PRÁCTICO 8-9 Electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%, con tinción Nitrato de plata

Integrantes:

Docentes:

Felipe Cayumil del Pozo, PhD Jaime Hernández Grandón Karol González Muñoz Javiera León Rotter Patricia Lobos Mitchel Manterola

Dr. Reginaldo Bq. Javier Bq. Mirna QA. Germán

Muestra problema n°2

Fecha de realización: 19/08/2009 24/09/2009 26/08/2009

Fecha de entrega:

Introducción

Dentro de las técnicas de laboratorio utilizadas con mayor frecuencia, se encuentra la electroforesis, técnica basada en la utilización de una corriente eléctrica, controlada a diferentes voltajes con el fin de lograr la separación de biomoléculas. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa. Esta técnica fue inventada por el bioquímico sueco Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, quien sometió a corriente eléctrica en un tubo de cuarzo una solución proteica y observó que en el tubo se diferenciaban distintas bandas, de distintos grosores. En ese momento no utilizo ningún tipo de soporte, pero más adelante se descubriría que al utilizar soporte se notan zonas mucho mas delimitadas. Actualmente los instrumentos utilizados para la realización de esta técnica bioquímica son primero una fuente de tensión la que realizara los cambios de voltaje para que corra la muestra, electrodos, cubetas, un soporte electroforético y un tampón. La existencia de distintos tipos de soportes nos posibilita a clasificar las electroforesis dentro de 2 grandes grupos, dependiendo de la ausencia o presencia de impedimento al paso de moléculas. Si no oponen resistencia, es un soporte no restrictivo y si lo hace hablaríamos de un soporte restrictivo.

Dentro del grupo de soportes restrictivos, el más representante de estos por excelencia es la electroforesis en gel de poliacrilamida, una de las más utilizadas para la caracterización de mezclas proteicas de gran complejidad, lo cual se debe a sus múltiples ventajas. Es rápido, se necesita poca muestra para poder analizar, el gel es químicamente inerte, es transparente, por lo que facilita la visibilidad de las bandas, el gel también es resistente a agentes desnaturalizantes como la urea y detergentes, mecánicamente son estables, lo que posibilita su deshidratación para reducirlos a una capa fina que facilita su almacenamiento, también son estable a variados pH y a temperaturas variadas. En el práctico utilizamos el método electroforético en gel de poliacrilamida. El proceso de separación de este gel se basa en la porosidad del mismo, el cual obtuvimos mezclando distintas concentraciones de poliacrilamida y bisacrilamida (dependiendo de el porcentaje que buscábamos, en nuestro caso de 12%) siendo menor el poro cuanta más bis-acrilamida usemos en comparación a ala archilamida. También se puede controlar los tamaños de los poros variando los tiempos de polimerización. Esta polimerización se lleva a cabo iniciando un sistema generalizador de radicales libres, se comienza con la adición de TEMED (tetrametiletilendiamina) y persulfato de amonio. TEMED acelera la velocidad de formación de radicales libres a partir del persulfato, estos radicales libres convierte a los monómeros de acrilamida en radicales libres que activan a otros monómeros iniciando la polimerización, los enlaces entrecruzados están dados por la polimerización de la bis-acrilamida es por eso que cuanto más concentración de bisacrilamida adicionemos menor será el tamaño del poro. Esta técnica se combina con la adición a la muestra de sodio dodecil sulfato (SDS) el cual es un detergente que se une a las proteínas proporcional a la masa molecular de estas, las somete a desnaturalización, cargándolas negativamente así la distancia que avancen las proteínas estará dado exclusivamente por el tamaño y no por la forma. Además al cargarlas negativamente asegura que la migración será de cátodo a ánodo. Habitualmente, se utilizan 2 geles de distinta porosidad. El segundo gel es el llamado “stacking gel” con poros mas grandes generalmente 4% que permite concentrar la muestra aplicada, antes de ingresar al gel de separación. En el práctico también se utilizo este gel. En el siguiente informe se entregara el análisis de la electroforesis teñida con nitrato de plata, incluida el análisis de nuestra muestra problema, se comparara con la tinción de Coomassie Blue G250. Comprobando la superioridad de la tinción de nitrato de plata desde el punto de vista de resolución en la electroforesis. Una aplicación clínica de esta técnica es el análisis de proteínas plasmáticas, hay que recordar que en plasma hay más de 120 proteínas solubles que pueden ser identificadas bioquímicamente, y separadas y cuantificadas electroforéticamente según sus respectivas características físico-químicas.

Alteraciones en sus concentraciones normales no pueden ser identificadas como patologías ya que la electroforesis no es una no aporta resultados patognomónicos y, en consecuencia, las alteraciones que en ella se encuentren deben ser confirmadas por métodos de mayor sensibilidad y especificidad, para así, conocer cuál es la patología.

OBJETIVOS • • • • • • Comprender la técnica SDS-Page en una cámara mini-gel vertical por su esencial participación en la corrida electroforética Elaborar geles de poliacrilamida, paso que se debe saber en la teoría y en la practica Elaborar de “stacking gel”, y su porque en la técnica, es importante de entender Comprender principios físicos y químicos en una corrida electroforética. Conocer procesamientos con el gel, luego de la separación electroforética, saber requisitos para reciclar, ya que, recordemos el gel es reutilizable. Comparar nuestra tinción de Nitrato de plata con la tinción de Coomassie blue G250, de un gel con el mismo porcentaje que el nuestro (12%), para así determinar diferencias y similitudes en el análisis de proteínas. Y por último, analizar las bandas proteicas obtenidas tras la separación electroforética. Conocer de que proteínas está compuesto cierto líquido biológico o en el caso de la muestra problema, poder llegar a inferir de que liquido se habla con la composición proteica correspondiente.

Materiales y métodos
 Cámara de electroforesis Mini- Protean III:  2 placas de vidrio -Unidad ensambladora  Vaso precipitado (vaso 100 ml)  Mechero  Microcentrífuga  Jeringa Hamilton  Gradilla  Mechero, rejilla y trípode  Tubos de microcentrífuga Eppendorf  Agitador  Fuente de Poder  Recipiente Plástico (guardar el gel)  Cámara Fotográfica

   

Kit de reactivos para tinción con nitrato de plata Agua destilada Toalla Absorbente Matraz Erlenmeyer

 Gel de separación y Stacking Gel:  Agua desionizada.  Tris HCl 1.5M pH 8.8  Acrilamida Bis/30%  SDS 10%  Persulfato de amonio 20%  TEMED  Buffer de muestra (buffer SDS-reductor):  Tris-Hcl 0.5M pH 6.8  Glicerol  SDS 10%  2-mercaptoetanol  1% azul de bromofenol  Agua desionizada  Buffer de Corrida:  Tris-base  Glicina  SDS  Agua destilada  Estándares:  Caleidoscópico  Real  Preteñido

Método

1.- Preparación de geles de separación: • Ensamblado de cámara de electroforesis:

Preparación de geles de separación 12%:

2.- Preparación “Stacking Gel”:

3.- Preparación de la muestra y el estándar: Las preparaciones de las muestras se hicieron según la siguiente tabla:
N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Muestra Estándar Suero Muestra problema N°2 L.C.R. Estándar real Liquido Ascítico BSA Bilis Liquido pleural Estándar pre teñido Volumen de carga (ul) 15 5 15 15 5 10 7 10 10 10 Dilución --1:50 --1:2 1:20 1:25 1:5 1:10 1:50 ---

Las muestras fueron diluidas con el buffer de muestra (SDS- Reductor) compuesto por:  Tris-Hcl 0.5M pH 6.8  Glicerol  SDS 10%

   La

2-mercaptoetanol 1% azul de bromofenol Agua desionizada etapa de dilución fue realizada por los profesores encargados.

4.- Corrida Electroforética:

Observaciones de la corrida electroforética: (1): Cada cámara electroforética sirve para 2 geles

(2): es importante saber la cantidad de proteína aplicada para que la intensidad de la línea al momento de revelar la corrida no sea tan intensa o muy débil. (3): La muestra se debe aplicar lentamente y a la mitad del pocillo del gel (no se debe tocar el gel) (4): no se debe aplicar más de este voltaje ya que el gel o la cámara de electroforesis puede sufrir algún daño. (5): Detener el voltaje y desensamblar la cámara electroforética (paso realizado por el profesor) (6): No tocar el gel, solo desprender con ayuda del buffer y agua destilada (paso realizado con ayuda del profesor). Solo dejar el gel de corrida; eliminar stacking gel. 5.- Tinción de muestras:

(*) observaciones de la tinción de muestras (1): Sacar fotos sin flash mientras se esté revelando el gel

Tinción con azul de Coomassie: Las técnicas más utilizadas para teñir geles de poliacrilamida son la tinción con nitrato de plata y con azul de Coomassie. Las dos técnicas tienen ventajas y desventajas, la ventaja de la tinción con nitrato de plata es su gran sensibilidad, y la del azul de Coomassie es su limpieza al trabajar con él.

El azul de Coomassie tiñe todo el gel de poliacrilamida, es por esto que se debe realizar un lavado para reconocer las bandas. Esta tinción se une más fuerte a las proteínas que al gel, lo que hace posible que luego del lavado solo queden visualizadas las bandas.

El azul de Coomassie se debe disolver en metanol, acido acético glacial y agua, y luego filtrar. El gel ya fijado se tiñe con azul de Coomassie por 30 a 45 minutos aproximadamente (dejándolo en el agitador). Luego de esto, se debe retirar el colorante utilizando la solución decolorante (metanol/acido acético glacial/agua), esperar unos 20 minutos hasta que se visualicen las bandas proteicas. Migración de las proteínas

Las proteínas al tener todas las mismas cargas (carga negativa y además estar en forma lineal)

migraran hacia el polo negativo, no siendo su carga neta una variante al momento de la migración. La única variante será su masa molecular. Esto es útil para realizar una estimación aproximada de esta variante. El gel ofrece resistencia a las proteínas de mayor tamaño ya que se le hace más difícil el paso por los poros de este, mientras que las más pequeñas migraran de forma más libre llegando más abajo en su carril. A mayor concentración del gel, las proteínas pasaran más lento, y la electroforesis demorará mas.

SDS (dodecil-sulfato sódico)

El SDS es un detergente con capacidad desnaturalizante (deja a la proteína en su estructura primaria) que al unirse a las cadenas polipeptídicas les otorga carga neta negativa. Gracias a esta propiedad la carga neta de las proteínas no es una variante a considerar, dejando solo como variante la masa molecular.

Polimerización de la acrilamida  Persulfato de amonio: Cataliza la polimerización de la acrilamida por los radicales libres que forma los cuales reaccionan con el monómero inactivo. TEMED ( tetrametiletilendiamina): acelera la velocidad de formación de radicales libres a partir del persulfato de amonio. Metilenbisacrilamida: Permite la formación de enlaces entrecruzados de la acrilamida, lo cual le dará la porosidad al gel.

 

RESULTADOS

Tal como lo hemos planteado anteriormente, el último objetivo de este práctico es analizar las bandas proteicas con el fin de conocer los componentes de los diferentes fluidos biológicos. Para esto es necesaria una serie de procesos. Se obtienen las mejores fotografías, donde las bandas se puedan ver

nítidamente.

Se puede usar el estándar Real para la identificación del orden de los carriles, en este caso el estándar Real que fue sembrada en el carril 5 se encuentra también en el carril 5 por lo que sabemos que la fotografía está “al derecho” (los carriles están en el mismo orden que fueron sembrados.

De izquierda a derecha se lee en ambas fotografías:

1.- Estándar Caleidoscópico 2.- Suero 3.- Muestra Problema 4.- Líquido Cefalorraquídeo (LCR) 5.- Estándar Real 6.- Líquido Ascítico (o Líquido Peritoneal) 7.- BSA (Albúmina de Suero Bovino) 8.- Bilis 9.- Líquido Pleural 10.- Estándar Preteñido

Para crear la gráfica de la curva es necesario calcular la Movilidad Relativa de cada banda de los estándares, pero para esto primero se requiere identificar dichas bandas. Para identificar las bandas en nuestro gel, que al ser teñido con Nitrato de Plata, el cual es mucho más sensible, revela hasta las bandas más ínfimas, tuvimos que compararlo con el gel análogo teñido con Azul de Coomassie (mismo porcentaje: 12%) Estándar Caleidoscópico

El gel teñido con Azul de Coomassie nos indica las proteínas más importantes que debemos tomar para crear nuestra curva. Luego se calculamos la movilidad relativa de cada una de estas bandas.

Movilidad Relativa (Rf) = Distancia recorrida de la banda Medida total del gel

Luego de esto se relacionaron las bandas encontradas con su correspondiente peso molecular.

Nota: aunque en los 3 estándares estén las mismas proteínas, los pesos moleculares son diferentes pues la adhesión de la tinción (de diferentes pesos) los hace variar. Los Rf están relacionados de manera inversamente proporcional con el logaritmo del Peso molecular, por lo que ocupamos esta propiedad para construir una línea recta con pendiente negativa.
Std. Caleidoscópico Proteína Miosina B-Galactosidasa Albúmina Inhibidor Tripsina Lisosima PM (KDa) 195,115 131,025 85,006 31,528 17,251 Log PM 2,29 2,12 1,93 1,5 1,24 Rf Rf

0,08 0,08 0,25 0,24 0,46 0,45 0,75 0,89 0,9

Se repite lo mismo con todos los estándares. Estándar Real

Std. Real Proteína B-Galactosidasa Albúmina Anhidrasa Carbónica PM (KDa) 116,25 66,2 31 Log PM 2,07 1,82 1,5 Rf Rf

0,31 0,32 0,5 0,49

0,74 0,72

Estándar Preteñido

Std. Preteñido Proteína Miosina B-galactosidasa Ovoalbúmina Lisosima PM (KDa) 202 117 93 19 Log PM 2,31 2,07 1,7 1,28 Rf 0,08 0,35 0,76 Rf 0,09 0,33 0,7 0,94

Una vez tenido estos datos se puede construir la gráfica de la relación Log PM v/s Rf

Gel teñido con Nitrato de Plata
Gráfica de la relación log PM v/s Rf
2,5 2 1,5 1 0,5 0 0

log PM (KDa)

y = -1,1993x + 2,4318 R2 = 0,9509 0,2 0,4 Rf 0,6 0,8 1

Todos

Std. Caleidoscópico

Std. Real

Std. Preteñido

Lineal (Todos)

Gel teñido con Azul de Coomassie

Gráfica de la relación log PM v/s Rf
2,5 2 log PM (KDa) 1,5 1 0,5 0 0 y = -1,2342x + 2,4384 R 2 = 0,9763 0,2 0,4 Rf Todos Std. Caleidoscópico Std. Real Std. Preteñido Lineal (Todos) 0,6 0,8 1

Teniendo la curva de los estándares, con la Ecuación de la Recta se interpolan los Rf de las bandas para obtener el PM al que corresponden: Ej.: Ec. de la Recta del gráfico de Nitrato de Plata: y = -1,1993x + 2,4318 Se reemplazó la “x” por el Rf de la albúmina del mismo estándar Real para comprobar que la pendiente estaba bien. y = -1,1993 · 0,5 + 2,4318 = -0,59965 + 2,4318 = 1,832 A este resultado se le saca la función inversa al “Log”, Exp base 10 para obtener el PM en KDa PM= 67,920 KDa Para obtener el resultado en Da sólo basta con multiplicar el resultado por “1.000”. PM= 67.920 Da Suero

SUERO Proteína Ig M α-2-Macroglobulina β-Lipoproteína C3 Ig E Ig D Ig A Ig G Haptoglobina-1 Transferrina Albúmina Prealbúmina Fosfatasa Alcalina α-1-Antitripsina α-1-Glicoproteína Ácida PM (Da) 850.00 0 725.00 0 380.00 0 340.00 0 180.00 0 180.00 0 160.00 0 150.00 0 100.00 0 80.000 66.200 62.000 56.800 54.000

El suero es el componente de la sangre (de un 44.000 color amarillo, un poco más intenso que el plasma) libre de factores de coagulación y Eritropoyetina 30.000 células sanguíneas. Contiene numerosas proteínas, efectores biológicos, como el factor de crecimiento derivado de plaquetas o anticuerpos que se formar como respuesta inmunitaria. Es útil en la identificación de algunos analitos en los que no se requiere de la intervención de un anticoagulante, ya que este podría interferir en el resultado alterándolo. Banda 1: Banda 1:

Banda delgada, difusa y bien teñida.

Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,43 PM= 80.910 Da

Rf= 0,44 PM= 80.169 Da

Posible Proteína= Transferrina Banda 2: Banda gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,52 PM= 64.269 Da

Posible Proteína= Transferrina Banda 2: Banda gruesa nítida y bien teñida. Rf= 0,51 PM= 64.417 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica Banda 3: Banda gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,65 PM= 44.875 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica Banda 3: Banda gruesa nítida y bien teñida. Rf= 0,63 PM= 45.814 Da

Posible Proteína= α-1-glicoproteína ácida Banda 4: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,71 PM= 38.019 Da

Posible Proteína= α-1-glicoproteína ácida

Posible Proteína= α-1-glicoproteína ácida o degradación de proteínas Banda 5: Banda 4:

Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,76 PM= 33.113 Da
Ig M

Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a LCR una tensión deficiente.
PM (Da)

Proteína Rf= 0,75

PM= 32.584 Da

850.00 0 725.00 380.00 0 340.00 0 160.00 0 150.00 0 140.00 0 135.00 0 132.00 0 131.00 0 93.000 80.000 78.500 66.200 62.000 56.800 51.000 47.478 45.000 44.000 18.500 14.400 13.000 11.818

Posible Proteína= Eritropoyetina o Posible α-2-MacroglobulinaProteína= Eritropoyetina o 0 degradación de proteínas degradación de proteínas
β-Lipoproteína

LCR
Fibrinógeno Ig A Ig G Enzima convertidora de Angiotensina Lactato Deshidrogenasa (LDH) Ceruloplasmina Proteína C reactiva Aspartato aminotransferasa (ASAT) Transferrina Creatinquinasa (CK) Albúmina Prealbúmina Fosfatasa Alcalina Globulina Gc

El líquido cerebroespinal o cefalorraquídeo es un líquido con un volumen entre 100 y 150 ml de color transparente, que baña el cerebro y la médula espinal.

Glutamato-oxalacetato transaminasa (GOT) Ovoalbúmina α-1-Glicoproteína Ácida Proteína mielínica básica Lisosima Cistatina α-2-Microglobulina

Se encuentra circulando por el espacio subaracnoideo, los ventrículos cerebrales. Puede enturbiarse por la presencia de leucocitos o la presencia de pigmentos biliares. Numerosas enfermedades alteran su composición y su estudio es importante y con frecuencia determinante en las infecciones meníngeas, carcinomatosis y hemorragias. Banda 1: Banda gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,51 PM= 66.069 Da Banda 1: Banda gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,5 PM= 66.223 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica Banda 2: Banda gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,63 PM= 47.424 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica Banda 2: Banda gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,62 PM= 47.098 Da

Posible Proteína= GOT, Subunidad α de la proteína G, α-1-Glicoproteína ácida u Ovoalbúmina, globulina Gc (PM: 51.000 da) Banda 3: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,75 PM= 34,041 Da

Posible Proteína= GOT, Subunidad α de la proteína, α-1-Glicoproteína ácida u Ovoalbúmina.

Posible Proteína= degradación de proteínas

Líquido Ascítico

El espacio peritoneal contiene Lactato Deshidrogenasa normalmente (LDH) 135.000 una cantidad Albúmina Sérica 66.200 inferior a 50 ml de un líquido Fosfatasa Alcalina 56.800 claro y Amilasa 45.000 transparente, de color Anhidrasa Carbónica 31.000 amarillo pálido, que se mantiene en equilibrio dinámico por fuerzas que regulan su formación y reabsorción, cuya función es la de lubricar y proteger esta cavidad, recubriendo todos los órganos del abdomen. En diversas situaciones patológicas, este líquido se altera y se produce una acumulación anormal de fluido. La ascitis es una gran acumulación de líquido intersticial o extracelular en la cavidad peritoneal, análoga a la que se produce en el tejido celular subcutáneo en caso de edema.
Proteína PM (Da)

LIQ. ASCÍTICO

Banda 1: Banda no muy gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,4 PM= 89.536 Da

Posible Proteína= En patología puede ser Transferrina, Haptoglobina, Protrombina o Colinesterasa. Fisiológicamente puede ser: degradación de alguna proteína como la LDH Banda 2: Banda 1:

Banda no muy gruesa, no muy nítida y bien teñida. Rf=0,45 PM= 77,983

Banda delgada, nítida y no muy bien teñida. Rf= 0,45 PM= 76.884 Da

Posible Proteína= En patología puede ser Protrombina o Transferrina, o sino sólo es una degradación proteica. Banda 3: Banda gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,51 PM= 66.069 Da

Posible Proteína= En patología puede ser Protrombina o Transferrina, o sino sólo es una degradación proteica. Banda 2: Banda gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,52 PM= 62.661 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica Banda 4: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,57 PM= 55.976 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica

Posible Proteína= Fosfatasa Alcalina

Banda 5:

Banda 3:

Banda gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,62 PM= 48.753 Da

Banda gruesa, nítida y no muy bien teñida. Rf= 0,63 PM= 45.814 Da

Posible Proteína= Amilasa, degradación de proteínas glicoproteína ácida, fibronectina (PM: 45000), interferón gamma (45.000 -50.000 da) Banda 6: Banda gruesa, no muy nítida y bien teñida. Rf= 0,73 PM= 35.975 Da

Posible Proteína= Amilasa, degradación de proteínas glicoproteína ácida o fibronectina.

Banda 4: Banda no muy gruesa, nítida y no muy bien teñida. Rf= 0,76 PM= 31.623 Da

Posible Proteína= Posible Proteína= Anhidrasa Carbónica, Anhidrasa Carbónica o Adenosina Desaminasa proteínas degradadas (PM: 35.000 da) a o proteínas degradadas Banda 7: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,8 PM= 29.648 Da

Posible Proteína= Anhidrasa Carbónica o

degradación de proteínas

BSA

La albúmina se encuentra en gran proporción en el plasma sanguíneo conforma la proteína más importante del mismo. Sus funciones son tales como el transporte de ácidos grasos, calcio, cobre, algunas hormonas esteroidales y una gran variedad de fármacos, a parte de mantener la presión oncótica necesaria para la distribución correcta de los líquidos corporales entre el compartimente intravascular y el extracelular. La albúmina es sintetizada en del hígado y tiene carga eléctrica negativa, lo que impide la filtración glomerular a la orina Actualmente la albúmina de suero bovino (BSA) es una de las proteínas más ampliamente utilizadas en la industria médica (es un componente de drogas terapéuticas y de pruebas diagnósticas, sirve como estándar y diluyente, puede servir como buffer para estabilizar proteínas, anticuerpos y conjugados, entre otros). BSA
Proteína Albúmina Sérica PM (Da) 66.200 62.000

Banda 1: Banda gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,51 PM= 66.069 Da

Banda 1:

Prealbúmina

Banda gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,50 PM= 66,221 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica y puede que también Prealbúmina Banda 2: Banda delgada, no muy nítida y bien teñida.

Posible Proteína= Albúmina Sérica y puede que también Prealbúmina Banda 2: Banda delgada, no muy nítida y bien teñida.

Rf= 0,6 PM= 51.523 Da

Rf= 0,59 PM= 51.861 Da

Posible Proteína= proteínas degradadas, posible contaminación o quizás Prealbúmina Banda 3: Banda delgada, no muy nítida y bien teñida. Rf= 0,65 PM= 44.875 Da

Posible Proteína= proteínas degradadas, posible contaminación o quizás Prealbúmina Banda 3: Banda delgada, no muy nítida y bien teñida. Rf= 0,66 PM= 42.073 Da

Posible Proteína= proteínas degradadas o posible contaminación Banda 4: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,72 PM= 36.983 Da

Posible Proteína= proteínas degradadas o posible contaminación Banda 4: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,72 PM= 35.481 Da

Posible Proteína= degradación de proteínas Banda 5: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,77 PM= 32.211 Da

Posible Proteína= degradación de proteínas Banda 5: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,75 PM= 32.584 Da

Posible Proteína= degradación de proteínas

Posible Proteína= degradación de proteínas

Banda 6: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,81 PM= 28.840 Da

Posible Proteína= degradación de proteínas Banda 7: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,87 PM= 24.434 Da

Posible Proteína= degradación de proteínas

BILIS Proteína Ig M Ig A Ig G Mucina Aminopeptidasa N Haptoglobina Transferrina Hemopexina Albúmina Sérica Glicoproteína Ácida APF PM (Da) 850.000 160.000 150.000 122.078 109.517 100.000 80.000 80.000 66.200 44.000 7.00012.000

Bilis

La bilis es una sustancia líquida alcalina, amarillenta, de sabor amargo producida por los hepatocitos del hígado que interviene en los procesos de digestión. Su función es emulsionar los ácidos grasos (convertirlos en gotitas muy pequeñas que pueden ser atacadas con más facilidad por los jugos digestivos). Se almacena en la vesícula biliar, y se libera al duodeno tras la ingesta de alimentos. Cuando comemos, la bilis sale de la vesícula por las vías biliares al intestino y se mezcla con las grasas de los alimentos y estas son disueltas en el contenido acuoso del intestino. Después de este proceso, las enzimas del páncreas y de la mucosa intestinal las digieren.

Banda 1: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,36 PM= 100.000 Da

Posible Proteína= Aminopeptidasa N Banda 2: Banda delgada, no muy nítida y bien teñida. Rf= 0,44 PM= 80.069 Da Banda 1: Banda delgada, no muy nítida y no muy bien teñida. Rf= 0,45 PM= 76.384 Da

Posible Proteína= Aminopeptidasa N, Transferrina, Haptoglobina o Hemopexina. Banda 3: Banda gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,52 PM= 64.269 Da

Posible Proteína= Aminopeptidasa N, Transferrina, Haptoglobina o Hemopexina. Banda 2: Banda gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,52 PM= 62.661 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica Banda 4: Banda gruesa, no muy nítida y bien teñida. Rf= 0,64 PM= 46.132 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica Banda 3: Banda gruesa, nítida y bien teñida. Rf= 0,65 PM= 43.251 Da

Posible Proteína= Subunidad de la Haptoglobina (40 KDa) o Glicoproteína Ácida (que es sintetizada por el Hígado) Banda 5: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf=0,72 PM= 36.983 Da

Posible Proteína= Subunidad de la Haptoglobina (40 KDa) o Glicoproteína Ácida ( sintetizada por el Hígado) Banda 4: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,73 PM= 34.435 Da

Posible Proteína= degradación de proteínas Banda 6: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,87

Posible Proteína= degradación de proteínas Banda 5: Banda delgada, difusa y mal teñida. Esta banda no es representativa ni aporta mayor información debido a una tensión deficiente. Rf= 0,88

PM= 24.434 Da

PM= 22.491 Da

Posible Proteína= degradación de proteínas

Posible Proteína= degradación de proteínas

Líquido Pleural
LIQ. PLEURAL

Las dos capas de la pleura suelen estar separadas por una pequeña cantidad de líquido (1 a 15 ml) que facilita el movimiento de una contra la otra. Este líquido es producido por la pleura parietal y absorbido por la visceral según un proceso continuo. Se forma por filtración del plasma a través del endotelio capilar, a una velocidad controlada por la presión capilar. La reabsorción se efectúa a través de los capilares y de los linfáticos en la pleura visceral. Las proteínas no se reabsorben a través de los capilares vasculares, sino a través de los linfáticos.

Proteína Inmunoglobulina M B-Lipoproteína Fibrinógeno Inmunoglobulina A Inmunoglobulina G Lactato Deshidrogenasa (LDH) PCR B-Globulina Transferrina Albúmina α-1-Antitripsina Amilasa Glicoproteína ácida Trifosfato isomerasa Apo-D Anhidrasa carbónica

(PM (Da) 850.000 380.000 340.000 160.000 150.000 135.000 118.000 90.000 80.000 66.200 52.000 45.000 44.000 32.500 32.375 31.000 28.300 16.538

Banda 1: Banda gruesa, nítida y bien teñida Rf= 0,52 PM= 64.269 Da

Apo-Al

Lisosima

Banda 1:

Banda gruesa, nítida y bien teñida Rf= 0,51 PM= 64.417 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica Banda 2:

Posible Proteína= Albúmina Sérica Banda 2:

Banda gruesa, nítida y bien teñida Rf= 0,65 PM= 44.875 Da

Banda gruesa, nítida y bien teñida Rf= 0,65 PM= 43.251 Da

Posible Proteína= Amilasa o Glicoproteína Ácida

Posible Proteína= Amilasa o Glicoproteína Ácida

Muestra Problema

MUESTRA PROBLEMA Nº Banda 1 2 3 4 5 6 Rf 0,29 0,33 0,51 0,58 0,6 0,67 Log PM 2,084 2,036 1,82 1,736 1,712 1,628 PM (Da) 121.339 108.643 66.069 54.450 51.523 42.462

La Muestra Problema por definición corresponde a una sola proteína con un peso molecular específico. Nuestra labor es encontrar el valor de dicho peso molecular para deducir cuál podría ser nuestra Muestra problema.

Al analizar el carril de podemos ver varias bandas, pero sólo una de ellas es la que nos sirve, en este caso la primera pues es la más voluminosa, nítida y mayormente teñida.

Su peso molecular corresponde a 121.339 Da por lo que podemos inferir que se trata de:  Mucina de 122.078 Da  β-Globulina PCR de 118.000 Da  α-Galactosidasa de 116.250 Da De todas estas la más probable es la α-Galactosidasa ya que se encontraba en los estándares y por lo tanto es conocida por nosotros. Las otras 2 son menos probables porque al ser proteínas encontradas por cada grupo son en cierto sentido “subjetivas”, aunque claro, no son menos válidas. También cabe la posibilidad que no sea ninguna de las proteínas mencionadas pues existen un sin número de proteínas con pesos moleculares de 120 KDa aproximadamente el cual es el único dato que tenemos para la identificación de nuestra muestra problema.

Las otras bandas probablemente sean proteínas contaminantes o subunidades de nuestra muestra problema.

Discusión
Eficacia de la electroforesis A pesar de que la electroforesis nos permite separar proteínas, no es la mejor técnica para este fin. Para esto, la Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) es la técnica más usada para realizar la separación de proteínas. Esta técnica logra una separación de alta resolución; asimismo es una técnica muy específica y muy sensible. En ella, los materiales de las columnas están mucho más

finamente divididos que en las otras técnicas cromatográficas y, como consecuencia, hay más centros de interacción y, por lo tanto, mayor poder de resolución. Dado que la columna se construye de material más fino, se debe aplicar presión para obtener las velocidades de flujo adecuadas. El resultado es una alta resolución y velocidad. También se pudiera utilizar la Cromatografía de Afinidad, la cual es específica para cierta proteína y nos permite obtener una separación de gran pureza. Para esto es necesario saber con anterioridad la composición de la mezcla proteica. Ahora, ¿cómo podemos afirmar que una técnica está purificando de forma adecuada nuestra mezcla proteica? Para esto podemos utilizar la electroforesis, ya que nos permite visualizar las proteínas que se ubican dentro de una mezcla según su tamaño, por lo tanto podemos identificar la pureza de una mezcla proteica y sus pesos moleculares, pudiendo visualizar si la técnica utilizada, como la HPLC, está trabajando de forma correcta. También la electroforesis nos permite determinar la composición de una mezcla proteica de la cual no sabemos por cuales proteínas está compuesta. Para esto se realiza lo mismo que se hizo durante este laboratorio.

Aplicación clínica de la electroforesis La electroforesis (EF) es una buena técnica para determinar las proteínas que conforman una mezcla proteica según sus pesos moleculares, por lo que se puede determinar la presencia o ausencia de alguna proteína de una muestra de algún fluido. De esta manera podemos ver la presencia de signos de inflamación, proteínas y enzimas que se presentan en los fluidos en ciertas patologías, etc. Ejemplo: LCR El líquido cefalorraquídeo tiene una concentración muy baja para efectuar electroforesis y se debe concentrar 50 a 150 veces para poderla verificar. La cantidad total de proteínas depende del sitio de donde se toma la punción. De 5 a 15 mg/dL si es ventricular. De 15 a 25 mg/dL si es cisternal y de 15 a 45 mg/dL si es lumbar. La EF es de gran utilidad en la esclerosis múltiple, en la meningitis por criptococcus, en el síndrome de Guillain Barre y en el lupus eritematoso sistémico. De forma normal se encuentra una pre-albúmina en concentración del 2.3 a 6.9 % de la totalidad. De 5.2 a 8.7 % de albúmina. De Alfa1, 3.7 a 8.1 %.

Alfa2 de 4.2 a 8.8 %.Beta de 7.3 a 14.5 % y Gamma de 3.0 a 9.0 %.En la esclerosis múltiple el 90 % presenta bandas oligoclonales de IgG y pueden establecer un pronóstico, pues la esclerosis se disemina más a menudo en los pacientes que tienen bandas muy definidas. Proteínas plasmáticas Con el nombre de proteínas, se engloban casi el 100% de las sustancias sólidas que tiene el suero sanguíneo. Están integradas por la albúmina, molécula proteica pequeña importante para mantener la presión oncótica y transportar fármacos, hormonas, lípidos, etc. Y por las globulinas moléculas más grandes que se reconocen como alfa, beta y gamma. La electroforesis permite separarlas, dirigiéndose las partículas cargadas negativamente al ánodo o polo positivo y las positivas al negativo o cátodo. Para esto, la EF tiene una amplia aplicación clínica en multitud de afecciones. Normalmente se encuentran gráficamente representadas por la Albúmina, globulinas Alfa1 (HDL-alfa feto-proteina-alfa 1 antitripsina) Alfa 2 globulina (Haptoglobinas-Ceruloplasmina-Alfa 2 lipoproteinas VLDL-Alfa2 macroglobulinas-) Beta globulinas (Transferrina-Lipoproteina B-LDLComplemento-Hemopexina- Fibrinogeno) Gama globulinas (IgG-IgA-IgM-IgDIgE). Se obtienen patrones bien definidos en desnutrición -síndrome nefrótico - con niveles disminuidos de albúmina. Con niveles aumentados de alfa1 globulinas en enfermedad maligna crónica y neoplasias. Niveles disminuidos en enfisema pulmonar. Niveles aumentados de alfa2 globulinas en inflamación aguda y síndrome nefrótico. Niveles disminuidos en hemólisis. Niveles aumentados de beta1 globulinas, en trastorno lipoproteico y niveles disminuidos en desnutrición e hipoproteinemia. Además, gráficamente, se pueden apreciar patrones típicos de hepatitis severa - cirrosis - inflamación crónica - inflamación aguda agamaglobulinemia - alfa 1 antitripsina - gamapatia polinoclonal monoclonal - mieloma. Gammaglobulinas En la electroforesis de proteínas, se identifican 4 tipos de globulinas y una de ellas es la gammaglobulina integrada por anticuerpos que se llaman inmunoglobulinas. Se reconocen las inmunoglobulinas IgG- IgA- IgM- IgDIgE cada una de ellas con papeles específicos. Colocando el suero en una placa que contenga gel de agar y haciendo pasar una corriente a través del medio, las inmunoglobulinas se separan de acuerdo a su carga eléctrica. Se colocan anticuerpos específicos a lo largo de la placa y se identifican los diferentes tipos de inmunoglobulinas presentes, procedimiento que se denomina inmuno electroforesis. Esta es de utilidad extraordinaria en múltiples enfermedades e indicadoras del pronóstico de la lesión, en muchas ocasiones.

En sus valores normales La inmunoglobulina IgG comprende el 75 % de la totalidad de ellas. La IgA constituye el 15 % y las restantes en proporción menor, según la capacidad antigénica del paciente. La IgG integra la mayor parte de los anticuerpos circulantes. La IgA se encuentra principalmente en las secreciones del tracto gastrointestinal, saliva y lágrimas. La IgM es la encargada fundamentalmente de los grupos sanguíneos ABO y del factor reumatoide. La IgE interviene en la respuesta alérgica. La IgD es la fracción más pequeña y rara vez se evalúa o se detecta. La inmuno electroforesis se utiliza para detectar enfermedades de hipersensibilidad, deficiencias inmunes, enfermedades autoinmunes, infecciones crónicas, mieloma múltiple, infecciones virales crónicas e infecciones fetales intrauterinas.

CONCLUSIÓN

Aspectos generales En este práctico realizamos electroforesis en gel de poliacrilamida, aplicando el sistema de SDS - PAGE, con distintos líquidos orgánicos. La técnica electroforética en sí es bastante simple de realizar y altamente sensible para el análisis de proteínas, sin embargo, hay que tener presente ciertas condiciones para el desarrollo de este método, como por ejemplo, el pH del medio y su correspondiente tampón, el tiempo de electroforesis, el voltaje del campo electrico, la manipulación y elaboración de geles, el sembrado de las muestras, etc. Además, es necesario tener algunas precauciones con respecto a uso de la algunos reactivos, ya que utilizamos algunas sustancias neurotóxicas y se requería emplear sustancias frescas para la preparación de geles. Es necesario destacar que el proceso de polimerización de los geles de poliacrilamida se puede manipular experimentalmente, de manera que obtenemos un entrecruzamiento variable entre las fibras del polímero, obteniéndose así geles con distinto tamaño de poro. Esto me permite escoger el tipo de entramado tridimensional según el peso molecular de las proteínas que deseo separar para esta técnica. Para la preparación de los distintos fluidos orgánicos, utilizamos el sistema SDS – PAGE (electroforesis en poliacrilamida en presencia del detergente SDS). Esta técnica es una variante de la electroforesis y es un método sumamente ventajoso para la separación de las proteínas en un campo eléctrico, ya que el desplazamiento de éstas es independiente de su carga neta y su conformación tridimensional, separándose exclusivamente en función de su masa. Esto es debido a que el detergente SDS, junto con otros agentes reductores, desnaturaliza las proteínas e incorpora carga neta

negativa. De esta manera todas las proteínas presentes en la preparación serán atraídas por igual hacia el polo positivo, pero su desplazamiento será obstaculizado por el efecto del tamiz molecular del gel de poliacrilamida (tamaño de los poros). Para la detección de los distintos fluidos corporales utilizamos dos tinciones, azul de Coomassie y nitrato de plata. Durante el desarrollo experimental observamos que la tinción del gel con azul de Coomassie presenta algunas diferencias con respecto a la tinción con sales de plata, que es necesario mencionar. La tinción con azul de Coomassie no requiere de tanto procesamiento en comparación con la tinción argéntica, es decir, no necesita de tantos lavados del gel y su visualización es relativamente rápida. La tinción con este colorante no es específica hacia las proteínas, por lo tanto se une también al gel de poliacrilamida; sin embargo, la unión con las proteínas es mucho más fuerte observándose discretas bandas azules y un leve background en el gel. Una de las ventajas al utilizar esta tinción es que puede decolorarse y volver a teñir el gel con otro colorante si uno lo desea, es decir, su unión con las proteínas es reversible (no covalente). La tinción argéntica, aunque es mucho más dificultosa para realizar, es significativamente más sensible, ya que pueden distinguirse bandas claramente en el gel teñido con solución argéntica en comparación con el gel teñido con azul de Coomassie donde se hace un poco más dificultoso y en ocasiones casi no pueden distinguirse aquellas bandas más fina0073. Esto es a causa de que el nitrato de plata permite la detección de proteínas en un gel a concentraciones aproximadamente 100 veces más baja que aquellas teñidas con azul de Coomassie. La identificación de proteínas con este colorante está basado en la reducción diferencial de iones de plata a plata metálica, en donde la plata metálica se adsorbe sobre las cadenas de aminoácidos de las proteínas. Esta unión es irreversible, por lo tanto el gel no puede decolorarse, lo que constituye una desventaja al momento de querer realizar otro procedimiento. Es necesario destacar que, a diferencia del azul de Coomassie, se observó un background mucho mayor con la tinción argéntica, dificultándose relativamente la detección de las bandas proteicas.

Muestras de fluidos orgánicos Suero. Las proteínas plasmáticas presentan diferentes roles fisiológicos, como por ejemplo cumplen un papel nutritivo, son agentes de trasporte de metabolitos, hormonas, lípidos; son catalizadores, anticuerpos, proteínas de la coagulación, etc., y además mantienen la presión oncótica de la sangre y el balance ácido – básico de la sangre. En la electroforesis pudimos detectar diversas proteínas que se encuentran normalmente en la sangre (transferrina, albúmina), aunque es necesario

destacar que la albúmina es la proteína más abundante del plasma (39-51 g/l) y esto se observa claramente en la banda que corresponde a la albúmina. Tanto con la tinción con azul de Comassie como con la tinción argéntica, se distingue una banda gruesa y marcada. El déficit de albúmina da resultado de un grave desequilibrio en la presión oncótica vascular y se observa en enfermedades como la ascitis, nefropatía o enteropatía. La transferrina es la beta globulina principal y transporta iones férricos y es captada por receptores de eritrocitos y otras células. En el suero normal, la transferrina se halla en concentraciones de 200 – 400 mg/dl. Su disminución es a causa de déficit de fierro y su saturación crónica indica hemocromatosis y hemosiderosis. La alfa-1-glucoproteína ácida se encuentra en el suero aproximadamente entre 40 y 105 mg/dl, y suele estar aumentada en procesos inflamatorios y neoplasias. Aparentemente ambas muestras de suero serían normales, sin embargo es necesario conocer más datos clínicos del paciente, ya que existen proteínas que varían según edad, sexo o gestación, para lograr realizar un diagnóstico definitivo.

Líquido cefalorraquídeo. Es un fluido que se forma en los plexos coroideos ventriculares y su volumen aproximado es de 90 a 150 ml. La mayoría de las proteínas séricas pueden encontrarse en el LCR, aunque las concentraciones de prealbúmina y transferrina en el LCR son relativamente elevadas, comparadas con las del plasma. El aumento en la concentración de proteínas es indicador de meningitis supurada, hemorragia cerebral y procesos que cursan con obstrucción aracnoidea. La proteinorraquia se observa en casos de tumores, encefalitis, neumonia, meningitis, etc. En el caso de la albúmina su aumento puede ser indicador de tumores medulares y en general en todos los síndromes de comprensión medular. En los geles de electroforésis se encontró, además de la albúmina, una banda bien marcada cercana a los 48 Kda y podría corresponder a las siguientes proteínas: La globulina Gc cumple la función de fijar la vitamina D, que migra como alfa-1-globulina. Alfa-1-globulina, que corresponde a una proteína que se encuentra normalmente en es suero y se carateriza en amentar su concenrtración en procesos de inflamación aguda. Sin embargo su funcionalidad exacta se desconoce. GOT o AST es una transaminasa cuya concentración suele estar alterada en la ictericia, infartos al miocardio, en metástasis al miocardio, embolias, trombosis y en diversas afecciones musculares

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Aunque el aumento en la concentración de proteínas tiene valor diagnóstico para detectar procesos infecciosos, hemorrágicos, endocrinos, metabólicos, tóxicos, etc., es necesario realizar un método cuantitativo para la medición de sus componentes, además de una observación macro y microscópica de esta muestra junto con las características del paciente (edad, sexo, etc). Por lo tanto, la electroforesis no sería el método principal para detectar patologías en este líquido. Es necesario enfatizar, que todas las proteínas de la sangre atraviesan las paredes de los capilares cerebrales por difusión pasiva (difusión molecular) hacia el líquido cefalorraquídeo. De acuerdo con las leyes de la difusión, las moléculas más grandes, difunden más lentamente en el intercambio y subsecuentemente forman un gradiente de concentración sangre al LCR más amplio que las moléculas más pequeñas.

Líquido ascítico. Normalmente la cavidad peritoneal contiene 75-100 ml de líquido claro de color pajizo, que facilita la función lubricante normal de la membrana. La ascítis es la acumulación del líquido libre por ultrafiltración del plasma, en el interior de la cavidad peritoneal, y aparece formando parte de algunas enfermedades, como la cirrosis, la insuficiencia cardiaca congestiva, la nefrosis o una carcinomatosis diseminada. Los valores normales de proteínas son de 1-2 g/dl, pero en algunas enfermedades esta concentración de proteínas puede verse alterada, pudiendo adquirir caracteres de trasudado (<2,5 g/dl, es considerado trasudado y se presenta en algunas enfermedades como la cirrosis), o exudado, como la peritonitis. Observando nuestra muestra de líquido ascítico, existen algunas bandas proteicas que podrían orientarnos a un diagnóstico, y son las siguientes: La fibronectina aumenta en la ascítis maligna, y se puede observar que la banda en los geles es bastante gruesa con la tinción de nitrato de plata (aunque es necesario comparar la muestra con un control) El interferón gamma se detecta en procesos de inflamación crónica colinesterasa desciende en los trastornos hepáticos y se incrementa en la tuberculosos o en los casos de neoplasias o tuberculosis El incremento de amilasa sugiere de alteraciones extrapancreáticos, como por ejemplo neoplasias ginecológicas, quiste ovárico, carcinoma pulmomar,etc La Haptoglobina normalmente se combina con la hemoglobina por la lisis de los eritrocitos, para mantener el hierro corporal y los depósitos proteicos. Sin embargo, su concentración puede se aumentada en estrés, infección, inflamación aguda, y disminuida en procesos hemolíticos. La adenosina desaminasa (ADA) cuando se encuentra elevada es muy útil para el diagnóstico de peritonitis tuberculosa. Alfa-1-glucoproteína ácida es una proteína reactante de la fase aguda, aunque se encuentra normalmente en el suero (40 – 105

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mg/dl), en elevadas concentraciones es signo de una respuesta al estrés o estados inflamatorios. Anhidrasa carbónica. En la naturaleza se encuentran varias formas de anhidrasa carbónica. En la más estudiada, anhidrasa carbónica-tipo α, presente en animales. La función primaria de la enzima en animales es interconvertir el dióxido de carbono y el bicarbonato para mantener el equilibrio ácido-base en la sangre. Fosfatasa alcalina se encuentra diseminada normalmente en el suero, procedente fundamentalmente de los huesos y el hígado, aunque también está presente en otros tejidos. Esta proteína puede aumentar su concentración en el embarazo, en los niños en crecimiento, en cánceres (metástasis osteoblásticas y hepáticas), ictericia obstructiva, cirrosis biliar, hematomas, diabetes con degeneración hepática, pudiendo encontrarse algunos niveles aumentados en el líquido ascítico. Amilasa, enzima cuyo valor diagnóstico está relacionado con enfermedades hepáticas (pancreatitis, tumores y traumatismos) y extrahepáticos (neoplasias ginecológicas, quiste ovárico, carcinoma pulmonar) Es importante destacar que muchas de estas proteínas se encuentran normalmente en el líquido ascítico, pero las alteraciones de sus concentraciones pueden orientarnos al diagnóstico. Podemos inferir, que esta muestra puede ser patológica afectada por un proceso inflamatorio o infeccioso. Sin embargo, faltan muchos más datos para poder orientar a un diagnóstico definitivo y además necesitamos comparar este fluido con un control negativo y positivo. Debemos, en conclusión, medir las concentraciones proteicas de estos fluidos, para distinguir si hubo un aumento o disminución de estas sustancias en el líquido ascítico.

Bilis. La bilis corresponde a un líquido digestivo espeso, secretado por el hígado y almacenado en la vesícula biliar. Este líquido realiza dos funciones importantes: Desempeña un papel importante en la digestión y absorción de grasas gracias a los ácidos grasos. Estos ayudan a emulsionar las grandes partículas de grasa de los alimentos, a las que convierten en partículas que son atacadas por las lipasas. Los ácidos grasos también favorecen la absorción de los productos finales de la digestión de grasas a través de la mucosa intestinal. Además, la bilis sirve como medio para la excreción de varios productos de desecho importantes procedentes de la sangre, entre los que se encuentran la bilirrubina y el exceso de colesterol. Los componentes principales de la bilis corresponden a sales biliares, bilirrubina, colesterol, lecitina y los electrolitos habituales del plasma. En el gel de electroforesis pueden observarse las siguientes bandas que corresponderían posiblemente a las siguientes proteínas: la haptoglobina , cuya función es combinarse con la hemoglobina liberada por la lisis de los eritrocitos. La

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haptoglobina aumente en respuesta al estrés, a la infeccion, inflamación aguda o la necrosis mística. Disminuye en enfermedad hepática, anemia hemolítica y anemia megaloblástica. La hemopexina es una proteína que se encarga del transporte de grupos hemo. Es muy similar a la haptoglobina en cuanto a su diagnóstico en procesos patológicos, pero la haptoglobina puede diagnosticar la hemólisis en un estado precoz. Albúmina, que corresponde al principal componente de la bilis normalmente. Sin embargo puede disminuir en enfermedades hepáticas como la cirrosis. La glicoproteína ácida es una proteína cuya síntesis primitiva es en el hígado y cumple muchísimas funciones, entre ellas corresponde a una reactante de la fase aguda (mencionada anteriormente), pero también cumple funciones de transporte y metabolismo de la progesterona; además fija algunos fármacos. También puede ser que esta banda corresponda a proteínas degradadas, ya que algunos agentes utilizados para el procesamiento de las muestras son agentes desnaturalizantes. Aminopeptidasa N. se secreta en la bilis y se incrementa en la obstrucción biliar en la obstrucción biliar, en patologías hepáticas y pancreáticas, incluyendo tumores de estas localizaciones.

Líquido pleural. Se clasifica el líquido pleural según sea un ultrafiltrado plasmático en una pleura sana (trasudado) o un componente con similares características al plasma en una pleura enferma, con permeabilidad o drenaje linfático alterados (exudado). Podemos observar que en ambos geles se observa muy pocas bandas, lo que podría inferirse que la muestra está pura y correspondería a un trasudado.

Muestra problema (MP ). De acuerdo a nuestras observaciones, esta muestra correspondería a una solución purificada de la solución estándar, ya que se observan muy pocas bandas, y las más destacable es aquella que coincide con la beta- galactosidasa. La beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es una enzima que hidroliza la lactosa en sus monómeros glucosa y galactosa, al escindir el enlace b 1-4 del azucar. Se conoce que la leche, por su alto contenido en lactosa, no puede ser asimilada por cierto grupo de personas, pues les ocasiona trastornos digestivos a causa de que no sintetizan betagalactosidasa (Bayless et al., 1971). Pueden hacerserse algunas observaciones con respencto a las bandas (además de aquellas mencionadas en resultados):

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La primera banda podría corresponder a la proteína C reactiva del suero (118.000-144.000 da) y es reconocida dada a que su concentración aumenta en fase aguda. Se observa una segunda banda que podría corresponder a albúmina La ultima banda, de menor peso molecular, podría corresponder a alfa -1 – antitripsina, la cual también es una reactante de la fase aguda.

Resúmen 1. La técnica SDS- PAGE es un método de análisis de proteínas que nos permite comprobar la pureza de una solución proteica y determinar el tipo de proteína. Como todo instrumento científico, posee ciertas limitantes (manipulación y elaboración de los geles, sembrado correcto, con la aplicación del voltaje, tinción etc.), por lo tanto requiere también de experiencia es su manejo para disminuir los los falsos positivos y negativos. 2. Es posible obtener información de interés clínico a través de esta técnica, mediante la observación de bandas en las distintas sustancias y su posterior comparación con un estándar, todo esto con el objetivo de calcular su peso molecular mediante la fórmula Rf. 3. Las diferentes tinciones presentan ventajas y desventajas, a partir de las cuales evaluar el uso de una u otra tinción de acuerdo a las necesidades experimentales. Es decir, por ejemplo, una tinción argéntica me permite detectar aquellas muestras proteicas poco concentradas o purificadas. 4. La muestra problema estándar es similar al estándar real, aunque purificada. 5. La electroforesis entrega la presencia o no de proteínas en diferentes soluciones proteicas, pero es necesario complementar con técnicas cuantitativas para poder orientar el diagnóstico de una patología. Esto es, porque existen proteínas que se encuentran normalmente en los fluidos, pero su alteración en su concentración orientan a un diagnóstico más certero. 6. Se pueden sacar inferencias sobre los tipos de proteínas en los fluidos estudiados, o también deducir que la muestra estaba contaminada, proteínas degradadas o patológica. En el último caso, si bien es posible intentar hacer un diagnóstico, hay que recordar que el diagnóstico parte por el examen del paciente, por lo que un diagnóstico certero. Generalmente esta clase de estudio se pide cuando hay una sospecha de patología.

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