En el desarrollo de los procesos biotecnológicos han requerido el desarrollo de

procesos de purificación. Las productos obtenidos por esta vía deben cumplir no
solo rigurosos requerimientos de calidad y seguridad establecidos por las agencias
regulatorias, sino también su camino hacia el mercado debe ser corto. La
estrategia fundamental de la purificación de productos es simple: remover todos
los contaminantes mientras se trata de retener en el mayor grado posible el
producto de interés; para estos procesos se llevan a cabo las siguientes etapas. [1]

SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN

Para obtener la liberación selectiva de producto(insulina) en la bacteria E.coli

W3110 que es Gram negativa, existe una región de espacio entre la membrana
citoplasmática y la pared celular externa que se denomina periplasma Los
productos ubicados en el periplasma pueden liberarse selectivamente al
interrumpir la integridad de la pared celular externa mientras se mantiene intacto el
citoplasma.[2]
Por lo que este producto intracelular puede liberarse rompiendo las células y luego
pueden recuperarse y purificarse.
Por tal motivo requerimos de métodos de separación y purificación que a
continuación mostraremos las etapas en la figura x.

Molino de
Centrifugación perlas Centrifugación

Espectrometría de
masas Cromatografías

Figura X. Etapas de separación y purificación.

Etapas primarias de recuperación

Etapa 1: Centrifugación (antes del rompimiento celular).
La centrifugación es una de las principales operaciones utilizada para la
separación de células de caldos biológicos, especialmente cuando los caldos no
son fácilmente filtrables, o la adición de ayudas-filtro no es recomendable por
razones de costos o de producción excesiva de desechos contaminantes.
La centrifugación también es empleada en la remoción de desechos celulares de
caldos de células que han sido sujetas a rompimiento, en la separación de
precipitados proteicos y para la recuperación de productos insolubles como los
cuerpos de inclusión.[3]
Las células se concentran por centrifugación a 3750 g (Avanti JLA-16.250, EE.
UU.) Durante 15 minutos a 4°C.[4]
Se debe tener en cuenta las siguientes recomendaciones:
a) El diámetro aparente de las bacterias es del orden de diez veces menor que
el de las levaduras, por lo que su velocidad de sedimentación es cien veces
menor, ya que esta es proporcional al cuadrado de la partícula
b) Las células contienen más del 70% de agua por lo que su densidad es muy
semejante a la de los caldos, por lo tanto el parámetro Δρ puede ser muy
bajo
c) Algunos caldos biológicos son muy viscosos propiedad que dificulta la
sedimentación
d) La velocidad de sedimentación puede ser incrementada en un equipo
centrifugo aumentando la velocidad de rotación o la distancia de
sedimentación (diámetro de la centrifuga).[5]

Factor de Escalamiento (Factor G)

En la caracterización y escalamiento de centrifugas frecuentemente se emplea
el factor G, que es una medida relativa de la velocidad de sedimentación de
una partícula en un campo centrifugo con respecto a su velocidad de
sedimentación en el campo gravitacional.
vw w 2 r
G= =
vg g

G puede ser referida a un radio característico el cual generalmente es el radio

exterior del campo centrífugo. Esto permite desarrollar expresiones prácticas
para estimar la G de la siguiente forma:

G=5,6∗10−7 N 2 D
Donde N está en rpm, el diámetro del tazón de la centrifuga (o punto de
interés) D en mm y G es adimensional. [5]
Etapa 2: Rompimiento celular (Molino de perlas):
La molienda con perlas es uno de los métodos de rompimientos mecánicos
preferibles a gran escala debido a su facilidad de operación, controlabilidad y
habilidad para procesar cargas concentradas de suspensión celular. [6]
El principio es aplastar las células entre las perlas de vidrio y el acero, deja un
fuerte estrés sobre el producto y su costo por lo general es barato.
La suspensión de biomasa se alimentó en la cámara de vidrio de 600 ml del
Dynomill Type MultiLab (CH-4005, WA Bachofen, Suiza) cargada con perlas de
Zirconia de 0,3 mm [cargas de perlas del 75% (v/v)]. La disrupción celular se lleva
a cabo bajo velocidad de punta del impulsor 10 m/s durante 17 min. La cámara de
interrupción se enfría mediante una camisa exterior que circulaba con agua
enfriada con hielo. [7]
El balance de masa de proteína liberada puede ser expresado mediante la
ecuación [3]:
dR
V M= =k ( Rm−R)V M
dt
Integrando y re-arreglando
Rm
ln =kt
Rm−R

La ecuación anterior establece que la velocidad de liberación de la masa de

proteína (células rotas) es proporcional a la masa de proteína presente no liberada
donde:
VM: Volumen libre del molino. [L3].
Rm: Concentración máxima de proteína obtenible. [M/L 3].
R: Concentración de proteína liberada en el tiempo t. [M/L 3].
t: Tiempo de operación. En el caso de la molienda por lotes el tiempo de operación
t es igual al tiempo de residencia de las células en el molino. [t].
k: Constante de velocidad específica de primer orden que depende del tipo de
célula, del tipo y velocidad del agitador, de la carga y tamaño de las perlas, de la
concentración celular y de la temperatura. [t −1].

Etapa 3: Centrifugación (después del rompimiento celular).

Después del rompimiento celular se realiza una centrifugación diferencial, la cual
Se basa en la diferencia en la densidad de las moléculas. Esta diferencia debe ser
grande para que sea observada al centrifugar. Las partículas que posean
densidades similares sedimentarán juntas.[5]
Con la centrifugación diferencial se obtienen dos fracciones: sedimento y
sobrenadante. El comportamiento de cada componente de la muestra depende de
su forma, tamaño y densidad.
Se recogen muestras a intervalos regulares y se clarificaron por centrifugación a
16,249 g (Centrifugadora de suelo refrigerada MSE Mistral 6000) durante 1 minuto
para eliminar los restos celulares. [7]

Etapa 4: Cromatografías
Cromatografía Q Sepharose[4]
La muestra de proteína se aplicó a una columna llena con Q Sepharose y se
equilibró con Tris 0,5 M pH 8,6, seguido de Tris 20 mM pH 8,6. Después de la
aplicación, la columna se enjuaga con tampones: QW - Tris 20 mM pH 8,6 +
isopropanol al 20% (conductividad 0,5 mS). Las proteínas se eluyeron con tampón
QE1 - Tris 20 mM pH 8,6 + isopropanol al 30% (conductividad 0,42 mS) y tampón
QE2 - Tris 20 mM pH 8,6 + isopropanol al 30% (conductividad 3 mS).
Cromatografía RP-HPLC[4]
La separación se lleva a cabo en una columna ACE 5C18-300 usando un
gradiente de acetonitrilo. Fase móvil A: 2000 ml de solución de sulfato de sodio 0.2
M pH 2.3 precalentado en agua tibia a 25 ° C - 30 ° C con 440 ml de acetonitrilo,
pH 2.3. Fase móvil B: 1250 ml de solución de sulfato de sodio 0.2 M pH 2.3
precalentado en agua tibia a 25 ° C - 30 ° C con 1250 ml de acetonitrilo, pH 2.3. La
fracción principal eluída de la columna se diluyó 3 veces con H 2O y luego la
insulina se precipitó con cloruro de zinc.
Cromatografía Sephadex G-25[4]
El precipitado de insulina se suspende en agua y el pH se ajusta a 3,0. Para
intercambiar el tampón de muestra, la muestra de proteína se aplica en una
columna empaquetada con Sephadex G-25 equilibrada con acetato de amonio 5
mM, pH 4.0. La insulina se eluyó con el mismo tampón.
Cromatografía UHPLC [4]
La separación de la muestra se realizó usando el sistema Waters Acquity UHPLC
con el software Empower 3, equipado con una columna ACQUITY UPLC® CSH ™
C18 de 1.7 μm, 2.1 × 50 mm. Los análisis se llevaron a cabo a 23 ° C a una
velocidad de flujo de 0.713 ml / min y detección espectrofotométrica a 220 nm. El
volumen de inyección fue de 2 μl. Se empleó un gradiente de dos tampones A1 y
B1. El eluyente A1 fue 9,66 g de NaH 2PO4 x H2O y 24,58 g de NaClO4 x H2O en
1000 ml de agua, pH 2,5. El eluyente B1 fue 9,66 g de NaH 2PO4 x H2O en 1000 ml
de agua, pH 2,5, mezclado con acetonitrilo 1:1 (v/v).

Etapa 5: Espectrometría de masas MALDI-TOF / TOF [4]

Los espectros de masas se adquirieran usando un analizador 4800 MALDI TOF /
TOF (Applied Biosystems). El instrumento debe ser operado en modo de reflector
de iones positivos. Se usa 0,5 μl de muestra en una placa 384 Opti-TOF MALDI y
se mezclan con 0,5 μl de una solución saturada de matriz de ácido alfa-ciano-4-
hidroxicinámico (CHCA) de Sigma-Aldrich, disuelta en 50:50 agua/acetonitrilo con
0.1% TFA - concentración final (SigmaAldrich). La calibración se logra con una
mezcla de calibración del analizador de proteómica 4700 proporcionada por
Applied Biosystems.
Al final de todo el proceso, se obtiene en promedio 2700 UI de insulina humana
recombinante de hasta 99% de pureza.

Referencias Bibliográficas
[1]  Kilikian BK, Suárez ID, Liria CW, Gombert AK. Process strategies to improve
heterologous protein production in Escherichia coli under lactose or IPTG
induction. Process Biochemistry 2000.
[2] Balasundaram, B., Harrison, S., & Bracewell, D. G. (2009). Advances in product
release strategies and impact on bioprocess design. Trends in
biotechnology, 27(8), 477-485.
[3] Tejeda Mansir, Armando; Montesinos Cisneros,Rosa María; Guzmán Zamudio,
Roberto. Bioseparaciones. Segunda edición. PEARSON EDUCACIÓN, México,
2011. Pág. 111.
[4] Marcin Zieliński, Agnieszka Romanik-Chruścielewska, Diana Mikiewicz, Natalia
Łukasiewicz, Iwona Sokołowska, Jarosław Antosik, Agnieszka Sobolewska-Ruta,
Anna Bierczyńska-Krzysik, Piotr Zaleski, Andrzej Płucienniczak. Expression and
purification of recombinant human insulin from E. coli 20 strain. Institute of
Biotechnology and Antibiotics, Starościńska 5. Polonia. 2019.
[5] angel david mercado mercado, (2014), sustentación de título por suficiencia
profesional – centrifugacion, facultad de ingeniería de procesos escuela
profesional de ingeniería de industrias alimentarias, arequipa-peru.
[6] Padilla,Z.,Acuña,L.,Guerrero,G.,et al., estudio del rompimiento de e. coli en un
molino de perlas para la recuperación de ADN plasmídico mediante el método de
superficie de respuesta. Universidad de Sonora Departamento de Ingeniería
Química y Metalurgia, México.
[7] Chin Woi Ho, Wen Siang Tan, Suryani Kamarudin, Tau Chuan Ling, Beng Ti
Tey. The release of hepatitis B core antigen from Escherichia coli by batch mode
bead milling. Malasia. 2007.