: Sulfato de Cobre pentahidratado al 0,5% en solución de tartrato doble
de sodio y potasio al 1%.
- Reactivo C: Solución carbonato-cúprica. Mezclar 50 ml del reactivo A más 1 ml del
reactivo B. Descartar después de un día.
- Reactivo D: Solución diluida del reactivo de Folin-Ciocalteus. Dilución 1/3 en agua
destilada.
- Solución estándar de proteínas (ovoalbúmina): 400 µg/ml
- 1 g de porotos de soja.
- Solución de NaOH 1 N-etanol (1:1 v/v)
- NaOH 1 N.
- NaOH 0,1 N

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4.-Técnica operatoria
4.a- Extracción de proteínas de porotos de soja:

Pesar 1g del material en un vaso de precipitado de 100 ml y añadir aproximadamente

20 ml de agua destilada. Dejar hidratar 24 horas (realizado por la cátedra). Desechar el agua
y transferir los porotos a un mortero. Disgregarlos con el pilón. Añadir unos 10 ml de solución
NaOH 1 N - etanol (1:1 v/v) y finalizar la homogeneización. Agregar otros 10 ml de la solución
anterior al mortero y trasvasar todo al vaso de precipitado original. Lavar mortero y pilón con
la misma solución, recogiendo el líquido de lavado en el mismo vaso. Volcar en tubos de
centrífuga y centrifugar 5 minutos a 10000 rpm. Llevar el sobrenadante a una probeta y medir
el volumen final (por ejemplo: 20 ml); éste constituye el extracto proteico puro. Tomar 1 ml y
llevar a 30 ml con NaOH 0,1 N en otra probeta. Esta solución final constituye el extracto
proteico diluido sobre el cual se realizarán las determinaciones.

4.b- Curva de calibrado con ovoalbúmina y cuantificación del extracto proteico

La ovoalbúmina es una proteína que se utiliza como estándar, ya que tiene un

contenido de tirosina y triptofano que se puede considerar "intermedio". La curva de calibrado
se trazará en base a un blanco (B) y 6 diluciones de una solución estándar de concentración
conocida. En los tubos 7 y 8 se realizará la determinación cuantitativa de proteínas en el
extracto proteico diluido.
Para realizar el trabajo, deben seguirse las siguientes instrucciones:

Extracto
Solución Estándar Proteico Agua React. C React. D
(400 µg/ml) diluido destilada (a) (b)
(ml) (ml) (ml) (ml) (ml)
B - - 1,4 7 0,7
1 0,5 - 0,9 7 0,7
2 0,6 - 0,8 7 0,7
3 0,7 - 0,7 7 0,7
4 0,9 - 0,5 7 0,7
5 1,1 - 0,3 7 0,7
6 1,2 - 0,2 7 0,7
7 0 0.7 0,7 7 0,7
8 0 0.7 0,7 7 0,7

a) Rotular los tubos con su letra o número correspondiente.

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b) Agregar el reactivo C y dejar reposar el extracto 10 minutos.
c) Agregar el reactivo D, procediendo a agitar inmediatamente cada tubo después del
agregado. Este paso es crítico: para cada tubo el tiempo entre adición y mezclado no debe
ser mayor que 5 segundos.
- Dejar reposar 30 minutos.
- Leer en el espectrofotómetro la absorbancia de cada tubo a 500 nm.

5. Resultados:

5.a- Trazar la curva de calibrado de absorbancia (en ordenadas) versus µg de proteína (en
abscisas). Verificar el rango en el que se cumple la ley de Beer.

5.b- Utilizando la curva anterior, determinar los µg de proteína presentes en las dos alícuotas
del extracto proteico y promediar los valores. Efectuar los cálculos necesarios para
determinar el porcentaje proteico del material en estudio.

5.c- Comparar el porcentaje obtenido con los datos bibliográficos que podrán buscar por
internet y discutir las posibles fuentes de error.

Cuestionario:
1. ¿En qué reacciones se basan los métodos de Biuret y Lowry?
2. ¿Cuál es el fundamento del método de Warburg-Christian?
3. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de cada método?
4. Cuando se emplea el método de Lowry ¿qué tipo de proteína se utiliza para realizar la
curva de calibración? ¿Por qué?
5. ¿Por qué se mide la absorbancia a 500 nm y no a otra longitud de onda?
6. ¿Por qué es necesario diluir las muestras antes de realizar la reacción de Lowry?

BIBLIOGRAFIA:

- Brady-Humiston. 1975. General Chemistry: Principles and structure. J. Wiley & Sons Inc.
- Cox, M.; Nelson, DL.; and Lehninger, al. 1995. Principios de Bioquímica. Omega.
- Champe, P. Harvey, R. 1994. Lippincott´s Illustrated Reviews. Lippincot Williams & Wilkins.
- Dept. of Agricultural Chemistry. Univ. of Missouri. Columbia 1973/74. Laboratory manual for
210 Biochemistry. Lucas Brothers Publishers.
- Devlin TM (Ed). 1993. Textbook of Biochemistry. Wiley-Liss.
- Dey PM and Harborne JB (Eds). 1997. Plant Biochemistry. Academic Press.
- Lehninger, A. 1987. Bioquímica. Segunda edición. Om ega.
- Lewin B 1997. Genes. Oxford University Press.
- Litwack C. 1969. "Bioquímica Experimental. Un Manual de Laboratorio". Omega.
Barcelona.
- Lowry O.H., Rosebrough N.J., Fan A.L. and Randall R.J. J. 1951 Biol. Chem. 193:265.

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- Noller K. 1968. "Química Orgánica". Interamericana.
- Snell & Snell. 1954. "Colorimetric Methods of Analysis". Edit. Van Nostrad Co. Inc.New
York. Vol.IV.181.
- Stryer, L. 1995. Biochemistry. Freeman and Co. N.Y.