Clonación de genes

Aplicaciones biotecnológicas del ADN, de las proteínas y la

biología molecular
 Biotecnología

Cual es relevancia de la clonación de genes?

Pensar en 3 ejemplos

https://www.youtube.com/watch?v=2G-yUuiqIZ0

https://www.youtube.com/watch?v=TpmNfv1jKuA
Doble hélice de ADN
 Clonación de genes

Cual es el objetivo que se quiere lograr?

• Aislar un gen especifico fuera del genoma de un organismo

• Poder mantener y duplicar este gen de manera autónoma y
regulada
• Poder controlar la traducción y expresión de este gen
• Producir la proteína codificada por el gen de forma escalable
• Realizar manipulaciones en los genes aislados fuera del contexto
genómico del organismo

Cómo lograr estos objetivos?

Cómo usar estas herramientas para lograr el objetivo de insertar un
gen en un plásmido?

1, Digerir plásmido con enzima de restricción apropiada

2, Amplificar el gen de interés con PCR para tener suficiente para las
manipulaciones siguientes

3, Digerir el gen de interés con la enzima de restricción apropiada

aprovechar los extremos cohesivos

4, Ligar los fragmentos y recircularizar el plásmido

 Herramientas para la clonación de genes

Plásmidos bacterianos

Moléculas de ADN de doble cadena

Extra cromosómicos
Se replican y transmiten de forma independiente al cromosoma
Encontrados en bacterias y solo algunos eucariotes
Tamaño variable desde 1 kb hasta 10 kb
Elementos genéticos en Plásmidos bacterianos

Ori: origen de replicación derivado del plásmido ColE1

Controla número de copias por célula
Codifica algunas proteínas requeridas para la copia del ADN
pBR322 número de copias medio (ColE1): 12 y 20 copias por célula
pUC19: mutación en el ori de ColE1: 100 copias por célula
Específico para E.coli
Plásmidos de baja copia: 1 o 2 copias por celula
Elementos genéticos en Plásmidos bacterianos

Marcador de selección:
Permite seleccionar las bacterias que han adquirido el plásmido
Generalmente (no siempre) genes que confieren resistencia a
antibióticos
Contrario a los plásmidos naturales los usados en clonación tienen
tamaños pequeños que facilitan su purificación y manipulación
 Herramientas para la clonación de genes

Enzimas de restricción

Enzimas aisladas de microorganismos

Reconocen secuencias especificas y palíndromicas de ADN
EcoRI: GAATTC
Enzimas de restricción

Gran variedad de enzimas Versatilidad en tipos de corte

https://www.neb.com/
 Herramientas para la clonación de genes

Ligasas

La más usada proviene del bacteriófago T4.

Cataliza la formación de enlace fosfodierster entre –OH 3´y el –P 5´
Requiere ATP para llevar a cabo la reacción
 La reacción en cadena de la
polimerasa PCR

https://www.youtube.com/watch?v=mslMRgxbdOA
Cómo usar estas herramientas para lograr el objetivo de insertar un
gen en un plásmido?
 Transformación bacteriana

Método químico

Método físico
 Selección de transformantes

Cromosoma
E.Coli

β-galactosidasa
 Expresión de proteínas recombinantes

Optimizar condiciones:

• Tiempo de crecimiento

• Cantidad de inductor

• Temperatura de crecimiento
 Producción de proteínas recombinantes

Escalamiento para producción industrial

Uso de birreactores
 Purificación de proteínas a escala industrial

Videos de purificación de proteínas

Protein purification GFP
https://www.youtube.com/watch?v=N7vxq948l-U
Fermentation
https://www.youtube.com/watch?v=5eKdZ0dVCCo
separation
https://www.youtube.com/watch?v=VKpthcW1llU
Aplicaciones del DNA recombinante

https://www.youtube.com/watch?v=bHVpjXAIduw

https://www.youtube.com/watch?v=1RUEsTKoOGM

https://www.youtube.com/watch?v=cyst4EDDwAk

https://www.youtube.com/watch?v=gqMqYYcJgz4