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NORMA TCNICA NTC-ISO

COLOMBIANA 5667-16


2000-12-15




CALIDAD DEL AGUA.
MUESTREO. PARTE 16. GUA PARA EL ENSAYO
BIOLGICO DE MUESTRAS










E: WATER QUALITY. SAMPLING. PART 16. GUIDANCE ON
BIOTESTING OF SAMPLE


CORRESPONDENCIA: esta norma es equivalente (EQV) a la
ISO 5667-16: 1998

DESCRIPTORES: agua; ensayo biolgico; muestreo;
calidad del agua.

















I.C.S.: 13.060.01

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC)
Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435


Prohibida su reproduccin










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nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.

La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica
est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo
caracterizado por la participacin del pblico en general.

La norma NTC-ISO 5667-16 fue ratificada por el Consejo Directivo el 2000-12-15.

Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma que
pertenece al Comit Tcnico 000016 Gestin ambiental. Agua, a travs de su participacin en
Consulta Pblica

ACEITES Y GRASAS VEGETALES
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A.
AMBIENCOL INGENIEROS LTDA.
ANTEK LTDA.
ASOCIACIN COLOMBIANA DE INGENIEROS
DE PETRLEOS
BAVARIA S.A.
CARVAJAL S.A.
CEMENTOS BOYAC S.A.
CERVERIA LEONA S.A.
COMPAA NACIONAL DE VIDRIOS S.A.
DAMA
ECOPETROL
EMAC LTDA.
EMPRESA DE ACUEDUCTO Y
ALCANTARILLADO DE BOGOT
EMPRESAS PBLICAS DE MEDELLN
GASEOSAS COLOMBIANAS S.A.
GOBERNACIN DE CUNDINAMARCA-
SECRETARA DEL MEDIO AMBIENTE
GRIFFITH COLOMBIA S.A.
ICA
IDEAM
INCOLBESTOS S.A.
INGEOMINAS
INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO-
IVON BERNIER LABORATORIO
LARKIN LTDA.
MINIPAK LTDA.
MINISTERIO DE AGRICULTURA
MINISTERIO DEL MEDIO AMBIENTE
MINISTERIO DE DESARROLLO
MINISTERIO DE MINAS Y ENERGA
MINISTERIO DE SALUD
MINISTERIO DE TRANSPORTE
NESTL DE COLOMBIA S.A.
PRODUCTOS ALIMENTICIOS MARGARITA
S.A.
SIEMENS SOCIEDAD ANNIMA
SIKA ANDINA S.A.
SMURFIT CARTN DE COLOMBIA S.A.
SOCIEDAD DE ACUEDUCTO, ALCANTARILLADO
Y ASEO DE BARRAANQUILLA
TEFCO LTDA.
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
UNIVERDIDAD DE LA SALLE
UNIVERSIDAD JAVERIANA
UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO






UNIVERSIDAD LIBRE
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA


ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIN DE NORMALIZACIN




NORMA TCNICA COLOMBIANA NTC-ISO 5667-16

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CALIDAD DEL AGUA.
MUESTREO. PARTE 16. GUA PARA EL
ENSAYO BIOLGICO DE MUESTRAS








1. OBJETO

Esta norma ofrece una gua prctica acerca del muestreo, tratamiento previo, desempeo y
evaluacin de las aguas en el contexto del ensayo biolgico. Se brinda informacin acerca de
cmo enfrentar los problemas del ensayo biolgico que surjan como consecuencia de la
naturaleza de la muestra de agua y la adaptabilidad del diseo del ensayo.

Se tiene como propsito dar a conocer experiencia prctica en cuanto a las precauciones que
se deben tomar por medio de la descripcin de mtodos probados con xito para solucionar o
evitar algunos de los problemas experimentales del ensayo biolgico de las aguas.

En la medida de lo posible, se ha hecho referencia a normas internacionales y parmetros
existentes. Tambin se utiliz informacin extrada de documentos publicados o de
comunicacin oral.

Se trataron principalmente problemas relacionados con la sustancia, en cuanto a muestreo,
tratamiento previo y preparacin de las muestras de agua para ensayo biolgico y tratamiento
de las muestras durante el ensayo, en especial al realizar ensayos con aguas y aguas
residuales que contienen ingredientes inestables o removibles. Se delinearon los principios
bsicos de aseguramiento de la calidad, evaluacin de datos y presentacin de resultados.

Se pone especial nfasis en el ensayo ecotoxicolgico con organismos (ensayo biolgicos de
especies nicas). Algunas caractersticas tratadas en esta gua general se aplican lo mismo
para estudios de biodegradacin como de bio-acumulacin en tanto se relacionan con el
muestreo y la preparacin de muestras. Tambin se discute la preparacin de sustancias con
poca solubilidad y el ensayo ms all del lmite de solubilidad del agua.

Esta norma no es aplicable al examen bacteriolgico del agua. En otras normas internacionales
se describen los mtodos adecuados


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2. REFERENCIAS

Las siguientes normas contienen disposiciones que, a travs de la referencia en este texto,
constituyen disposiciones de la presente norma. En la fecha de su publicacin, las ediciones
indicadas se hallaban vigentes. Todas las normas se encuentran sujetas a actualizacin, y se
invita a las partes que logren a acuerdos con base en la presente norma a indagar sobre la
posibilidad de aplicar las ediciones ms recientes de las normas indicadas a continuacin. Los
miembros de la IEC e ISO mantienen registros de las normas internacionales vigentes en la
actualidad.

NTC-ISO ISO 5667-3: 1994, Water Quality. Sampling. Part 3: Guidance on the Preservation
and Handling of Samples

NTC-ISO 5667-10: 1992, Water Quality. Sampling. Part 10: Guidance on Sampling of Waste
Waters


3. MUESTREO

3.1 GENERALIDADES

La escogencia de puntos de muestreo representativos, frecuencia de muestreo, tipo de
muestras tomadas, etc. depende del objetivo del estudio. En general, el mtodo de muestreo
para anlisis qumico es compatible con el propsito del ensayo biolgico.

No obstante, algunos ensayos requieren de una particular manipulacin y conservacin del
agua y agua residual.

De acuerdo con el tipo de investigacin (por ejemplo, ensayos de toxicidad o biodegradacin) y
la forma en que se vayan a procesar las muestras, se hace necesario dividir la muestra en
diferentes partes que se preservan y/o almacenan bajo diversas condiciones y se procesan de
variadas maneras.

Si se han tomado varias muestras (por ejemplo, de diferentes lugares o en diversos tiempos) se
pueden combinar a fin de lograr mayor representatividad. Es recomendable mezclar estas
muestras por completo y, de ser necesario, dividirlas en sub-muestras. A fin de obtener sub-
muestras de igual calidad, se debera garantizar que la muestra a granel mantenga la
homogeneidad durante el proceso de sub-muestreo, por ejemplo, por medio de sacudida o
agitacin. Esto es especialmente vlido en el caso de las mezclas de dos fases, por ejemplo,
aguas que contienen partculas suspendidas, suspensiones algales. Se recomienda emplear
aparatos de muestreo de enfriamiento al combinar varias muestras tomadas en diferentes
tiempos.

3.2 MUESTREADORES/RECIPIENTES/CONTENEDORES

El volumen, la forma y el material de los recipientes depende de la naturaleza de la muestra
(por ejemplo, degradabilidad/estabilidad), la cantidad de repeticiones, el volumen requerido
para estos ensayos y la necesidad de preservar y almacenar las muestras antes del
procesamiento adicional.

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Se aconseja reducir al mximo el tiempo requerido para la congelacin y el deshielo por medio
de la reduccin del volumen de la muestras, es decir, el tamao del recipiente. En general,
resulta adecuado emplear recipientes de un litro para la congelacin. Para ensayos que
requieran mayores volmenes, se recomienda dividir la muestra en recipientes que contengan
menos de 10 l.

El volumen total de la muestra tomada debera ser suficiente para cubrir cualquier ensayo
complementario o repetido. Se recomienda guardar las submuestras restantes almacenadas
congeladas por separado hasta que se realice la evaluacin final.

El material de los recipientes debera ser qumicamente inerte, de fcil limpieza y resistente al
calentamiento y congelacin. Se recomiendan los recipientes de virio, polietileno o
politetrafluoroetileno (PTFE).

3.3 ESTADO DE LLENADO DE LOS CONTENEDORES

Se aconseja decidir si se llenan los contenedores por completo hasta el borde o slo en forma
parcial, contando con un espacio de aire, teniendo en cuenta el tipo de muestra, el modo de
preservacin y el ensayo biolgico contemplado.

Los problemas relacionados con el llenado parcial pueden ser:


- Agitacin intensificada durante el transporte, que conduce a la degradacin de las
partculas adicionadas;

- interaccin con la fase de gas, que conlleva al arrastre;

- oxidacin de sustancias, que conduce, por ejemplo, a la precipitacin de
compuestos de metales pesados.

Los problemas relacionados con el llenado completo pueden ser:


- agotamiento del oxgeno, con posible descomposicin, que conduce a la
formacin de metabolitos txicos (por ejemplo, nitrito, sulfuro);

- deterioro de la homogenizacin debido a la sacudida o agitacin del volumen total.


Los contenedores de muestras, cuando se contempla la congelacin para la preservacin, no
deberan llenarse por completo a fin de permitir la expansin del volumen.


4. TRANSPORTE

Se recomienda proteger las muestras recogidas de la fragmentacin, incremento de la
temperatura y contaminacin externa. Se aconseja evitar la identificacin errnea de las
muestras transportadas en hielo por medio de marcadores y/o rtulos a prueba de agua.

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5. PRESERVACIN Y ALMACENAMIENTO

Como se establece en la norma ISO 5667-3, resulta imposible emitir reglas absolutas para la
preservacin, por ejemplo, la duracin del posible almacenamiento y la eficiencia de varios
modos, puesto que estos aspectos dependen principalmente de la naturaleza de la muestra, en
especial de su actividad biolgica.

Por lo general, las aguas potables y las freticas son menos susceptibles a las reacciones
biolgicas y qumicas que las aguas superficiales, aguas residuales crudas o tratadas. Si la
composicin qumica se puede anticipar en forma aproximada, se recomienda hacer referencia a
la norma NTC-ISO 5667-3 para los propsitos del ensayo biolgico. Sin embargo, se deben
considerar algunas precauciones adicionales como se indica a continuacin.


- Es aconsejable procesar las muestras para ensayo biolgico preferiblemente sin
demora luego de la recoleccin a fin de evitar cambios en la composicin original
como resultado de las reacciones fsicas y qumicas y procesos biolgicos o
ambos. La duracin mxima de almacenamiento no debera exceder las 12 h a
temperatura ambiente (mximo 25 C). Se recomienda conservar las muestras en
la oscuridad a fin de evitar el crecimiento de algas.

- Si no es posible realizar el ensayo inmediatamente despus del muestreo (o
preparacin de la muestra), por ejemplo, al preparar muestras compuestas, se
aconseja el enfriamiento o congelacin.

- La forma ms comn y recomendada de preservar muestras de agua residual
consiste en enfriarlas a una temperatura entre 0 C y 5 C. Al enfriarse en esta
escala y almacenarse en oscuridad, la mayora de muestras permanece estable
de manera normal hasta durante 24 h (vase la norma ISO 5667-10). El
enfriamiento debera comenzar tan pronto como sea posible despus del
muestreo, ya sea en campo, por ejemplo en cajas fras con hielo, o en un
refrigerador en el vehculo de transporte.

- La congelacin debe ser inferior a 18 C, de acuerdo con la norma ISO 5667-10
para permitir en general un incremento en la conservacin. Por lo general, los
perodos de almacenamiento mximo van de unas cuantas semanas a dos meses
dependiendo de la estabilidad de las muestras.

- La experiencia ha demostrado que la calidad del agua residual puede afectarse
durante la congelacin y el deshielo.

- Se aconseja excluir el uso de preservativos biocidales para el propsito del ensayo
biolgico. Tampoco se recomienda la adicin de cidos muy concentrados o
bases para estabilizar las muestras, por ejemplo, HCl NaOH.

- Se debera enfatizar que, si existe duda, el analista qumico y el tcnico del
ensayo biolgico deberan consultarse entre s antes de decidir acerca del mtodo
de manipulacin y preservacin de las muestras. Si no son compatibles las
tcnicas de preservacin para el anlisis qumico y para el ensayo biolgico, se
deberan proporcionar submuestras separadas para los diferentes propsitos.

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6. APARATO Y EQUIPO

6.1 SELECCIN DEL APARATO

El tipo, la forma y el material del equipo tcnico dependen del ensayo y la naturaleza de la
muestra. Todos los materiales que entran en contacto con la muestra de ensayo deben ser tales
que las interferencias causadas por sorcin o difusin del material de ensayo, por elusin de
materia extraa (por ejemplo plastificantes) o por crecimiento de organismos, se mantengan en
un nivel mnimo. Resultan convenientes los materiales inertes, por ejemplo, el vidrio, PTFE. Las
conexiones de tubos deberan ser lo ms cortas posibles y se recomienda cambiarlas
peridicamente. Se aconseja evitar la contaminacin del material de ensayo, debido por ejemplo,
a la grasa de rectificado proveniente de tapones o accesorios. No resultan convenientes los tubos
hechos de cobre, aleacin de cobre o plsticos no-inertes.

6.2 SILIZACIN

Con el propsito de reducir al mximo la adsorcin del material de ensayo en los contenedores,
tuberas, vidrios o plsticos se puede silizar (siliconizar) por medio de inmersin o enjuague en
una solucin de fraccin masiva al 5 % de diclorodimetilsilano en cloroformo o heptano. A medida
que el solvente orgnico se evapora, el silano se deposita en la superficie, la cual debera
enjuagarse muchas veces con agua o calentarse a 180 C durante 2 h antes de usarse. Se
aconseja emplear la silizacin slo si se van a ensayar ingredientes del agua o sustancias de alta
adsorcin y no se encuentra disponible material inerte adecuado (por ejemplo, PTFE).

6.3 LIMPIEZA DE APARATOS Y EQUIPO

Antes de usarse, se recomienda limpiar el aparato y el equipo con adecuados agentes de
limpieza, por ejemplo, cido clorhdrico, hidrxido de sodio, detergentes, etanol, cido
sulfrico/perxido de hidrgeno y, siempre que sea adecuado, se esterilizan trmica o
qumicamente (por ejemplo, con solucin de hipoclorito). No se aconseja emplear cido
cromosulfrico.

El enjuague repetido del aparato con agua destilada (o agua con el mismo grado de pureza),
garantiza que no hayan quedado vestigios del agente de limpieza o desinfeccin.

A fin de remover los vestigios del uso anterior, se recomienda el lavado con cido antes del
lavado final con agua destilada.


7. TRATAMIENTO PREVIO Y PREPARACIN DE MUESTRAS

7.1 GENERALIDADES

El siguiente diagrama de flujo (vase la Figura 1) contiene informacin sobre trminos
comnmente empleados (aunque algunas veces en forma diferente) en las normas y parmetros
del ensayo biolgico.

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Figura 1. Preparacin de las muestras para bioensayo

La muestra, es decir una sustancia qumica, es una preparacin, slida o en solucin, una
mezcla de varias sustancias, agua o agua residual. La muestra de ensayo se elabora a partir de
la muestra por medio de varios pasos especficos de la toma de muestra y el ensayo, por
ejemplo, por medio de disolucin, homogenizacin, sedimentacin, filtrado, neutralizacin o
aeracin. Se adiciona agua de dilucin para preparar una serie de diluciones definidas. El medio
de ensayo (incluyendo la muestra de ensayo) se obtiene luego de la adicin del medio nutriente.

El lote de ensayo final se obtiene por medio de la adicin de organismos de ensayo, que en el
caso de microorganismos, se llama inculo. En el lote de control o, en varios lotes paralelos, se
preparan los controles a partir de una mezcla de agua de dilucin y solucin nutriente con
organismos de ensayo sin muestra de ensayo.

Cuando el efecto o el comportamiento de una sustancia se conoce a partir de ensayos previos
(sustancia de referencia) y cuando dicha sustancia se examina dentro del marco de una serie
de ensayos como muestra de ensayo, esto se denomina lote de referencia.

7.2 DESHIELO

Se aconseja deshelar las muestras almacenadas congeladas antes de su uso. Se recomienda el
agua corriente o un bao de agua caliente a una temperatura que no exceda los 25 C, junto con
una suave sacudida, a fin de evitar el sobrecalentamiento local.

Resulta esencial el deshiele de las muestras antes de usarse, puesto que el proceso de
congelacin puede tener el efecto de concentrar algunos componentes en la parte interior de la
muestra que se congela en ltimo lugar. El tratamiento con microondas involucra el riesgo de
sobrecalentamiento.
Muestra, (ejemplo: sustancia,
agua (residual))
Muestra para ensayo, (ejemplo:
sustancia disuelta, agua residual
neutralizada)
Etapa preparatoria, ejemplo: disolucin,
homogeneizacin, filtrado, neutralizacin, aeracin
Agua de dilucin
Medio nutriente
Medio de ensayo
incluyendo muestra
para ensayo (diluida)
Medio de control
excluyendo muestra para
ensayo
Organismos de ensayo,
inculo.
Lote de ensayo Lote de control

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7.3 HOMOGENEIZACIN

Es recomendable asegurar una distribucin uniforme de todos los componentes solubles y
particulados. Se puede aplicar una agitacin suave, una sacudida vigorosa, tratamiento
ultrasnico o dispersin mecnico de alta velocidad, de acuerdo con la naturaleza de las
muestras. Durante este paso del tratamiento, se debera prestar atencin a la prdida potencial
de ingredientes voltiles.

Como regla general, se debera tener cuidado de que el estado original de la muestra se restaure
o por lo menos se altere lo mnimo posible.

7.4 SEPARACIN DE MATERIA SOLUBLE Y PARTICULADA

En general, los ensayos biolgicos se realizan con la muestra original. Sin embargo, en algunos
casos, grandes cantidades de materia particulada, lodo y sedimento interfieren con los requisitos
comportamentales de los organismos de ensayo (atascamiento de agallas de peces, deterioro del
filtro de alimentacin de dahpnids, limitacin ligera de algas).

Si no se quiere que estos efectos deletreos se reflejen en los resultados del ensayo, se pueden
evitar o superar dichas interferencias por diferentes medios.

Las aguas ricas en partculas pueden dar origen a interferencias, por ejemplo, al realizar
cuantificacin por medio de un contador de partculas. De igual manera, el conteo microscpico
se ve bastante deteriorado. La dosificacin continua se considera poco confiable debido al
atascamiento y bloqueo de la tubera.

Sin embargo, la filtracin, la centrifugacin y otros mtodos de separacin involucran el riesgo de
que los componentes activos, que se adhieren a las partculas, sean removidos antes del
ensayo. Adems, se deben tener en cuenta los problemas relacionados con la filtracin, por
ejemplo la adsorcin y lixiviacin en materiales de filtro. La sedimentacin y centrifugacin evitan
estos problemas. Al realizar ensayos en presencia de partculas que causen problemas severos,
se recomienda permitir que la muestra se asiente durante de 30 min a 2 h se lleva a cabo una
filtracin gruesa (>50 m), removiendo as solo partculas gruesas. La masa de la partcula
separada puede examinarse por separado.

Algunos de los mtodos de ensayo ofrecen la posibilidad de determinar un factor de correccin
para parmetros tales como la turbidez.

Las aguas ricas en bacterias interfieren en los ensayos relacionados con actividad de bacterias,
por ejemplo, la inhibicin de la respiracin. Por lo menos en forma parcial, se puede dar cuenta
de la interferencia debida a la actividad de las bacterias en la muestra, por medio del ejercicio de
controles convenientes. Al ensayar algunas algas, cardmenes de peces pequeos o cultivos
celulares, las infecciones bacteriales pueden causar interferencia. Todos los mtodos de
esterilizacin disponibles, tales como el tratamiento trmico o UV o la filtracin de la membrana
(0,2 m) involucran un alto riesgo de efectos secundarios. Cuando es necesario el filtrado es
preferible la filtracin de fibra de vidrio. Generalmente, la centrifugacin, por ejemplo 10 min a 4 500 g
1 500 g, es preferible a la filtracin.

7.5 CONCENTRACIN PREVIA

La concentracin previa de las muestras incrementa la concentracin no solo de sustancias
peligrosas sino tambin de otros constituyentes del agua, los cuales pueden ser deletreos en
altas concentraciones.

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Adicionalmente resulta esencial tener en cuenta que en cualquier caso la concentracin previa es
selectiva segn del procedimiento aplicado, lo cual altera el patrn de composicin original de los
ingredientes del agua, por ejemplo:


- La extraccin lquido / lquido con solventes orgnicos y la extraccin de fase
slida por medio de la adsorcin de slidos (por ejemplo las resinas XAD) resultan
particularmente eficientes para los componentes hidrofbicos del agua. La
intensidad inica y la presin osmtica pueden atenuarse. Se pueden excluir los
iones txicos, los qumicos polares y los ingredientes coeficientes de agua (por
ejemplo, el enmascaramiento), tales como cidos hmicos.

- La evaporacin y la congelacin-secado pueden conllevar a prdida de sustancia
voltiles y aumentar la intensidad y la presin osmtica;

- La ultrafiltracin puede conducir a una prdida especialmente de pequeas
molculas que penetran la membrana.


El incremento en la concentracin por encima del umbral de solubilidad puede conducir a la
precipitacin o floculacin de sustancias disueltas previamente.

La acumulacin biolgica no se puede simular por medio de la concentracin previa de muestras,
puesto que los factores de bioconcentracin (BCF) no pueden relacionarse o extrapolarse.

Algunos ingredientes de la muestra de agua que se est concentrando pueden experimentar
reacciones qumicas a una tasa superior a la de la muestra original.

Se pueden obtener valores adecuados blancos slo si se encuentran disponibles muestras de
referencia descontaminadas, por ejemplo aguas arriba de la fuente de contaminacin. Es
permisible el incremento en la salinidad al preparar blancos con igual osmolaridad y composicin
inica similar (por ejemplo, la proporcin Na:K).

No es posible extrapolar a partir de ensayos agudos con muestras concentradas previamente
hasta los efectos crnicos de la muestra original.

Por consiguiente, es preferible escoger un sistema de ensayo ms sensible o prolongar el tiempo
de exposicin en vez de realizar previa concentracin de la muestra. Si no existe mtodo
sensible disponible para ensayar la muestra original y se aplica un procedimiento de
concentracin previa, el resultado es ms discutible entre mayor sea el factor de concentracin.

Por las razones mencionadas anteriormente, por lo general los ensayos para toxicidad aguda y
crnica con muestras concentradas previamente son insignificantes y no se recomiendan. En
todos los casos, los resultados de ensayo obtenidos con muestras de agua previamente
concentradas deberan interpretarse con extrema precaucin. Las investigaciones preliminares
de este tipo no pueden normalizarse y deberan validarse por medio de investigaciones
extensivas adicionales.

7.6 AJUSTE DEL pH

La seleccin del valor del pH al cual se debe ajustar la muestra se rige por el objetivo del ensayo,
es decir:


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- El ajuste del pH del agua de recibo producir resultados ms representativos del
efecto de los txicos una vez se hallan en el ambiente;

- El ajuste de un pH definido entre 6 y 9 (el cual generalmente es tolerable para la
biota) permitir la expresin de txicos ionizables que de otra manera seran
enmascarados por las condiciones de pH por fuera de esta escala.


Por lo general, se neutralizan las muestras con valores pH extremos que exceden los lmites de
tolerancia de los organismos de ensayo. Se recomienda omitir la neutralizacin si el efecto del pH
se va a reflejar en el resultado del ensayo o si se observa modificacin fsica o reacciones
qumicas (por ejemplo, precipitacin) debido al ajuste del pH. La concentracin del cido o base
requerida para la neutralizacin debe ser tal que la modificacin del volumen sea la menor
posible. Se aconseja evitar el paso del punto neutral.

No es recomendable que el agente de neutralizacin experimente una reaccin con los
ingredientes en la muestra, que pudiera, por ejemplo, conducir a la precipitacin o al
acomplejamiento. Adems, no se debera influenciar el organismo de ensayo por medio de la
ampliacin o inhibicin. Por lo general, se recomiendan las soluciones de cido clorhdrico o
hidrxido de sodio.

7.7 PREPARACIN DE SOLUCIONES DE PARTIDA Y LOTES DE ENSAYO

7.7.1 Sustancias solubles en agua

Al preparar la solucin de partida, la porcin pesada de la sustancia no debera exceder la
cantidad mxima por disolver (<concentracin de saturacin). Por medio de la agitacin o
calentamiento o ambos, se puede ampliar la cintica de la solucin. No obstante, esto no debiera
conducir a la prdida de sustancia o descomposicin trmica de la muestra de ensayo.

7.7.2 Emulsiones y suspensiones estables en agua residual

En el caso de las emulsiones (por ejemplo, las emulsiones de aceite de corte) y las suspensiones
(por ejemplo leche de ltex) que son estables en agua y tambin con las sustancias que forman
estas entidades estables con agua, se recomienda preparar diluciones graduadas.

Si no se obtiene una distribucin homognea en el licor de partida, se recomienda agitar o
sacudir la mezcla hasta por un da.

7.7.3 Sustancias con poca solubilidad

7.7.3.1 Generalidades

Las sustancias con una solubilidad en agua inferior a aproximadamente 100 mg/l deberan
considerarse como escasamente solubles. Al examinar sustancias con poca solubilidad, se debe
garantizar que no permanezca materia no disuelta como sedimento, como partculas flotantes o
en forma dispersa. Por lo tanto, a fin de asegurar resultados reproducibles, se deben emplear
mtodos que aseguren la mejor distribucin homognea del compuesto de ensayo en el lote.

En el caso de ensayos de toxicidad, es aconsejable indagar si la sustancia tiene efectos en la
escala de su solubilidad en el agua. Se debera tener presente que en el caso de ciertas
sustancias puras algunas veces existe traslape entre sistemas dispersos-moleculares y
micelares, y dispersos coloidales hasta dispersos separados (por ejemplo surfactantes de
ismero puros). En el caso de las mezclas de ismero, por ejemplo, surfactantes, no existe lmite

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de solubilidad de sustancia-especfica. Los mtodos pticos simples (por ejemplo, las mediciones
de dispersin luminosa) no permiten ninguna determinacin confiable del grado de dispersin.

Resulta imposible recomendar un mtodo nico para generar una solucin ptima o distribucin
de las sustancias en el medio, puesto que el mtodo seleccionado debera corresponder a las
propiedades fsicas de la sustancia. Por tal razn se debe dejar la seleccin de un mtodo
adecuado a disposicin del investigador de acuerdo con su experiencia o del fabricante segn la
informacin de la produccin.

La siguiente gua se deriva de la experiencia prctica y contiene sugerencias acerca de las
formas y medios que posibilitan al investigador, luego de sopesar los pros y los contras,
seleccionar el mtodo ms conveniente.

7.7.3.2 Ensayo en la escala de solubilidad del agua

Para este propsito, se mezcla una porcin pesada definida de la sustancia (por ejemplo 100 mg)
por medio de agitacin o sacudida con 1 litro de agua destilada aproximadamente durante 24 h,
preferiblemente en la oscuridad. Debe indicarse la porcin pesada para preparar el licor de
partida. Siguiendo la separacin de la fase, se separa por completo la fase no disuelta por medio
de filtracin (cuando sea necesario se emplea un filtro de membrana, de tamao de poro de 0.2 m)
o por centrifugacin. Se prepara la serie de dilucin con la fase acuosa. De comprobarse necesario,
segn las propiedades de la sustancia (por ejemplo, la alta viscosidad o descomposicin en el
agua), se deberan considerar tiempos menores o mayores de mezcla, probablemente
involucrando el empleo de agentes auxiliares.


Nota. Dependiendo de las sustancias por ensayarse, las tcnicas de centrifugacin y filtracin pueden conducir a
diferentes resultados.


Si se reduce la solubilidad a travs de la adicin de componentes medios (por ejemplo, sales
nutrientes), resulta ventajoso preparar una solucin saturada mezclando la sustancia con el
medio de ensayo. En casos individuales, se debe considerar el remplazo de las sales (por
ejemplo, iones de Ca Mg) por otros (por ejemplo, iones de Na K), que no se precipitan.

Se puede lograr una distribucin fina de fluidos altamente viscosos por medio de la fragilizacin a
bajas temperaturas (por ejemplo, empleando nitrgeno lquido) seguida por aplastamiento
mecnico (por ejemplo en molinos batidores).

Se deben recocer los filtros para la recoleccin de constituyentes no disueltos (filtros
inorgnicos). Los filtros orgnicos, por ejemplo de policarbonato, requieren de tratamiento
repetido en agua destilada en ebullicin con el propsito de garantizar que no se transfieran
componentes del material de filtro en la solucin de ensayo. No se recomiendan los filtros de
acetato de celulosa. Segn el material del filtro, no solo se puede capturar constituyentes sin
disolver por filtracin, sino que la sustancia de ensayo disuelta tambin puede eliminarse por
medio de la sorcin. A concentraciones <1mg/l esto puede conducir a una considerable prdida
de sustancia. La prdida puede reducirse descartando la primera porcin del filtrado. El empleo
de materiales de filtros inorgnicos, en general, conducir a prdidas menores que las obtenidas
con filtros orgnicos.

Existe una variedad de medios mecnicos y qumicos para alcanzar la concentracin de
saturacin. No obstante, se aconseja tener en mente que debera darse preferencia a auxiliares
mecnicos para la preparacin de soluciones saturadas. Slo en casos excepcionales se debera
recurrir a auxiliares qumicos (cidos, bases, solventes).
Los auxiliares que se pueden emplear para alcanzar la concentracin de saturacin son:

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a) Rectificador de velocidad alta/sonicacin (ventaja: mayor velocidad de disolucin;
desventajas: separacin de fase ms difcil, posible descomposicin y
calentamiento por medio de la entrada de energa). En la norma ISO 10634 se
ofrecen mayores detalles.

b) Incremento de la temperatura (ventaja: por lo general mayor solubilidad y mayor
velocidad de disolucin; desventajas: incremento de volatilizacin, riesgo de
descomposicin y reacciones de hidrlisis, posibilidad de sobresaturacin con el
resultante retraso de precipitacin). No es aconsejable enfriar las soluciones
saturadas.

c) Empleo de cidos/bases con la resultante neutralizacin (ventaja: explotacin de
mayor solubilidad de forma protonada; desventajas: slo es aplicable en casos
excepcionales, cuando existe extremo riesgo de que los valores de pH sufran
modificacin qumica en la muestra de ensayo, por ejemplo por medio de
hidrlisis, algunas veces tal vez muy lento establecimiento de equilibrio siguiente
a la neutralizacin, por ejemplo, los cidos grasos / jabones).

d) Disolucin de la sustancia en un solvente voltil, no acuoso, miscible (por ejemplo,
n-hexano ter de petrleo) que se desactiva despus de mezclar con agua
(ventaja: distribucin fina rpida de la sustancia de ensayo; desventajas: la
sustancia de ensayo tambin puede arrastrarse, los residuos de solvente lentos en
el lote de ensayo no pueden evitarse).

e) Disolucin de la sustancia en un solvente no txico, miscible en agua (por ejemplo,
etanol, acetona, acetonitrilo, dimetil sulfxido, dimetil formamida). Al seleccionar el
solubilizador, se deben tener en cuenta su capacidad de solubilizacin, toxicidad,
degradabilidad y su volatilidad. Los agentes solubilizantes (concentracin <0,1 g/l)
inicialmente permanecen durante algn tiempo en el lote de ensayo. Es
improbable que conduzcan a un mayor incremento en la concentracin de
saturacin en el agua; en cambio, conllevan a la rpida distribucin fina de la
sustancia de ensayo en el licor de partida. Se hace necesario un lote de control
adicional con la concentracin mxima del solvente empleado en el ensayo.
Incluso si no se han observado efectos de deterioro, no se puede excluir el hecho
de que la presencia del solvente afecta la accin de la sustancia del ensayo en los
organismos del mismo, por ejemplo, ayudndole a atravesar la pared de la celda.

f) Sorcin de la sustancia sobre un portador inerte. Se puede preparar una solucin
acuosa saturada por medio de la aplicacin de la sustancia, cuando sea
necesario, empleando un solvente voltil tal como el n-hexano o el ter de petrleo
en un transportador inerte (por ejemplo, perlas de vidrio, slica gel, resinas de
cromatografa). Esta solucin se introduce en un sistema de flujo continuo y se
enjuaga con agua. Con frecuencia las sustancias disolventes se encuentran como
soluciones genuinas dispersas molecularmente.

7.7.3.3 Ensayo por encima del lmite de solubilidad. En estudios de degradacin, las sustancias
poco solubles eventualmente se ensayan por encima del lmite de solubilidad. Es importante
alcanzar una tasa de distribucin alta en la materia no disuelta a fin de asegurar un rea de
contacto amplia entre los microorganismos y la sustancia. Siempre es necesario sacudir o agitar
los lotes de ensayo en todo el ensayo con el propsito de garantizar una disolucin constante de
la sustancia. Se recomiendan los siguientes mtodos.

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a) Dosis directa

Se introduce la sustancia directamente en el lote de ensayo. Las platinas de
microscopio resultan convenientes para la introduccin de sustancias slidas o
lquidos de alta viscosidad. Los solventes miscibles en agua, no txicos, no
degradables, por ejemplo, dimetil sulfxido, se emplean a menudo como
solubilizadores (vase numeral 7.7.3.2. Esta tcnica se restringe a sustancias de
ensayo no voltiles.

b) Tratamiento ultrasnico

Con frecuencia, el tratamiento con ultrasonido (por ejemplo, 20 kHz, 30 min)
puede conducir a una dispersin mecnica suficientemente estable que, luego de
aprox. 15 min a 30 min de sedimentacin, puede distribuirse directamente a lotes
de ensayo individuales. Son necesarios mtodos analticos adecuados, por
ejemplo, el de Carbn Orgnico Total (TOC) o el anlisis especfico para
determinar la concentracin inicial del lote de ensayo.

c) Adsorcin de la sustancia sobre un portador inerte

Esta debera estar de acuerdo con los procedimientos delineados en el numeral 7.7.3.2
(adsorcin de la sustancia sobre un portador inerte). El portador con la sustancia
de ensayo aplicada en forma homognea ahora hace parte del lote de ensayo.
Este mtodo no es conveniente para sustancias voltiles, puesto que se eliminan
durante la aplicacin y subsecuente secado del portador.

d) Dispersin de las sustancia con un agente emulsificante

Los agentes emulsificantes de la concentracin empleada (100 mg/l) deberan
ser no txicos y estables durante el perodo de ensayo. Se pueden emplear las
siguientes sustancias como agentes emulsificantes:

- monolaurato de sorbitol y polietileno;

- trioleato de sorbitol y polietileno;

- nonilfenol-20 EO-acetal (muy adecuado para ensayos de degradacin);

- aceite de ricino modificado (menos adecuado para ensayos de
degradacin)

- copolmeros de xido de etileno/xido de propileno (adecuado para
ensayos de degradacin)

A fin de preparar una emulsin qumicamente estable, se recomienda mezclar la sustancia de
ensayo con el agente emulsificante antes de introducirla en el agua. En caso de que se emplee
un solvente voltil no miscible en el agua adicional (por ejemplo n-hexano o ter de petrleo) para
la preparacin de una emulsin, se recomienda arrastrar la muestra de ensayo tratada
previamente antes de introducir el organismo de ensayo.

Las sustancias slidas con poca solubilidad por lo general no se ensayan por encima de su lmite
de solubilidad. Los ensayos de toxicidad por encima de dicho lmite son solo aconsejables para
sustancias slidas de rpida dispersin y sustancias slidas comercializadas como dispersiones o
que entran en contacto con agentes emulsificantes cuando se emplean adecuadamente.

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Los estudios de bioacumulacin y los ensayos biolgicos no deberan realizarse por encima del lmite de
solubilidad.

La propensin de una sustancia a dispersarse en el agua depende sobre todo de su densidad, su
viscosidad y su tensin superficial. Al incrementar la entrada de energa, se puede lograr un
tamao de partcula menor y por lo tanto, a menudo, una mayor estabilidad de la dispersin. No
obstante, existen indicaciones de que el efecto de deterioro de una emulsin tambin se ve
influenciado por el tamao de las gotitas emulsificadas. Es probable que se encuentren
disponibles diferentes recorridos para que los organismos capten las partculas emulsificadas de
las sustancias disueltas.

Con frecuencia las dispersiones mecnicas son inestables. Algunas veces la separacin de la
fase puede evitarse por medio de la agitacin constante, sacudida u otro modo de mezclar la
muestra de ensayo durante el mismo. Se debera tener cuidado para evitar cualquier dao
mecnico a los organismos de ensayo.


Nota. Las gotitas de aceite y pelculas superficiales pueden tener efectos deletreos sobre los organismos,
especialmente en los daphnids. Es posible evitar el contacto de estos con las pelculas superficiales por medio de la
separacin mecnica mediante redes / tamices u oscurecimiento de la superficie.

Se puede valorar la estabilidad de las emulsiones por observacin visual, anlisis qumico (por
ejemplo, Carbn Orgnico Disuelto (DOC)/TOC; y por mediciones de turbidez. En principio, se da
prioridad a las dispersiones preparadas en forma mecnica sobre las realizadas con agentes
emulsificantes.

Existen dos maneras de producir una serie de dilucin a partir de una dispersin de partida con
agentes emulsificantes:

- manteniendo una concentracin constante del agente emulsificante;

- manteniendo una proporcin de concentracin constante de sustancia de ensayo
a agente emulsificante.

Generalmente, se debera preferir mantener la misma concentracin del agente emulsificante en
todos los lotes de ensayo a fin de asegurar que la proporcin concentracin-efecto dependa
solamente de la concentracin de la sustancia del ensayo, con lo que se evita la degradacin de
la emulsin en diluciones ms altas. Siempre es necesario un lote de control adicional con la
mxima concentracin del emulsificador.

Al interpretar los resultados, se debera tener presente que los efectos observados son efectos
combinados, incluso si el emulsificador en s no muestra ningn efecto en el lote de control.

7.7.3.4 Problemas especiales con mezclas de sustancia o productos tcnicos. Al ensayar sustancias
con subingredientes txicos de rpida solubilidad (por ejemplo, el tetrabutil estao contaminado con
xido de tributil estao ) y mezclas de sustancias poco solubles (por ejemplo, productos de aceite
mineral), se pueden enriquecer los componentes de ms rpida solubilidad en el extracto acuoso.
Con frecuencia esto se hace evidente por un alza en el DOC con incremento de porcin masiva en la
presencia de una fase no disuelta ya existente. Con el propsito de registrar efectos de esta clase, se
recomienda preparar una solucin acuosa saturada adicional y ensayarla con una proporcin mayor
de mezcla (por ejemplo, 0,1 g 1 g de sustancia por litro de agua). La comparacin de los hallazgos
obtenidos con varias proporciones de mezcla puede indicar los efectos de componentes de rpida
solubilidad de una mezcla heterognea.

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Como alternativa a este procedimiento, es aconsejable ensayar mezclas de sustancias que no
presenten rpida solubilidad y sustancias con componentes menores de rpida solubilidad por
medio de la preparacin de una serie de extractos acuosos en la que la tasa de carga disminuya
geomtricamente. Los extractos acuosos deberan ensayarse de forma no diluida y el resultado
debera referirse no a la concentracin en la fase acuosa sino a las tasas de carga. Es importante
observar que los extractos acuosos no se deberan diluir.

Puesto que la composicin qumica de la fraccin disuelta de las mezclas con frecuencia vara
considerablemente desde el producto original, es aconsejable examinar los efectos del producto
original en forma dispersa (vase el numeral 7.7.3.3).


8. TRATAMIENTO DE MUESTRAS DURANTE EL ENSAYO

8.1 AIREACIN

Debera darse cuenta de la demanda de oxgeno de animales de ensayo y microorganismos
heterotrficos por ejemplo por medio de la aireacin continua o intermitente. En casos especiales,
por ejemplo en aguas residuales con una demanda de oxgeno bioqumico extremadamente alta
(BOD), es necesario suministrar oxgeno puro en vez de aire. Se recomienda evitar la
sobresaturacin. Los problemas de arrastre de voltiles y perdidas de sustancias por espumado
pueden evitarse mediante mtodos especiales (vase el numeral 10.1.3)

8.2 SUSPENSIN

La materia particulada contenida en el agua puede suspenderse durante el ensayo si no se
anticipan interferencias (vase el numeral 7.4). Los microorganismos planctnicos deberan
mantenerse en suspensin durante el ensayo mediante mtodos apropiados, por ejemplo, por
sacudida, agitacin, rotacin, aireacin.

Se debera tener cuidado a fin de evitar el deterioro mecnico de los organismos de ensayo.

8.3 AJUSTE Y CONTROL DEL pH

En algunas circunstancias (por ejemplo, debido a la aireacin) el pH se desviar incluso si la
muestra se ha neutralizado previamente. El ajuste y control del pH durante el ensayo deberan
decidirse de acuerdo con la causa de la desviacin del pH y el objetivo del ensayo. La desviacin
abitica del pH puede distinguirse mediante un lote sin organismos.

A partir de la opinin del analista y el regulador puede ser deseable trabajar con un sustancia en
un estatus qumico constante claramente definido. Se debera evitar o contrarrestar el incremento
en el nivel del pH, debido a problemas prcticos, por ejemplo despojamiento de CO
2
por
aeracin.

Esto es especialmente importante para el cambio dependiente del pH de la toxicidad del pescado
con amonaco ionizado y no ionizado. Otros ejemplos de sustancias que presentan toxicidad
dependiente del pH son los sulfuros, cianuros, aminas, fenoles y cidos orgnicos.

Sin embargo, si el cambio en el pH durante el ensayo es un efecto de los procesos vitales
fundamentales tales como la fotosntesis en el crecimiento de las algas, la cual es necesaria junto
con el consumo de CO
2
, resulta razonable no ajustar el pH.

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Una transicin permitida sobre una amplia escala no slo intensificara la aplicabilidad y el valor
indicativo del ensayo, sino que tambin ofrecera la oportunidad de activar el efecto de un
compuesto qumico que, de otra forma, podra no haberse detectado.

El incremento del valor de pH en los ensayos con algas puede reducirse por varios medios, a
saber:


- adicin de amortiguador;

- adicin de carbonato;

- adicin de CO
2
gaseoso;

- incremento del intercambio de gas mediante aeracin o sacudida, o ambas.

- limitacin de la luz;

- imitacin de nutrientes;

- limitacin de temperatura;

- limitacin de la duracin del ensayo;

- reduccin del inculo


Todas estas opciones tienen efectos y consecuencias secundarios indeseados, por ejemplo, la
reaccin con un compuesto de ensayo, la precipitacin, arrastre de voltiles, complicacin del
diseo del ensayo, limitacin de crecimiento, problemas de medicin. En general, el intercambio
optimizado de gas y la conduccin de ensayos en los lmites inferiores de luz y temperatura
reducirn el problema.

Se puede lograr el control del valor pH en ensayos de peces mediante la adicin de dixido de
carbono o cido clorhdrico o conduciendo ensayos bajo concentraciones de CO
2
atmosfricas
especficas. El ajuste del pH durante el ensayo requiere de regulacin de retroalimentacin
separada para cada recipiente de ensayo.


9. GUA GENERAL EN CUANTO AL DISEO DEL ENSAYO

9.1 PREPARACIN DE DILUCIONES

Por razones fisiolgicas, no se pueden llevar a cabo los ensayos biolgicos que emplean
organismos acuticos usando agua desionizada como medio. Dependiendo de la naturaleza del
anlisis, se recomienda emplear agua de grifo libre de cloruro, agua fresca sinttica o agua de
mar (posiblemente con aditivos nutrientes), agua fretica o superficial. Esta ltima es menos
adecuada para investigaciones toxicolgicas pero ms indicada para investigaciones ecolgicas,
por ejemplo, para valorar la capacidad para soportar carga del agua en relacin con la situacin
local (adaptacin de carga existente).

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Si no se emplea un medio sinttico estandarizado, ser necesario ajustar la dureza del agua, el
pH y, posiblemente, la proporcin molar especfica de iones de calcio a iones de magnesio al
realizar ensayos de toxicidad especfica de la sustancia. Para algunos ensayos con organismos
marinos, es esencial el empleo de agua marina natural.

Se combinan las cantidades definidas de la muestra con los volmenes correspondientes del
agua de dilucin con el propsito de brindar la concentracin deseada de la dilucin.

Se emplea como agua de la dilucin el agua especificada en la norma adecuada. Por lo general,
se utilizan niveles de concentracin progresiva en series geomtricas.

9.2 ENSAYOS DE LMITE Y DEFINICIN DE LA ESCALA

No es necesaria una serie de dilucin cuando solo se desea averiguar si una concentracin
determinada o nivel de dilucin presenta algn efecto (ensayo de lmite).

Resulta conveniente en un ensayo de definicin de escala preliminar con pocos organismos de
ensayo determinar primero la serie aproximada de concentraciones efectivas, y slo despus
conducir el ensayo principal. Las muestras inestables (por ejemplo de agua residual) pueden
alterar las propiedades durante el tiempo necesario para el ensayo preliminar. En este caso se
aconseja realizar el ensayo principal de inmediato, posiblemente con gradaciones preliminares
sobre una amplia serie de concentracin.

9.3 ENSAYOS COMPLEMENTARIOS

Cuando, en casos particulares, las concentraciones seleccionadas no cubren completamente la
serie de concentraciones efectivas, se aconseja repetir el ensayo o conformar una serie de
ensayos complementarios. En este caso, por lo menos dos concentraciones deberan ser
idnticas con dos de las series de ensayos precedentes. Solo es posible una evaluacin conjunta
de las dos series de ensayos si las concentraciones graduadas no presentan variaciones
mayores que las existentes entre los lotes paralelos dentro de una serie. Los ensayos
complementarios no son practicables en el caso de aguas y aguas residuales sujetas a
alteracin.

9.4 LOTES DE REFERENCIA Y CONTROL

Para cada ensayo, se recomienda examinar uno o, cuando sea apropiado, varios lotes de control
paralelos (vase el numeral 9.5). Los lotes de control o de referencia deberan ser idnticos al lote de
ensayo, pero no deberan contener los ingredientes por ensayarse. A fin de identificar las
interferencias posibles en el curso del ensayo y excluir organismos de ensayo inconvenientes, se
aconseja ensayar una sustancia de efecto conocido (sustancia de referencia) a intervalos regulares.
En el caso de los experimentos animales que requieren autorizacin, se debera mantener en el
mnimo la cantidad de lotes paralelos y de referencia. Las sustancias que se emplean con frecuencia
en ensayos de toxicidad son, por ejemplo, dicromato de sodio, 3,5-diclorofenol.

9.5 LOTES PARALELOS/RPLICAS

9.5.1 Generalidades

Al ensayar rplicas para cada nivel de concentracin / dilucin, se hace posible obtener
observaciones independientes bajo condiciones que de otro modo seran idnticas. Las
condiciones marginales tales como la temperatura y luz deberan ser iguales y constantes en la
medida posible. A fin de equilibrar las diferencias restantes, es aconsejable no reorganizar las
rplicas en disposicin colateral.

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Notas:

1) Repeticin de mediciones: Al realizar varias mediciones del mismo lote de ensayo (por ejemplo, diversos
conteos de un nico lote en el ensayo de algas), estas no son observaciones verdaderamente independientes
(rplicas) y, ms bien, sirven para corregir imprecisiones en la medicin. En dichos casos, es posible
determinar el valor medio de las repeticiones y emplearlo como el mejor valor nico en clculos estadsticos.
En el caso del ensayo de inhibicin de crecimiento de algas, consecuentemente se pueden considerar los
lotes paralelos como rplicas verdaderas, independientemente del nmero de muestras que se tomaron de
ellos.

2) Pseudorplicas: Si, por ejemplo, en un ensayo de reproduccin de Daphnia, se mantienen varios animales en
un recipiente, lo cual si
gnifica que la cantidad de prole generada se puede determinar slo por recipiente ( y no por animal), el nmero de
observaciones independientes (rplicas) corresponde al nmero de recipientes y no al nmero de animales.


La cantidad de lotes paralelos a menudo es restringida debido a la reduccin del tiempo, espacio
o recursos financieros. Adicionalmente, en el caso de los ensayos con animales vertebrados, es
imperativo que el nmero de animales de ensayo se mantenga en el mnimo por razones ticas.

Un requisito adicional para determinar la cantidad de lotes paralelos por nivel de concentracin y en
experimentos de control es el tipo de la evaluacin propuesta del ensayo (vase el numeral 12).

9.5.2 Concentraciones de umbral (NOEC/LOEC)

En contraste con los ensayos de lmite (vase el numeral 9.2), las concentraciones de umbral
(NOEC/LOEC, vase el numeral 12.3.1) se determinan por medio del anlisis de la varianza
(ANOVA) (por ejemplo, el ensayo de Dunett) a fin de reconocer si una concentracin especfica
produce un efecto importante.

La cantidad requerida de rplicas depende de la varianza del punto final, la cantidad y la distancia
entre los pasos de concentracin y la magnitud de la diferencia del efecto entre el lote de ensayo
y el experimento de control, verificada estadsticamente a un nivel de importancia determinado.
Por lo general, se recomienda que el nmero de lotes de control sea mnimo dos veces el de
rplicas por nivel de concentracin / dilucin o incrementado por p, donde p es el nmero de
concentraciones de ensayo.

9.5.3 Relacin concentracin/respuesta

Al determinar la relacin concentracin/respuesta, resulta de importancia decisiva para el diseo
del ensayo el tipo de datos de punto final, es decir, si se determinan variables de respuesta
(cualitativas) o mtricas (cuantitativas).

La mortalidad (o inmovilidad) de los organismos de ensayo determinada en el ensayo agudo es
una variable de respuesta comn.

En contraste, las variables mtricas presentan incrementos continuos, es decir un gradiente de
respuesta. Las variables mtricas tpicas son, por ejemplo, la longitud del cuerpo o la biomasa,
las tasas metablicas, las tasas de produccin o consumo de oxgeno o de transformacin
enzimtica. La cantidad de animales jvenes producidos tambin puede considerarse como
variable mtrica aproximada.

En el caso de variables mtricas, se evalan los resultados en cuanto con los niveles de
concentracin/dilucin individual en relacin con los lotes de control. Por lo tanto, se debera
prestar especial atencin a fin de garantizar la confiabilidad estadstica de los controles.

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Al determinar las variables de respuesta, se deben incluir las observaciones relacionadas
directamente en la relacin de concentracin / respuesta. Por lo tanto, no es necesario que el
nmero de rplicas en el experimento de control sea superior a los lotes de ensayo.

Por lo general, al determinar la relacin de concentracin-respuesta, es aconsejable reducir el
nmero de paralelos en los lotes de ensayo e incrementar la cantidad de niveles de
concentracin. Esto es permisible puesto que los puntos de medicin adyacentes en una serie de
dilucin de estrecha graduacin pueden apoyarse mutuamente entre s. El mnimo son dos
rplicas por nivel de concentracin.

Los pasos adyacentes de concentracin no deberan establecerse con demasiada estrechez, a
fin de evitar que las concentraciones efectivas sean virtualmente idnticas debido a la variabilidad
del sistema de ensayo.


10. GUA ESPECIAL EN CUANTO A LA REALIZACIN DEL ENSAYO

10.1 PROBLEMAS Y MEDIDAS PREVENTIVAS PARA MUESTRAS QUE CONTENGAN
INGREDIENTES REMOVIBLES

10.1.1 Generalidades

Los componentes de una muestra de agua pueden perderse en el sistema de ensayo por varias
razones:


- evaporacin de sustancias voltiles;

- biodegradacin;

- degradacin abitica (por ejemplo, hidrlisis, fotlisis);

- sorcin hacia o en materiales del recipiente, en especial en el caso de ingredientes
hidrofbicos;

- espumado de agentes superficiales-activos;

- precipitacin;

- floculacin.

En estos casos, las fracciones de sustancia empleadas en los sistemas de ensayo no se
encuentran disponibles para los organismos a un nivel constante a lo largo del ensayo.

Un ensayo preliminar con o sin organismos de ensayo puede ayudar a clarificar cul trayecto de
eliminacin es el responsable de la prdida de sustancia. Las mediciones comparativas de
concentracin, por ejemplo, de parmetros de suma, pueden revelar los mecanismos de prdida.
La comparacin de


- un recipiente abierto con uno cerrado ofrece una indicacin de las prdidas por
evaporacin;

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- una muestra expuesta con una no expuesta a la luz indica la extensin de la
degradacin fotoltica;

- un recipiente de ensayo sin tratar con uno salinizado indica perdida de sorcin.

- una muestra contaminada [por ejemplo con cloruro de mercurio (II) u otro
contaminante inorgnico adecuado[ posibilita un clculo de eliminacin por medio
de biodegradacin.

Sin embargo, la prdida de sustancia durante el ensayo biolgico puede deberse simplemente a
la adsorcin y acumulacin en los organismos de ensayo o adsorcin de partculas de alimentos.
En estos casos, los organismos todava se encuentran expuestos en forma sustancial, aunque
solo una fraccin de la sustancia pueda determinarse analticamente en el agua. Se puede
explicar si ocurren prdidas de sustancia reales o simuladas, mediante anlisis comparativos de
lotes con o sin organismos y alimentacin.

Estas representan indicaciones de que, en el caso de los microorganismos (por ejemplo,
bacterias de algas), la sensibilidad del sistema de ensayo disminuye con el incremento de la
densidad del organismo. La prdida de sustancias puede compensarse mediante dosis
subsecuentes o, mejor, por medio de sistemas semi-estticos o de flujo continuo a fin de evitar la
acumulacin de metabolitos en el sistema de ensayo.

Sin embargo, existen lmites, en el caso de sustancias poco solubles a partir de los cuales no se
pueden preparar soluciones de partida con suficiente concentracin.

10.1.2 Volatilizacin

Las sustancias voltiles se arrastran con rapidez desde el sistema de ensayo en especial en los
mtodos de ensayo que requieren aeracin,. En tales casos, se debera considerar el empleo de
sistemas de ensayo cerrados o de flujo continuo. Se aconseja tener presente que, por ejemplo en
el caso del ensayo de inhibicin de multiplicacin celular con bacterias o algas, se debera
garantizar un intercambio de gas suficiente.

En el caso de sustancias txicas voltiles, se debera asegurar que no exista riesgo para el
personal que conduce el ensayo.

10.1.3 Espumado

En la superficie de un lquido se acumulan sustancias superficiales-activas y tienden a formar
burbujas cuando se airea el lote de ensayo.

Mediante el incremento de la proporcin superficie: volumen (recipientes de ensayo planos) o,
siempre que sea apropiado, por medio de un ventilador para airear la superficie, se puede
garantizar el suministro de oxgeno necesario sin formacin de espumado.

El empleo de agentes anti-espumado conduce a una interaccin impredecible con la sustancia de
ensayo y por lo general se debera evitar excepto en casos especiales (por ejemplo, estudios de
biodegradacin).

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10.1.4 Adsorcin

Las sustancias hidrofbicas pueden adsorberse en las paredes del recipiente y luego - en
especial en concentraciones bajas - dejar de ser biodisponibles por completo. A fin de evitar
prdidas grandes de sustancia, se recomienda incubar los recipientes durante mnimo 30 min con
la muestra en la concentracin considerada antes del ensayo, la cual es desechada luego, y
subsecuentemente llenar el recipiente con la muestra fresca con el propsito de preparar el lote
de ensayo.

La silanizacin de los recipientes puede reducir la capacidad de sorcin de la superficie de la
pared. No obstante, slo se puede recomendar si no se cuenta con ningn otro material inerte y
si se puede garantizar que no lixivie ninguna silicona residual (vase el numeral 6.2).

10.1.5 Precipitacin/floculacin

Durante el ensayo puede ocurrir precipitacin del material de ensayo, debido a las reacciones con
componentes del medio nutriente (por ejemplo, iones de calcio) en especial cuando el pH cambia en
el lote de ensayo. Las mediciones para mantener un pH constante (vase el numeral 8.3) pueden
ayudar a evitar esta interferencia.

10.1.6 Degradacin

Los ingredientes pueden experimentar diferentes tipos de degradacin, a saber biolgica,
hidroltica o fotoltica, durante el ensayo. Esto puede conducir a la formacin de productos
secundarios (metabolitos) cuya toxicidad es diferente del producto original.

Con frecuencia es difcil evitar la biodegradacin en sistemas de ensayo estticos, puesto que los
organismos de ensayo tales como pescado y otros no se pueden separar de sus bacterias
acompaantes.

En ciertos casos, por ejemplo en el ensayo del pescado, se puede aplicar una temperatura de
ensayo inferior que conlleve a la reduccin de la biodegradacin si se puede cambiar la especie
del pescado (por ejemplo, trucha arco iris en vez de pez cebra).

En ensayos de bacterias, la biodegradacin a menudo es inherente al sistema y se refleja por los
incrementos con respecto al criterio del ensayo (por ejemplo, la tasa de consumo de oxgeno, la
proliferacin celular). En algunos casos, se pueden emplear sistemas de flujo continuo.
Normalmente, los colectores trmicos evitan la dispersin de la infeccin bacterial de retorno a la
tubera.

10.1.7 Hidrlisis

Algunos ingredientes (por ejemplo, los isocianatos, steres, anhdridos) se hidrolizan en el agua,
lo cual significa que en el curso del ensayo, los ensayos se exponen progresivamente a
productos de descomposicin. En caso de hidrlisis, se puede alterar el valor del pH del lote de
ensayo, lo cual algunas veces conlleva a cambios en la tasa de hidrlisis. Bajo estas
circunstancias, se recomienda ajustar el pH incrementar la capacidad de amortiguador. En
casos individuales, mediante la seleccin de otras especies de ensayo, se puede aplicar una
temperatura inferior de ensayo, que conduzca a una reduccin en la tasa de hidrlisis. Al emplear
sistemas de ensayo semiestticos o de flujo continuo, se puede examinar con mayor facilidad el
efecto de la muestra sin descomponer.

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En el caso de los ensayos de biodegradacin, la hidrlisis del material de ensayo puede originar
una desviacin de las escalas de inhibicin de pH durante el ensayo. Cuando no se puede
controlar el pH mediante amortiguadores o ajustes, se recomienda preparar una solucin de
partida acutica, permitir la hidrlisis, por ejemplo durante 24 h, neutralizar la solucin y
comenzar el ensayo de biodegradacin con la muestra hidrolizada.

10.1.8 Fotlisis

Algunos ingredientes (por ejemplo, el hexaclorociclopentadieno, EDTA, hexacianoferrato) se
descomponen por medio de la exposicin a la luz. En el caso de los ensayos con algas, el efecto
de la luz es inherente al sistema.

En otros ensayos, tales reacciones de descomposicin con frecuencia pueden reducirse o
evitarse mediante el trabajo en un ambiente oscurecido (donde sea necesario empleando luz
roja). Al igual que con la degradacin biolgica e hidroltica es preferible realizar el ensayo en
sistemas de flujo continuo y semiestticos.


10.2 PROBLEMAS Y MEDIDAS PREVENTIVAS CONCERNIENTES A LAS MUESTRAS
CON COLORACIN O TURBIAS, O AMBAS

En algunos ensayos biolgicos, la determinacin de punto final se basa en una medicin
espectromtrica (fotometra, fluorometra). En el caso de las muestras con alta coloracin o
turbidez, el efecto inhibidor producido no puede determinarse con confiabilidad. Se pueden llevar
a cabo los siguientes pasos para superar esta situacin:


- diferente mtodo para la determinacin del punto final (por ejemplo, el conteo
celular en vez de la medicin de turbidez en el ensayo de algas);

- medicin de turbidez causada por los organismos mediante el uso de una o dos
longitudes de onda diferentes (con frecuencia los tintes cuentan con
caractersticas de longitud de onda diferentes a la dispersin luminosa causada
por microorganismos);

- combinacin con otro mtodo adecuado, por ejemplo, medicin de tasa de
consumo o produccin de oxgeno al finalizar un ensayo de inhibicin de
multiplicacin celular, en este caso, se recomienda renovar la administracin del
medio nutriente;

- determinacin de la influencia sobre el resultado del tinte o turbidez o ambos con
la ayuda de recipientes de medicin / ensayo combinados en los que la muestra
de ensayo y los organismos se encuentran separados entre s (por ejemplo la
clula de correccin del color en el ensayo de bacteria luminiscente).


En el ensayo de algas, las sustancias con coloracin y turbias pueden impedir directamente el
crecimiento celular como consecuencia de la atenuacin de la iluminacin; esto no debera
malinterpretarse como efectos txicos. La siguientes acciones son adecuadas para diferenciar
entre interferencias fsicas y de toxicidad de las sustancias con coloracin en el ensayo de algas:


a) ensayo a diferentes intensidades de luz puesto que la tasa de crecimiento por
encima de la saturacin luminosa es casi independiente de la intensidad de la luz;

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b) reduccin de la trayectoria luminosa por medio de la disminucin de la profundidad
o el volumen;

c) medicin de la reduccin de proliferacin celular en un lote de control cuando la
luz pasa previamente a travs de un filtro de transmisin de luz, por ejemplo, un
disco plano que contenga las correspondientes diluciones de la muestra con el
correspondiente color y grosor de capa;

d) utilizacin de un filtro de transmisin de luz mediante la preparacin de diluciones
recprocas a la concentracin de exposicin, y de esta forma se mantiene una
longitud de trayecto comn (profundidad constante) y las caractersticas de
absorbancia espectral de la muestra.


11. ENSAYOS BIOLGICOS ESPECIALES

11.1 ENSAYO DE BIODEGRADACIN

La determinacin experimental de degradabilidad de las sustancias y aguas residuales y los
estudios de bioacumulacin tambin son ensayos biolgicos. La degradacin puede considerarse
como la descomposicin de un compuesto orgnico en simples componentes (metabolitos) por
medio de efectos fsico-qumicos (por ejemplo, la degradacin fotoltica mediante luz) y/o
actividad biolgica (por ejemplo, degradacin biolgica por medio de microorganismos).

Se realiz una distincin entre:


a) degradacin primaria por medio de la cual la sustancia pierde propiedades
especficas (identidad, actividad) y se degrada en componentes ms simples;

b) degradacin ltima, es decir, degradacin completa en productos inorgnicos
estables termodinmicamente, por ejemplo el dixido de carbono y el agua. Esta
conduce a la creacin de nueva biomasa adems del dixido de carbono, el agua
y las sales minerales.

Los criterios para la biodegradacin son, por ejemplo:


- la reduccin de componentes de reaccin (por ej. O
2
) necesarios para la
biodegradacin;

- el incremento en los productos de la reaccin que surgen de la degradacin total
(por ejemplo CO
2
);

- la transformacin de la sustancia rotulada
14
C en
14
CO
2
;

- la reduccin de la sustancia inicial detectable mediante anlisis especficos;

- la reduccin de la sustancia detectable mediante parmetros de suma
inespecficos, (por ejemplo, TOC, DOC).


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23
Nota 1. Las dos ltimas afirmaciones no ofrecen indicacin de si se trata de biodegradacin o eliminacin fsico qumica
(por ejemplo a travs de arrastre) o si han ocurrido cambios estructurales qumicos (por ejemplo, por medio de
degradacin primaria).


Se puede hacer una distincin entre eliminacin por medio de sorcin de lodo y biodegradacin
cuando se emplea el lodo (adaptado potencialmente) al final del ensayo de degradabilidad
inherente como el inculo para un ensayo de degradabiliad rpida, cuando se examina
paralelamente un lote contaminado en el cual no ocurren procesos biolgicos o cuando se ha
probado que la ocurrencia de metabolitos es analtica.

Los mtodos de ensayo de biodegradacin pueden clasificarse en los siguientes grupos:


a) Mtodos para medir la biodegradabilidad rpida:

Al medir la biodegradabilidad rpida, se pone en contacto la sustancia de ensayo
con una pequea cantidad de microorganismos polivalentes. Los ensayos se
disean como ensayos discontinuos, es decir, involucran la inoculacin de un solo
sustrato. Se puede observar el curso de la biodegradacin por medio de diversos
parmetros. Cuando las sustancias no pueden reunir los criterios mnimos de
degradabilidad en este sistema de ensayo, se puede examinar su degradabilidad
en un sistema de ensayo ms extensivo.

b) Mtodos para determinar la biodegradabilidad potencial (inherente):

En los mtodos para determinar la biodegradabilidad potencial, se hace una
distincin entre sistemas de ensayo de lote y semicontinuos. Ambos presentan
una densidad de inoculacin relativamente alta con microorganismos polivalentes.

Los sistemas de lote estn diseados para funcionar con administracin de
sustancia e inoculacin nica, mientras que la sustancia de ensayo en el sistema
semiesttico se administra sobre una base diaria.


Nota 2 El uso de los trminos biodegradabilidad rpida e inherente tal como se definen en los parmetros OECD
debera restringirse al ensayo de acuerdo con dichos parmetros. Para detalles adicionales vase la norma ISO 15462.


Adicionalmente la biodegradacin se determina por:


a) Ensayos de simulacin

Los ensayos de simulacin sirven para determinar la biodegradabilidad bajo
condiciones ambientales pertinentes. Se requieren modelos validados que
representen dichas condiciones ambientales. Los mejores modelos hasta el
momento son los de simulacin para plantas de tratamiento de alcantarillado en
los cuales se observa la degradacin de una sustancia de ensayo bajo
condiciones de flujo continuo.

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24
b) Otros mtodos

Estos incluyen, por ejemplo, los mtodos de ensayo en los cuales el lote contiene
sedimento, y mtodos anaerbicos en los que se observa la conversin de la
sustancia de ensayo en CO
2
y CH
4
.

c) Mediciones

Bsicamente, se realiza una distincin entre los parmetros que cubren la
mineralizacin de una sustancia de ensayo (medicin de consumo de oxgeno,
medicin de emisin de CO
2
) y los parmetros que registran la desaparicin de la
sustancia original o una propiedad caracterstica de la sustancia original o ambas,
por ejemplo, el efecto superficial activo en el caso de los surfactantes. En los
casos individuales, por ejemplo al ensayar pesticidas, los ensayos se centrarn no
solo en la degradabilidad de las sustancias mismas sino tambin en los principales
metabolitos en el suelo, agua y en las plantas. Al ensayar la degradabilidad de las
mezclas y preparaciones de sustancia, se aconseja tener presente que no se
pueden realizar declaraciones acerca de la degradabilidad de componentes
menores y aditivos.

Se pueden encontrar detalles adicionales acerca de la ejecucin y evaluacin de los ensayos de
degradacin por ejemplo en las normas: ISO 7827, ISO 11734, ISO 11733, ISO 10707, ISO 9408,
ISO 9439, ISO 9887, ISO 9888, ISO 10634, ISO 10708, ISO 14592, ISO 14593, ISO 15462.

11.2 ENSAYO DE BIOACUMULACIN

La bioacumulacin se puede considerar como la acumulacin de sustancias en organismos vivos
del medio ambiente o por los alimentos. La acumulacin de sustancias en la cadena alimenticia
se conoce como bioampliacin. Los procesos bioacumulativos conducen a concentraciones
finales de sustancias en organismos acuticos posiblemente excediendo la concentracin inicial
en varias rdenes de magnitud.

La bioacumulacin de sustancias qumicas se ve influenciada por las propiedades de la sustancia
tales como la lipofilia, las solubilidad en el agua y la estructura / tamao molecular, por la
estabilidad de las sustancias qumicas en el agua y por la actividad metablica del organismo.

El criterio para la bioacumulacin es el factor de bioconcentracin (BCF), el cual describe los
cocientes de la concentracin en el organismo (c
1
) y la concentracin de la sustancia en el medio
(por ejemplo, agua) u otro parmetro (por ejemplo alimentos) (c
2
) a tiempos especficos o bajo
condiciones de estado estables (BCF
st
).


BCF = c1/c2 = k1/k2 (1)

Donde:

k
1
: es la tasa de captacin;

k
2
: es la tasa de eliminacin

Se ha logrado un estado estable o de altiplano cuando tres anlisis subsecuentes a intervalos de
mnimo 2 d no difieren en 20 %.

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25
Es posible un clculo preliminar del potencial de bioacumulacin mediante el coeficiente de particin
n-octanol-agua, log
10
P
ow,
el cual es una medida de la propiedad lipoflica de una sustancia [41]. En la
escala de log
10
P
ow
3 a 6, a menudo se observa una relacin de BCF = 0,1 P
ow
.

El log
10
P
ow
no es adecuado para calcular el potencial de bioacumulacin en el caso de


- iones (por ejemplo metales pesados);

- surfactantes (desestimacin)

- sustancias con pesos moleculares MW > 700 (sobreestimacin debida a la no
disponibilidad de molculas grandes);

- sustancias altamente lipoflicas (log
10
P
ow
>6) (sobreestimacin puesto que no se
mantuvo ms la relacin lineal).


Nota. Los experimentos de acumulacin con sustancias altamente lipoflicas pueden arrojar resultados errneos, o se
evitan, por definicin, debido a que las condiciones de estado estable no han sido establecidas an o a que la
determinacin analtica de la sustancia disuelta en agua permanece incierta, o ambas.


En general, los resultados de los experimentos de bioacumulacin son ms afirmativos que los
clculos mediante relaciones log
10
P
ow.
Las determinaciones BCF no deberan realizarse con
concentraciones de sustancia en la escala de efectos txicos a los organismos. Adicionalmente,
no se debera exceder la escala de solubilidad en el agua.

Generalmente, en el pescado las sustancias se incorporarn va las agallas y a travs de la piel.
Resulta pertinente una ingestin en la alimentacin en la mayora de los casos solo para
sustancias altamente lipoflicas (log
10
P
ow
>5 y la mayora >7).

Para una valoracin ms elaborada del potencial de bioacumulacin, adems del BCF, son
factores indicativos


- la cintica de depuracin

- la altura del altiplano de residuos y

- la distribucin de rganos especficos


Si la eliminacin sigue un modelo de un compartimento de cintica de primer orden, es posible
calcular un valor CT
50
(tiempo para el 50 % de la eliminacin) de la manera siguiente:


2
50
2
K
Log
CT
e
=


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26
A menudo se observa una excrecin de dos fases, es decir una eliminacin rpida seguida de
una ms lenta debido a las diferentes tasas de captacin en rganos especficos, procesos
metablicos o diferentes trayectorias de excrecin. Para investigaciones de esta clase, resultan
ms adecuadas las tcnicas de trazador radioactivo.

La concentraciones de ensayo generalmente muy bajas en un ensayo de acumulacin (1/100
1/1 000 de LC
50
) imponen requisitos especiales sobre la eficiencia de los mtodos analticos que
acompaan el ensayo. En algunas reas (transformacin de sustancias de ensayo) se pueden
emplear sustancias radio-etiquetadas.

En el Parmetro 305 de OECD se pueden encontrar detalles adicionales acerca de la
determinacin de la bioacumulacin.

11.3 ENSAYO DE GENOTOXICIDAD

Los ensayos de genotoxicidad / mutagenicidad sirven como medidas preventivas dentro de un
sistema de mantenimiento de salud pblica general. En el tiempo presente existe poco
conocimiento confiable acerca de los efectos de las sustancias mutagenticas en sistemas
ecolgicos acuticos.

La genotoxicidad puede considerarse como una alteracin del genoma celular bajo la influencia
de sustancias. En la medida en que estos cambios se trasmiten a la siguiente generacin celular,
es posible hablar de efecto mutagnico de genotipo cambiante. Los efectos txicos desempean
un papel esencial en la etologa del cncer. Sin embargo, no todas las alteraciones genotxicas
son heredadas por las clulas hijas, puesto que las clulas cuentan con sistemas de reparacin
compensatorios para el cido deoxiribonuclico (ADN) que son capaces de revertir muchas
alteraciones adversas. Adicionalmente, a menudo los efectos drsticos conducen a la muerte
celular. Se puede considerar la induccin de sistemas de reparacin como prueba de la
concurrencia de efectos genotxicos. Las mutaciones se dividen de tres tipos.


a) Mutaciones genticas, en las cuales la secuencia de base en un gen se modifica a
travs del intercambio de una base de ADN (mutacin de punto) o por medio de la
introduccin o extraccin de una o ms bases de ADN (cambios en el cdigo de
lectura, mutaciones de cambio de estructura)

b) Las mutaciones de cromosomas, en las cuales se altera la estructura del
cromosoma visible, por ejemplo a travs de la eliminacin, traslocacin o
inversin. Las mutaciones de cromosomas pueden conducir a la formacin de
eliminaciones reconocidas como microncleos. La estructura de los cromosomas
puede percibirse especialmente bien durante la metafase del ciclo celular.

c) Las mutaciones de genoma en las cuales se cambia la cantidad total de clulas.
En este tipo, la cantidad de las clulas individuales (aneuploidia) o el conjunto
entero de cromosomas (poliploida) puede cambiar.


Las mutaciones de cromosomas y genomas slo pueden observarse en clulas de organismos
eucariticos. Los procedimientos de ensayo in vivo e in vitro son distintos. Los procedimientos in
vitro posibilitan la demostracin del potencial genotxico de un lote de ensayo y resultan
apropiados a fin de reducir al mximo los ensayos de animales. No obstante, puesto que los
procedimientos in vitro constituyen sistemas de ensayo suborgnicos, su valor informativo es
limitado.

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27
Se puede indagar acerca del mecanismo del efecto genotxico en forma diferencial mediante
procedimientos in vitro. Como regla general, estos se realizan con cultivos de clulas provenientes de
mamferos (por ejemplo clulas de CHO, clulas V79). Su potencial metablico en xenobiticos es
comparativamente inferior. Por esta razn las enzimas microsmicas (fraccin S9), por ejemplo de
tejido de hgado inducidas por bifenilos policlorados (PCB
s
), se adicionan (activacin metablica)
como serie paralela de ensayo. Aunque la fraccin S9 puede causar una reduccin en la actividad
con algunas sustancias, es posible que primero induzca a un efecto mutagnico con otras numerosas
sustancias (promutagnico) por medio de la biotransformacin.

Adems la fraccin S9 se adiciona en sistemas de ensayos bacteriales (procariticos) (por
ejemplo en el procedimiento de ensayo de Ames) en una serie paralela de ensayo. Con
bacterias, los potenciales de alteracin de genoma pueden identificarse rpida y fcilmente. Sin
embargo, una extrapolacin de los resultados a organismos superiores pone limitantes
significativas.

Al realizar ensayos bacteriales y procedimientos in vitro eucariticos, es conveniente trabajar bajo
condiciones estriles. Al igual que el agua, y en especial el agua residual, muy a menudo las
muestras contienen muchas bacterias y dichas muestras generalmente deben filtrarse por medio
de un filtro de membrana antes de usarse en la mayora de los sistemas de ensayo. Las
concentraciones / diluciones empleadas no deberan ser deteriorantes de clulas (citotxicas).
Los lotes de referencia (controles positivos) para verificar la reactividad de las clulas deberan
prepararse en forma simultnea.

12. EVALUACIN

12.1 GENERALIDADES

La evaluacin de los resultados del ensayo primero involucra la inspeccin crtica de datos y una
presentacin y descripcin de los resultados de ensayo empleando grficos, tablas y parmetros
estadsticos adecuados, por ejemplo valores medios y variaciones (estadsticas prescriptivas).

En muchos casos se sigue un procesamiento estadstico ms extensivo que se dirija a
determinar las relaciones de concentracin o dosis/respuesta a fin de calcular parmetros
adecuados para el quantum de accin y examinar la importancia estadstica (estadsticas de
clculo y ensayo). Esta evaluacin estadstica ms extensiva es til solo si los datos son
suficientes para este propsito, lo cual requiere primero que todo de examen crtico de los datos.

12.2 INSPECCIN Y DESCRIPCIN DE DATOS BSICOS

Toda evaluacin debera comenzar con un examen crtico de los resultados de ensayo obtenidos.
Se verifica la credibilidad de todos los datos, lecturas primarias o datos transformados deducidos
de las mediciones, en especial en el caso de los anmalos.


Nota. Se recomienda que el evaluador elimine los anmalos solo despus del juicio experto. Los ensayos de anmalos
pueden emplearse aqu como auxiliares matemticos.


En las consideraciones acerca de la credibilidad resulta til una presentacin grfica,
preferiblemente de los valores sin transformar. A menudo es muy conveniente un grfico
semilogartmico de los efectos medidos. Cualquier grfico debera presentar en forma clara las
unidades de concentracin, la cantidad de controles y lotes paralelos y los parmetros del efecto.

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28
Adicionalmente, los grficos ofrecen informacin valiosa acerca del comportamiento de los
componentes de ensayo y el punto hasta el cual es aconsejable la determinacin de una relacin
matemtica concentracin/respuesta. Tambin puede indicar cul modelo estadstico es
probablemente el ms adecuado.

En el caso de la evaluacin ms avanzada, en principio, se debera dar prioridad a los mtodos
aritmticos sobre los puramente grficos puesto que, por lo general, permiten el clculo de
escalas de confianza y varianzas . Se aconseja presentar los datos en forma tabular junto con los
valores medios calculados, los coeficientes de variacin y el nmero de observaciones
independientes de los lotes paralelos (rplicas).

En algunos casos en que se van a reportar parmetros definidos simples, por ejemplo las
diluciones de umbral, no hay necesidad de una evaluacin estadstica ms extensiva. En estos
casos, la evaluacin termina con el clculo del porcentaje de las inhibiciones y la decisin acerca
de si un efecto medido es superior o inferior que un valor lmite determinado.

12.3 EVALUACIN ESTADSTICA

12.3.1 Generalidades

La evaluacin estadstica ms extensiva se propone


a) presentar una relacin matemtica entre el efecto medido y la concentracin
empleada (relacin concentracin / respuesta)

b) calcular los parmetros estadsticos que caracterizan el efecto y

c) realizar ensayos estadsticos o proporcionar escalas de confiabilidad (por ejemplo
refirase a la norma ISO 8466)

Se acostumbra proporcionar concentraciones como parmetros estadsticos para el efecto de
una sustancia en la que se observ un quantum de accin especfico (EC: concentracin
efectiva, EC
x
; x: % efecto x).

Por ejemplo, el EC
50
ofrece la concentracin a la cual el efecto puede observarse en el 50% de
los animales de ensayo el 50 % del efecto (por ejemplo la mortalidad, inmovilidad)
(concentracin de efecto medio, 50 % de cuantil). Estos parmetros para el quantum del efecto
se derivan de la relacin concentracin / respuesta.

En algunos ensayos se determina una concentracin de efecto, por encima de la cual se observ
un efecto importante estadsticamente, por ejemplo LOEC (Concentracin inferior de efecto
observado) y NOEC (Concentracin de efecto no observado). Estos parmetros pueden
determinarse mediante comparacin de los resultados de ensayo de varios niveles de
concentracin con los resultados de control empleando ensayos estadsticos para el anlisis de
la variacin (ANOVA) o, si no se cumplen los prerrequisitos, mtodos no paramtricos (por
ejemplo ensayos U mltiples).


Nota. Dicha figura, por definicin, ser una de las concentraciones ensayadas. En forma alternativa, el LOEC puede ser
un clculo de punto, ECX. El valor de x se determina a partir de la experiencia prctica con el mtodo de bioensayo
particular. En muchas situaciones un EC10 ser un clculo LOEC apropiado. Para algunos mtodos de ensayo con
mayor variabilidad o ms generalmente en situaciones donde los lmites de confiabilidad alrededor de EC10 son
superiores, el EC10 puede remplazarse por un EC20.

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29
El factor decisivo en la seleccin de una evaluacin estadstica o mtodo de ensayo es la
posibilidad de que el criterio del ensayo se relacione con el tipo de variable de respuesta
(cualitativo) o mtrico (cuantitativo) de variables (vase el numeral 9.5.3).


12.3.2 Variables de respuesta (cualitativas)

Los mtodos enunciados aqu son adecuados para los bioensayos en los cuales se estudia la
variable mortalidad inmovilidad (por ejemplo, ensayos de toxicidad aguda con peces y
daphnia). El mtodo de clculo clsico para variables cunticas de esta clase se basa en el
principio de probabilidad mxima. En el caso de la distribucin normal este conduce a anlisis
probit (30), (31), con distribucin logstica para anlisis logit (32) empleando la distribucin
Weibull para el anlisis Weibit (33). En el caso de las variables cunticas, los clculos de
parmetro que emplean el principio de probabilidad mxima tienen en cuenta la heterogeneidad
de la varianza de los valores de medicin. Esto constituye una diferencia muy importante para
una regresin no pesada siguiendo la linealizacin de las curvas de respuesta de la
concentracin (por ejemplo, mediante el uso de papel probit). En esta situacin, no se llega a
escalas de confiabilidad vlidas.

12.3.3 Variables mtricas (cuantitativas)

Los mtodos de anlisis probit, logit o Weibit arriba mencionados no son adecuados para
variables mtricas (cuantitativas). Por lo general, el principio de los mnimos cuadrados de la
regresin lineal y no lineal se emplea para los mtodos de clculo. El propsito es seleccionar
una funcin que permita el mejor ajuste a los datos (varianza residual inferior). Si los valores de
medicin revelan diferentes varianzas para las concentraciones de ensayo individual, se
recomienda realizar los anlisis de regresin con factores de pesaje adecuados (34).

No se recomienda relacionar los efectos medidos en los lotes de ensayo con los controles no
tratados e ingresarlos contra los logaritmos de la concentracin. Esta transformacin puede
conducir a la heterogeneidad de las varianzas y, por tanto, conlleva mayores desventajas con
respecto a la evaluacin estadstica. Por esta razn, la evaluacin siempre debera realizarse con
datos sin transformar.

Se calculan las concentraciones de efecto, siempre que sea posible, a partir de las funciones de
respuesta de la concentracin. En el caso de las variables cunticas (por ejemplo del ensayo de
peces o daphnia agudos), se acostumbra proporcionar el EC
0
, EC
50
y EC
100
que tambin se
pueden describir como LC
0
, LC
50
y LC
100
(LC: concentracin letal).

Donde:

- EC
0
: concentracin ensayada superior a la cual no se observa ningn efecto en
lnea con el criterio del ensayo (LC
0
: todos los organismos sobreviven);

- EC
50
: concentracin a la cual existe un efecto sobre el 50% de los organismos en
lnea con el criterio del ensayo (LC
50
: 50% de los organismos mueren);

- EC
100
: concentracin inferior a la cual existe un efecto sobre el 100% de los organismos
en lnea con el criterio del ensayo (LC
100
: todos los organismos mueren)

- El EC
0
y EC
100
son parmetros derivados directamente del experimento y no
concentraciones de umbral determinadas estadsticamente. La NEC
(Concentracin sin efecto) se deriva de una relacin concentracin/efecto
extrapolada a cero.

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30
En el caso de variables mtricas, por lo general se calcula el EC
50
, algunas veces tambin el
EC
10
(por ejemplo en el ensayo de inhibicin de crecimiento de algas). Se debera tener presente
que, por ejemplo, el EC
50
no corresponde a una concentracin de efecto medio, como en el caso
de las variables cunticas, pero designa la concentracin a la cual una variable mtrica es en
promedio 50 % inferior a la de control.


Nota. IC (concentracin inhibitoria para el efecto x %). La designacin EC50 algunas veces tambin se emplea en casos en
los cuales una variable se inhibe en un 50% en relacin con el control (por ejemplo cantidad de animales jvenes en el
ensayo de reproduccin de daphnia, biomasa y tasa de crecimiento en el ensayo de inhibicin de algas). Con el propsito de
diferenciar estas concentraciones de efecto, determinadas a partir de las variables mtricas de las arriba mencionadas,
algunos autores sugieren que se deberan describir como ICx (concentracin inhibitoria para el efecto x%).


El intervalo de confiabilidad puede calcularse empleando el mtodo Fieller (30), (36), (38).

Si la situacin de datos es tal que ninguno de los mtodos arriba mencionados puede aplicarse,
la EC
50
y su escala de confianza puede ser aproximada empleando mtodos alternativos, por
ejemplo, (Mtodo Promedio de Desplazamiento, Mtodo Krber Sperman Ajustado (30,31) o la
simple interpolacin (de ser necesario de EC
0
y EC
100
). Si no se obtiene EC
100
con muestras no
diluidas, se debera reportar el mximo EC obtenido.

En muchos ensayos de biodegradacin la cantidad de valores de degradacin medidos en la
fase de altiplano no es suficiente para permitir un tratamiento estadstico. Sin embargo, el ltimo
resultado de la fase de altiplano a menudo no es representativa de esta fase. En dichos casos, se
recomienda indicar el resultado del ensayo en una escala del 10 %, por ejemplo, grado de
biodegradacin 70 % a 80 % de la remocin DOC.


12.3.4 Confirmacin estadstica de resultados

12.3.4.1 Generalidades. Los ensayos estadsticos aqu mencionados se emplean para determinar
si en general la sustancia ensayada presenta un efecto importante o a partir de cal
concentracin se observa un efecto importante o ambas. Esta concentracin se describe como
FOEC/LOEC (Concentracin de Efecto Observado Primero/Inferior) y la siguiente concentracin
ms baja (sin efecto importante) como NOEC (Concentracin de Efecto No observado).

Estos parmetros dependen de:


- la varianza del parmetro medido;

- la cantidad de paralelos en las concentraciones de ensayo y controles (rplicas);

- la cantidad de concentraciones ensayadas;

- los incrementos de los niveles de concentracin.

Por tanto, el resultado se ve influenciado en gran medida por el diseo del ensayo. Aqu, adems
la eleccin de un mtodo estadstico adecuado depende de si se examinan variables de
respuesta cunticas o cuantitativas (mtricas).

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31
12.3.4.2 Variables cunticas. Los mtodos mencionados aqu son adecuados para ensayos en
los cuales se examina la variable mortalidad o inmovilidad (por ejemplo, el ensayo de
toxicidad aguda con peces y daphnia). Con el propsito de confirmar estadsticamente el efecto
observado, resultan convenientes los ensayos para escalas de datos nominales. Y para
determinar LOEC/NOEC, es apropiado el ensayo binomial de acuerdo con Fisher.

12.3.4.3 Variables mtricas. La seleccin de un mtodo de ensayo adecuado depende de si el
criterio de ensayo (por ejemplo, biomasas, tasas de crecimiento, produccin de animales jvenes
y tasa metablicas) sigue una distribucin normal aproximada y si la varianza es homognea.
Entonces, los mtodos estadsticos pueden emplearse como los ms confiables.

En el caso de una distribucin normal y homogeneidad de varianza, se intenta la confirmacin
estadstica empleando anlisis de varianza simple (ANOVA). Se determinan NOEC y LOEC
empleando el ensayo Dunnett o Williams (35).

Si no se cumplen estas condiciones previas, se puede confirmar el efecto empleando el ensayo
Kruskal-Wallis. En ese caso, resultan adecuados los ensayos U mltiples (por ejemplo de
acuerdo con Bonferroni-Holm (39) ) para determinar las LOEC/NOEC.


Notas:

1) La EC0 no se puede igualar con la NOEC, ya que se determina directamente de los datos sin emplear un
mtodo estadstico. Sin embargo, ambos se determinan en un mayor grado mediante el diseo del ensayo
(por ejemplo, la cantidad y magnitud de la concentracin incrementan).

2) La determinacin de la NOEC empleando los mtodos estadsticos arriba mencionados se discute
crticamente en la actualidad (40). En forma alternativa, se propone determinar la concentracin umbral de
efecto NEC a partir de la relacin concentracin- respuesta (71).


13. PRESENTACIN DE RESULTADOS

13.1 ENSAYOS DE TOXICIDAD

Los ensayos de toxicidad brindan principalmente las concentraciones de umbral o efectivas, por
ejemplo, NOEC/LOEC, EC
10,
EC
50
y EC
90
LC (concentracin letal), respectivamente, cuando
resulte apropiado. Los datos de la concentracin deberan indicar en forma clara si estos se
basan en el in efectivo, en el compuesto o por ejemplo en la etapa de dilucin.

Siempre que sea posible, la curva de respuesta de la concentracin debera presentarse junto
con los resultados del ensayo en un grfico, por ejemplo como se muestra en la Figura 2, donde
se presentan los resultados del ensayo y los valores de EC
x
. Esta ofrece una clara
representacin del carcter de la relacin entre la concentracin y la respuesta y el acuerdo de
los resultados con respecto al modelo.

Deberan determinarse el criterio de ensayo (punto final), organismo de ensayo, tiempo de
exposicin y, siempre que sea posible, las escalas de confianza, por ejemplo para la EC
50
(vase
el numeral 12.3.4).


Nota. Al ensayar las aguas residuales por medio de diluciones graduadas, se puede reportar la menor dilucin sin
efecto (vase el Anexo A).


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32

99
5,35 1,61
90
0,97
80
0,37
50
0,14
20
0,08
10 EC
0
20
40
60
80
100
0,03
1
Concentracin mg/l
%

d
e

i
n
h
i
b
i
c
i

n



Figura 2. Ejemplo de curva de concentracin / respuesta adaptada a la distribucin normal para la inhibicin


13.2 ENSAYOS DE DEGRADACIN

El grado de degradacin se describe mediante el porcentaje de disminucin en la concentracin
de un (o varios) parmetro(s) como se menciona en el numeral 11.1.

Se recomienda describir la cintica de la degradacin (fase de retardo para adaptacin, tiempo
de media vida, ventana de 10 das).

13.3 ENSAYOS DE BIOACUMULACIN

Se debera describir el transcurso de tiempo de concentracin de la sustancia en todo el
organismo o tejidos especiales mediante grficos o tablas a fin de demostrar que se ha
alcanzado un estado estable. Se aconseja reportar los BCF como una figura sin dimensiones
rodeada de no ms de tres figuras importantes.

Se debera establecer la base de los BCF (por ejemplo cuerpo, rgano, masa fresca o seca) y su
diseo experimental (esttico, semiesttico, dinmico).


13.4 ENSAYOS DE GENOTOXICIDAD

En general, el nmero de incidentes observados (por ejemplo, las aberraciones cromosomticas)
o capacidades metablicas adquiridas (por ejemplo la induccin de enzimas de reparacin) se
reporta en relacin con concentraciones determinadas de una sustancia o diluciones de una
muestra de agua. Este valor se relaciona con un valor correspondiente de lote de control. El valor
puede normalizarse de acuerdo con el nmero de clulas al finalizar el ensayo. La relacin
concentracin / efecto puede evaluarse de acuerdo con el numeral 12. Si se ensayan sustancias,
el resultado generalmente se reporta en forma cualitativa (positivo/negativo).


Nota. Si se ensayan aguas, el resultado se puede reportar como la menor dilucin sin efecto


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14. REPORTE DEL ENSAYO

Se recomienda registrar los siguientes datos en el reporte del ensayo:


a) nombre del laboratorio que realiza el ensayo;

b) fecha y perodo de ensayo;

c) referencia al mtodo de ensayo (nmero de la norma internacional o nacional)
empleado;

d) organismo de ensayo (por ejemplo, nombre cientfico, cepa, fuente), tratamiento
previo teraputico o de aclimatacin (si existe alguno);

e) designacin del material de ensayo (nmero de lote, origen, fecha y perodo de
muestreo);

f) pretratamiento de la muestra (por ejemplo, preservacin, preconcentracin,
homogenizacin, ajuste del pH, tipo de agente neutralizante, pre-aireacin);

g) datos, derivados, condensados o transformados, incluyendo, si es apropiado, los
resultados de controles positivos (lote de referencia);

h) datos qumicos y fsicos determinados durante el ensayo (por ejemplo, la
temperatura, el contenido de CO
2
, pH, turbidez, precipitacin, posible cambio en la
concentracin de la sustancia, etc.);

i) cualquier desviacin del protocolo de ensayo (naturaleza del agua de dilucin,
solucin nutriente, aeracin, temperatura, etc., cantidad de organismos o densidad
del inculo, cantidad de lotes paralelos y controles);

j) mtodo de evaluacin (logit, probit, grfico, computacional);

k) detalles de los resultados del ensayo;

l) comentarios acerca de los resultados del ensayo, si son necesarios;

m) firma del investigador responsable;

n) firma del controlador de calidad, si resulta apropiado.


15. PRINCIPIOS BSICOS DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD PARA ENSAYOS
BIOLGICOS

15.1 GENERALIDADES

El trmino aseguramiento de la calidad abarca todas las medidas tomadas a fin de determinar y
reportar los errores potenciales y la calidad en los resultados de ensayo. Tambin se puede
aplicar la mayora de medidas en una serie de Normas Internacionales (serie ISO 9000, etc.)
introducidas bajo el trmino aseguramiento de la calidad analtico a los mtodos de ensayo
biolgicos.

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34
El aseguramiento de la calidad de un ensayo incluye la planeacin del muestreo, las mediciones
y la evaluacin, la documentacin y valoracin de los resultados y su registro.

Consecuentemente con la importancia del aseguramiento de la calidad en el procedimiento, se
debera incorporar en forma adecuada un programa correspondiente a la estructura de la
organizacin general considerando que algunas veces, segn del mtodo de ensayo empleado,
hasta el 30 % del tiempo del laboratorio debe dedicarse al logro del aseguramiento de la calidad
adecuado.

Las medidas de aseguramiento de la calidad se pueden subdividir en cuatro secciones:


- fase preparatoria;

- control interno de calidad;

- auditora de control externo de la calidad;

- evaluacin y documentacin.


15.2 FASE PREPARATORIA

15.2.1 Organizacin y personal del laboratorio de ensayo

Los usuarios de esta gua debern tratar de garantizar lo siguiente:

- El laboratorio de ensayo se organiza de modo que permita que una cantidad
suficiente de personal con la capacitacin y experiencia necesaria inicial y
adicionales necesarias para que realice las tareas asignadas.

- El gerente general de la instalacin de ensayo es normalmente, el responsable de
los aspectos organizacional y administrativo y, entre otras cosas, de garantizar
que se cumplan los requisitos relacionados con el personal y equipo para la
conduccin de los ensayos.

- Un supervisor de ensayo biolgico vigila la operacin y desempeo. El es
responsable de supervisar que el ensayo se realice de forma correcta y adecuada
y que se documente como un reporte de ensayo.

- Las tareas de aseguramiento de la calidad involucran la verificacin de la
conformidad del desempeo del ensayo con los mtodos y criterios fijados en la
Norma Internacional y del registro correcto de la informacin bruta, la cual adems
debe corresponder con los resultados ofrecidos en el reporte.

- En laboratorios ms grandes, puede ser aconsejable asignar una persona con la
preparacin necesaria para supervisar el aseguramiento de la calidad sobre una
base de tiempo completo o parcial. Una unidad organizacional independiente
puede asumir las tareas.

- Se proporciona capacitacin continua regular y adecuada tanto para el gerente del
laboratorio como para otros miembros del personal del mismo.


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15.2.2 Equipo de laboratorio

Los usuarios de esta gua deberan garantizar lo siguiente.


- El laboratorio de ensayo cuenta con el equipo apropiado para conducir los
ensayos. Adems del equipo tcnico, el laboratorio debera contar con adecuadas
instalaciones en el edificio, disposicin de cuartos e instalaciones de ingeniera
domsticas (por ejemplo, electricidad, suministro de agua y gas, filtrado de
emisiones, ventilacin o aire acondicionado) a fin de cumplir con los requisitos de
los ensayos por realizarse. La disposicin de todos los desechos debera cumplir
con las disposiciones de seguridad pertinentes.

- La distribucin del espacio dentro del rea del laboratorio debera ser tal que se
evitara la contaminacin de las instalaciones, equipo, personal y sistemas de
ensayo, lo mismo que la indeseada mezcla de las sustancias y medios de ensayo.
En especial, el cultivo y mantenimiento de los organismos de ensayo debera
separarse del sitio de preparacin y ensayo.

- Para mtodos de ensayo biolgico, tambin deberan cumplirse las
precondiciones de aprobacin del estatuto correspondientes (por ejemplo, los
requisitos de legislacin de proteccin animal y las disposiciones acerca de la
proteccin contra epidemias), adems de los preceptos relacionados con el
laboratorio y equipo tcnico.


15.3 FIJACIN DE LOS OBJETIVOS DE CALIDAD

Los objetivos de calidad se fijan como base de las decisiones sobre seleccin del mtodo y de
los pasos que hacen parte del aseguramiento de la calidad. Los objetivos de calidad abarcan
tanto los parmetros estadsticos como las declaraciones acerca de la selectividad o
especificidad del mtodo de ensayo.

15.4 DESCRIPCIN DEL MTODO DE ENSAYO

Resulta esencial que todas las partes del mtodo de ensayo se describan como realmente se
emplearon, el equipo e instrumentos empleados y las medidas de aseguramiento de la calidad
tomadas. Las etapas de ocurrencia frecuente, que son parte rutinaria de todos los ensayos o de
un mtodo de ensayo especfico, pueden fijarse en las descripciones estndar (procedimientos
operantes estndar (SOPs) ), lo que significa que no es necesario mencionarlas especficamente
en cada plan de ensayo. Son tpicos de dichos procedimientos el tratamiento de las muestras, el
mantenimiento y la calibracin de los instrumentos de medicin, la limpieza del equipo y los
instrumentos, la cra y cultivo de los organismos de ensayo, las instalaciones de seguridad y
emergencia, etc.).

Se debe informar por anticipado el alcance, contenido y tiempo programado del ensayo a todo el
personal que hace parte del ensayo. La hoja de trabajo debe contener informacin clara acerca
de las personas responsables, los objetivos del ensayo, la realizacin del mismo y los mtodos
de ensayo empleados, al igual que el tiempo y el tipo de mediciones por realizarse.

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36
15.5 DETERMINACIN DE LOS PARMETROS DE ENSAYO

Antes de la aplicacin prctica de un mtodo de ensayo, deben determinarse los parmetros de
ensayo pertinentes (por ejemplo, las desviaciones estndar y los coeficientes de variacin).
Tambin se deben definir los criterios de validez. En el caso de los mtodos estandarizados,
normalmente se ofrecen parmetros estadsticos y criterios de validez en el procedimiento
normalizado.

Adicionalmente, la fase preparatoria abarca la seleccin de una estrategia de calibracin
adecuada para los instrumentos, el ensayo de la conveniencia de los materiales y el examen de
la posibilidad de que el mtodo sea el adecuado para el objetivo.

15.6 CONTROL DE CALIDAD

15.6.1 Control de calidad interno

El control de calidad interno es una parte integral del mtodo de ensayo general. Se aplica
normalmente en aquellas mediciones biolgicas que se conducen sobre una base rutinaria.
Incluye mediciones para identificar, superar y evitar errores y debera incluir los siguientes pasos:


- ensayo de las precondiciones reales con respecto al personal, muestreo,
laboratorio, equipo, organismos de ensayo, instrumentos y mtodos analticos;

- calibracin de instrumentos;

- ensayos con sustancias de referencia;

- mantenimiento de cuadros de control;

- determinaciones mltiples;

- control de credibilidad;

- validacin

Todas las medidas y resultados de control de calidad interno deben documentarse
cuidadosamente, presentarse de manera clara y actualizarse con frecuencia.

15.6.2 Control de calidad externo (auditora)

Una comparacin de los resultados de los ensayos y mediciones con los de otros laboratorios
puede ser parte importante del control de calidad externo. La cooperacin en los ensayos inter-
laboratorio que involucran un mayor nmero de participantes sirve para dar a los resultados
mayor autoridad y posibilitar correcciones de fallas menores. La intencin de la auditora externa
es confirmar (o no) que el control de calidad interno funciona.

15.6.3 Evaluacin

La evaluacin de la informacin bruta obtenida de las etapas individuales del mtodo de examen
debera realizarse de acuerdo con el mtodo documentado de evaluacin. El desempeo del
ensayo debera tener relacin con los resultados intermedios y finales, y controlarse en forma
regular mediante controles de credibilidad selectivos.

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15.6.4 Documentacin

Se aconseja establecer los registros e instrumentos de la documentacin completa, todos los
datos e informacin pertinentes en el curso del examen y los resultados y mediciones del control
de calidad analtico y estadstico.



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Anexo A (informativo)

Menor dilucin sin efecto (LID)

En el ensayo de toxicidad de agua residual mediante diluciones definidas (D), la menor dilucin
sin efecto (LD) expresa el lote de ensayo con mayor concentracin en el cual no se ha
observado inhibicin ni siquiera efectos que no excedan la variabilidad especfica de ensayo. D
se expresa como el valor recproco de la fraccin de volumen de agua residual en el lote de
ensayo.

EJEMPLO.


de agua residual (fraccin de volumen de 25 %) es nivel de dilucin D= 4.


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Anexo B (informativo)


Bibliografa


B.1 NORMAS INTERNACIONALES

1. ISO 6341:1996, Water quality Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia
magna Straus (Cladocera, Crustacea).

2. ISO 7346-1: 1996, Water quality Determination of the acute lethal toxicity of
substances to a freshwater fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprindae)) Part 1: Static method.

3) ISO 7346-1: 1996, Water quality Determination of the acute lethal toxicity of
substances to a freshwater fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprindae)) Part 2: Semistatic method.

4) ISO 7346-1: 1996, Water quality Determination of the acute lethal toxicity of
substances to a freshwater fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprindae)) Part 3: Flow-through method.

5) ISO 7827:1994, Water quality Evaluation in an aqueous medium of the ultimate
aerobic biodegradability of organic compounds Method by analysis of dissolved
organic carbon (DOC)

6) ISO 8192:1986, Water quality Test for inhibition of oxygen consumption of activated
sludge.

7) ISO 8466-1:1990, Water quality Calibration and evaluation of analytical methods and
estimation of performance characteristics Part 1: Linear functions

8) ISO 8466-1:1990, Water quality Calibration and evaluation of analytical methods and
estimation of performance characteristics Part 2: Non-linear functions

9) ISO 8692:1989, Water quality Fresh water algal growth inhibition test with
Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.

10) ISO 9000:1987, Quality management and quality assurance standards Guidelines for
selection and use.

11) ISO 9408:1991, Water quality Evaluation in an aqueous medium of the ultimate
aerobic biodegradability of organic compounds Method by determining the oxygen
demand in a closed respirometer.

12) ISO 9439:1990, Water quality Evaluation in an aqueous medium of the ultimate
aerobic biodegradability of organic compounds Method by analysis released carbon
dioxide.

13) ISO 9509:1989, Water quality Method for assessing the inhibition of nitrification of
activated sludge microorganisms by chemicals and waste waters.

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40
14) ISO 9887:1992, Water quality Evaluation of the aerobic biodegradability of organic
compounds in an aqueous medium Semicontinuous activated sludge method (SCAS).

15) ISO 9888:1991, Water quality Evaluation of the aerobic biodegradability of organic
compounds in an aqueous medium Static test (Zahn-Wellens method).

16) ISO 7827:1994, Water quality Determination of the acute lethal toxicity of substances
to freshwater fish Method for evaluating the effects of substances on the growth rate
of rainbow trout )Oncprhynchus mykiss Walbaum (Teleostei, Salmonidae)).

17) ISO 7827:1994, Water quality Marine algal growth inhibition test with Skeletonema
costatum and Phaeodactylum tricornutum.

18) ISO 7827:1994, Water quality Measurement of biochemical parameters Spectometric
determination of the chlorophyll-a concentration.

19) ISO 7827:1994, Water quality Guidance for the preparation and treatment of poorly
water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability
in an aqueous medium.

20) ISO 10707:1994, Water quality Evaluation in an aqueous medium of the ultimate
aerobic biodegradability of organic compounds Method by analysis of biochemical
oxygen demand (closed bottle test).

21) ISO 10708:1995, Water quality Evaluation in an aqueous medium of the ultimate
aerobic biodegradability of organic compounds Method by determining the biochemical
oxygen demand in a two-phase closed bottle test.

22) ISO 10712:1995, Water quality Pseudomas putida growth in inhibition test
(Pseudomas cell multiplication inhibition test).

23) ISO 11733:1995, Water quality Evaluation of the elimination and biodegradability of
organic compounds in an aqueous medium Activated sludge simulation test.

24) ISO 11734:1995, Water quality Evaluation of the ultimate anaerobic biodegradability of
organic compounds in digested sludge Method by measurement of the biogas
production.

25) ISO 13289:
1)
, Water quality Determination of genotoxicity of water and waste water
Umu test

26) ISO/CD 14442:1997, Water quality Guidance for algal growth inhibition tests with
poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waste water.

27) ISO/DIS 14593, Water quality Evaluation in an aqueous medium of the ultimate
aerobic biodegradability of organic compounds Method by analysis of released
inorganic carbon in sealed vessels.

28) ISO/TR 15462, Water quality Selection of tests for biodegradability.

29) EN 45001: 1989, General criteria for the operation of testing laboratories.

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41
B.2 OTRAS PUBLICACIONES Y GUAS

30) Finney, D.Y. (1971): Statistical methods in biological assay, 3
rd
Edition, University Press,
London.

31) Weber, E. (1980): Grundri der bilogischen Statistik, Fischer Verlag, Stuttgart.

32) Ashton, W.D (1972): The logit transformation with special reference to its uses in
bioassay. Griffin, London.

33) Christensen, E.R. (1984): Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the
Weibull model. Water Res. 18, pp. 213-221

34) Carrol, R.J and Ruppert, D (1988): Transformation and weighting in regression.
Chapman and Hall, London.

35) Dunnett, C. W. (1955): A multiple comparison procedure for comparing several
treatments with a control Amer. Statist. Ass. J., 50: pp. 1096-1121.

36) Fieller, E.L. (1944): A fundamental formula in the statistics of biological assay and some
applications. Quart. J. Pharm. Pharmacol., 17: pp. 117-123.

37) Girling, A.E., Whale, G.F., Adema D.M.M (1994): A guideline supplement for determining
the aquatic toxicity of poorly water-soluble complex mixtures using water-accommodated
fractions. Chemosphere, 29 (12): pp. 2645-2649.

38) Morgan, B.J.T (1992): Analysis of quantal response data, Chapman & Hall, London.

39) Holm, S. (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand J. Statist, 6:
pp. 65-70

40) Hoekstra, J.A. and van Ewijk, P.H. (1993): Alternatives for the no-observed-effect-level.
Environm. Toxicol. Chem. 12: pp. 187-194.

41) OECD 107 Partition coefficient n-octano/water.

42) OECD (1997) Report of the OECD Workshop on Statistical Anlisis of Aquatic Toxicity
Data Braunschweig, Germany, Oct. 15-17 1996, Paris March 1997.

43) OECD 201 Alga, Growth Inhibition Test 7 June 1984.

44) OECD 202 Part I Daphnia sp., Acute Immobilisation Test 4 April 1984.

45) OECD 202 Part II Daphnia, Reproduction Test- Draft 6/93

46) OECD 203 Fish, Acute Toxicity Test 17 July 1992

47) OECD 204 Fish, Prolonged Toxicity Test, 14-day study 4 April 1984

48) OECD 209 Activated Sludge, Respiration Inhibition Test 4 April 1984

49) OECD 210 Fish, Early-life Stage Toxicity Test 17 July 1992

50) OECD 301 A Ready Biodegradability: DOC-Die Away Test 17 July 1992

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42
51) OECD 301 B Ready Biodegradability: CO
2
-Evolution Test 17 July 1992

52) OECD 301 C Ready Biodegradability: Modified MITI-Test 17 July 1992

53) OECD 301 D Ready Biodegradability: Closed Bottle Test 17 July 1992

54) OECD 301 E Ready Biodegradability: Modified OECD Screening Test 17 July 1992.

55) OECD 301 F Ready Biodegradability: Manometric Resporimetry Test 17 July 1992

56 OECD 302 A Inherent Biodegradability: Modified SCAS Test- 12 May 1981

57) OECD 302 B Inherent Biodegradability:Zahn-Wellens/EMPA-Test 17 July 1992

58) OECD 302 C Inherent Biodegradability:Modified MITI-Test (II) 12 May 1981

59) OECD 303 A Simulation Test-Aerobic Sewage Treatment: Coupled units-Test- 12 May
1981

60) OECD 305 A Bioaccumulation: Sequential Static Fish Test 12 May 1981

61) OECD 305 B Bioaccumulation: Semi-Static Fish Test 12 May 1981

62) OECD 305 C Bioaccumulation: Test for the Degree of Bioconcentration in Fish 12
May 1981

63) OECD 305 D Bioaccumulation: Static Fish Test 12 May 1981

64) OECD 305 E Bioaccumulation: Flow through Fish Test 12 May 1981

65) OECD 306 Biodegradability in Seawater 17 July 1992

66) OECD 471 Genetic Toxicology: Salmonella typhimurium, Reverse Mutation Assay
26 may 1983

67) OECD 473 Genetic Toxicology: In vitro Mammalian Cytogenetic Test 26 May 1983

68) OECD 476 Genetic Toxicology: In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests 4
April 1984

69) OECD 479 Genetic Toxicology: In vitro Sister Chromatid Exchange Assay in
Mammalian Cells 23 October 1986

70) OECD 480 Genetic Toxicology: Saccharomyces Cerevisiae, Gene Mutation Assay
23 October 1986

71) OECD 481 Genetic Toxicology: Saccharomyces Cerevisiae, Mitotic Recombination
Assay 23 October 1986

72) OECD 482 Genetic Toxicology: DNA Damage and Repair /Unscheduled DNA
Synthesis in Mammalian Cells in vitro 23 October 1986

73) OECD (1995): Guidance Document for Aquatic Effects Assessment OECD Environment
Monographs No. 92 OCDE/GD (95) 18, Paris 1995.

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43
74) OECD (1995): Aquatic testing Methods for Pesticides and Industrial Chemical, Paris
(Draft Final Report, March, 1995).

75) American Society for Testing and Materials (1991): Standard guide for collection,
storage, characterization and manipulation of sediments for toxicological testing, ASTM
E 1391-90, Philadelphia PA

76) American Society for Testing and Materials (1993): Standard guide for conducting
sediment toxicity tests with freshwater invertebrates, ASTM E 1383-93, Philadelphia PA.

77) American Society for Testing and Materials (1980): Standard practice for conducting
acute toxicity tests with fishes, macroinvertebrates and amphibians, ASTM E 729-80,
Philadelphia PA
2)


78) ECETOC (1996): Aquatic toxicity testing of sparingly soluble, volatile and unstable
substances, Monograph No. 26, pp. 1-67, Brussels


2)
En el subcomit ISO/TC147/SC6 se puede obtener informacin adicional acerca del ensayo biolgico
(pretratamiento de muestreo, desempeo y evaluacin) y acerca de legislacin internacional acerca del
ensayo biolgico en el contexto de la valoracin y abatimiento de la contaminacin del agua.

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44
DOCUMENTO DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Water Quality - Sampling. Part 16:
Guidance on Biotesting of Samples. Switzerland, ISO, 1998. 32 p. (International Standard
ISO 5667-16:1998 )

Intereses relacionados