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NORMA TÉCNICA NTC-ISO
COLOMBIANA 5667-16
2000-12-15
CALIDAD DEL AGUA.

MUESTREO. PARTE 16. GUÍA PARA EL ENSAYO
BIOLÓGICO DE MUESTRAS
E: WATER QUALITY. SAMPLING. PART 16. GUIDANCE ON

BIOTESTING OF SAMPLE
CORRESPONDENCIA: esta norma es equivalente (EQV) a la

ISO 5667-16: 1998
DESCRIPTORES: agua; ensayo biológico; muestreo;

calidad del agua.
I.C.S.: 13.060.01
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435
Prohibida su reproducción
PRÓLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.
ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.
La norma NTC-ISO 5667-16 fue ratificada por el Consejo Directivo el 2000-12-15.
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma que
pertenece al Comité Técnico 000016 Gestión ambiental. Agua, a través de su participación en
Consulta Pública
ACEITES Y GRASAS VEGETALES INGEOMINAS

ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO-
AMBIENCOL INGENIEROS LTDA. IVON BERNIER LABORATORIO
ANTEK LTDA. LARKIN LTDA.
ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE INGENIEROS MINIPAK LTDA.
DE PETRÓLEOS MINISTERIO DE AGRICULTURA
BAVARIA S.A. MINISTERIO DEL MEDIO AMBIENTE
CARVAJAL S.A. MINISTERIO DE DESARROLLO
CEMENTOS BOYACÁ S.A. MINISTERIO DE MINAS Y ENERGÍA
CERVERIA LEONA S.A. MINISTERIO DE SALUD
COMPAÑÍA NACIONAL DE VIDRIOS S.A. MINISTERIO DE TRANSPORTE
DAMA NESTLÉ DE COLOMBIA S.A.
ECOPETROL PRODUCTOS ALIMENTICIOS MARGARITA
EMAC LTDA. S.A.
EMPRESA DE ACUEDUCTO Y SIEMENS SOCIEDAD ANÓNIMA
ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ SIKA ANDINA S.A.
EMPRESAS PÚBLICAS DE MEDELLÍN SMURFIT CARTÓN DE COLOMBIA S.A.
GASEOSAS COLOMBIANAS S.A. SOCIEDAD DE ACUEDUCTO, ALCANTARILLADO
GOBERNACIÓN DE CUNDINAMARCA- Y ASEO DE BARRAANQUILLA
SECRETARÍA DEL MEDIO AMBIENTE TEFCO LTDA.
GRIFFITH COLOMBIA S.A. UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
ICA UNIVERDIDAD DE LA SALLE
IDEAM UNIVERSIDAD JAVERIANA
INCOLBESTOS S.A. UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO
UNIVERSIDAD LIBRE
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC-ISO 5667-16
CALIDAD DEL AGUA.

MUESTREO. PARTE 16. GUÍA PARA EL
ENSAYO BIOLÓGICO DE MUESTRAS
1. OBJETO
Esta norma ofrece una guía práctica acerca del muestreo, tratamiento previo, desempeño y
evaluación de las aguas en el contexto del ensayo biológico. Se brinda información acerca de
cómo enfrentar los problemas del ensayo biológico que surjan como consecuencia de la
naturaleza de la muestra de agua y la adaptabilidad del diseño del ensayo.
Se tiene como propósito dar a conocer experiencia práctica en cuanto a las precauciones que
se deben tomar por medio de la descripción de métodos probados con éxito para solucionar o
evitar algunos de los problemas experimentales del ensayo biológico de las aguas.
En la medida de lo posible, se ha hecho referencia a normas internacionales y parámetros

existentes. También se utilizó información extraída de documentos publicados o de
comunicación oral.
Se trataron principalmente problemas relacionados con la sustancia, en cuanto a muestreo,

tratamiento previo y preparación de las muestras de agua para ensayo biológico y tratamiento
de las muestras durante el ensayo, en especial al realizar ensayos con aguas y aguas
residuales que contienen ingredientes inestables o removibles. Se delinearon los principios
básicos de aseguramiento de la calidad, evaluación de datos y presentación de resultados.
Se pone especial énfasis en el ensayo ecotoxicológico con organismos (“ensayo biológicos de

especies únicas”). Algunas características tratadas en esta guía general se aplican lo mismo
para estudios de biodegradación como de bio-acumulación en tanto se relacionan con el
muestreo y la preparación de muestras. También se discute la preparación de sustancias con
poca solubilidad y el ensayo más allá del límite de solubilidad del agua.
Esta norma no es aplicable al examen bacteriológico del agua. En otras normas internacionales
se describen los métodos adecuados
1
2. REFERENCIAS
Las siguientes normas contienen disposiciones que, a través de la referencia en este texto,
constituyen disposiciones de la presente norma. En la fecha de su publicación, las ediciones
indicadas se hallaban vigentes. Todas las normas se encuentran sujetas a actualización, y se
invita a las partes que logren a acuerdos con base en la presente norma a indagar sobre la
posibilidad de aplicar las ediciones más recientes de las normas indicadas a continuación. Los
miembros de la IEC e ISO mantienen registros de las normas internacionales vigentes en la
actualidad.
NTC-ISO ISO 5667-3: 1994, Water Quality. Sampling. Part 3: Guidance on the Preservation
and Handling of Samples
NTC-ISO 5667-10: 1992, Water Quality. Sampling. Part 10: Guidance on Sampling of Waste
Waters
3. MUESTREO
3.1 GENERALIDADES
La escogencia de puntos de muestreo representativos, frecuencia de muestreo, tipo de

muestras tomadas, etc. depende del objetivo del estudio. En general, el método de muestreo
para análisis químico es compatible con el propósito del ensayo biológico.
No obstante, algunos ensayos requieren de una particular manipulación y conservación del

agua y agua residual.
De acuerdo con el tipo de investigación (por ejemplo, ensayos de toxicidad o biodegradación) y

la forma en que se vayan a procesar las muestras, se hace necesario dividir la muestra en
diferentes partes que se preservan y/o almacenan bajo diversas condiciones y se procesan de
variadas maneras.
Si se han tomado varias muestras (por ejemplo, de diferentes lugares o en diversos tiempos) se
pueden combinar a fin de lograr mayor representatividad. Es recomendable mezclar estas
muestras por completo y, de ser necesario, dividirlas en sub-muestras. A fin de obtener sub-
muestras de igual calidad, se debería garantizar que la muestra a granel mantenga la
homogeneidad durante el proceso de sub-muestreo, por ejemplo, por medio de sacudida o
agitación. Esto es especialmente válido en el caso de las mezclas de dos fases, por ejemplo,
aguas que contienen partículas suspendidas, suspensiones algales. Se recomienda emplear
aparatos de muestreo de enfriamiento al combinar varias muestras tomadas en diferentes
tiempos.
3.2 MUESTREADORES/RECIPIENTES/CONTENEDORES
El volumen, la forma y el material de los recipientes depende de la naturaleza de la muestra

(por ejemplo, degradabilidad/estabilidad), la cantidad de repeticiones, el volumen requerido
para estos ensayos y la necesidad de preservar y almacenar las muestras antes del
procesamiento adicional.
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Se aconseja reducir al máximo el tiempo requerido para la congelación y el deshielo por medio
de la reducción del volumen de la muestras, es decir, el tamaño del recipiente. En general,
resulta adecuado emplear recipientes de un litro para la congelación. Para ensayos que
requieran mayores volúmenes, se recomienda dividir la muestra en recipientes que contengan
menos de 10 l.
El volumen total de la muestra tomada debería ser suficiente para cubrir cualquier ensayo
complementario o repetido. Se recomienda guardar las submuestras restantes almacenadas
congeladas por separado hasta que se realice la evaluación final.
El material de los recipientes debería ser químicamente inerte, de fácil limpieza y resistente al
calentamiento y congelación. Se recomiendan los recipientes de virio, polietileno o
politetrafluoroetileno (PTFE).
3.3 ESTADO DE LLENADO DE LOS CONTENEDORES
Se aconseja decidir si se llenan los contenedores por completo hasta el borde o sólo en forma
parcial, contando con un espacio de aire, teniendo en cuenta el tipo de muestra, el modo de
preservación y el ensayo biológico contemplado.
Los problemas relacionados con el llenado parcial pueden ser:
- Agitación intensificada durante el transporte, que conduce a la degradación de las

partículas adicionadas;
- interacción con la fase de gas, que conlleva al arrastre;
- oxidación de sustancias, que conduce, por ejemplo, a la precipitación de

compuestos de metales pesados.
Los problemas relacionados con el llenado completo pueden ser:
- agotamiento del oxígeno, con posible descomposición, que conduce a la

formación de metabolitos tóxicos (por ejemplo, nitrito, sulfuro);
- deterioro de la homogenización debido a la sacudida o agitación del volumen total.
Los contenedores de muestras, cuando se contempla la congelación para la preservación, no

deberían llenarse por completo a fin de permitir la expansión del volumen.
4. TRANSPORTE
Se recomienda proteger las muestras recogidas de la fragmentación, incremento de la

temperatura y contaminación externa. Se aconseja evitar la identificación errónea de las
muestras transportadas en hielo por medio de marcadores y/o rótulos a prueba de agua.
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5. PRESERVACIÓN Y ALMACENAMIENTO
Como se establece en la norma ISO 5667-3, resulta imposible emitir reglas absolutas para la
preservación, por ejemplo, la duración del posible almacenamiento y la eficiencia de varios
modos, puesto que estos aspectos dependen principalmente de la naturaleza de la muestra, en
especial de su actividad biológica.
Por lo general, las aguas potables y las freáticas son menos susceptibles a las reacciones
biológicas y químicas que las aguas superficiales, aguas residuales crudas o tratadas. Si la
composición química se puede anticipar en forma aproximada, se recomienda hacer referencia a
la norma NTC-ISO 5667-3 para los propósitos del ensayo biológico. Sin embargo, se deben
considerar algunas precauciones adicionales como se indica a continuación.
- Es aconsejable procesar las muestras para ensayo biológico preferiblemente sin

demora luego de la recolección a fin de evitar cambios en la composición original
como resultado de las reacciones físicas y químicas y procesos biológicos o
ambos. La duración máxima de almacenamiento no debería exceder las 12 h a
temperatura ambiente (máximo 25° C). Se recomienda conservar las muestras en
la oscuridad a fin de evitar el crecimiento de algas.
- Si no es posible realizar el ensayo inmediatamente después del muestreo (o

preparación de la muestra), por ejemplo, al preparar muestras compuestas, se
aconseja el enfriamiento o congelación.
- La forma más común y recomendada de preservar muestras de agua residual

consiste en enfriarlas a una temperatura entre 0° C y 5° C. Al enfriarse en esta
escala y almacenarse en oscuridad, la mayoría de muestras permanece estable
de manera normal hasta durante 24 h (véase la norma ISO 5667-10). El
enfriamiento debería comenzar tan pronto como sea posible después del
muestreo, ya sea en campo, por ejemplo en cajas frías con hielo, o en un
refrigerador en el vehículo de transporte.
- La congelación debe ser inferior a –18° C, de acuerdo con la norma ISO 5667-10
para permitir en general un incremento en la conservación. Por lo general, los
períodos de almacenamiento máximo van de unas cuantas semanas a dos meses
dependiendo de la estabilidad de las muestras.
- La experiencia ha demostrado que la calidad del agua residual puede afectarse

durante la congelación y el deshielo.
- Se aconseja excluir el uso de preservativos biocidales para el propósito del ensayo

biológico. Tampoco se recomienda la adición de ácidos muy concentrados o
bases para estabilizar las muestras, por ejemplo, HCl ó NaOH.
- Se debería enfatizar que, si existe duda, el analista químico y el técnico del

ensayo biológico deberían consultarse entre sí antes de decidir acerca del método
de manipulación y preservación de las muestras. Si no son compatibles las
técnicas de preservación para el análisis químico y para el ensayo biológico, se
deberían proporcionar submuestras separadas para los diferentes propósitos.
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6. APARATO Y EQUIPO
6.1 SELECCIÓN DEL APARATO
El tipo, la forma y el material del equipo técnico dependen del ensayo y la naturaleza de la
muestra. Todos los materiales que entran en contacto con la muestra de ensayo deben ser tales
que las interferencias causadas por sorción o difusión del material de ensayo, por elusión de
materia extraña (por ejemplo plastificantes) o por crecimiento de organismos, se mantengan en
un nivel mínimo. Resultan convenientes los materiales inertes, por ejemplo, el vidrio, PTFE. Las
conexiones de tubos deberían ser lo más cortas posibles y se recomienda cambiarlas
periódicamente. Se aconseja evitar la contaminación del material de ensayo, debido por ejemplo,
a la grasa de rectificado proveniente de tapones o accesorios. No resultan convenientes los tubos
hechos de cobre, aleación de cobre o plásticos no-inertes.
6.2 SILIZACIÓN
Con el propósito de reducir al máximo la adsorción del material de ensayo en los contenedores,
tuberías, vidrios o plásticos se puede silizar (siliconizar) por medio de inmersión o enjuague en
una solución de fracción masiva al 5 % de diclorodimetilsilano en cloroformo o heptano. A medida
que el solvente orgánico se evapora, el silano se deposita en la superficie, la cual debería
enjuagarse muchas veces con agua o calentarse a 180 °C durante 2 h antes de usarse. Se
aconseja emplear la silización sólo si se van a ensayar ingredientes del agua o sustancias de alta
adsorción y no se encuentra disponible material inerte adecuado (por ejemplo, PTFE).
6.3 LIMPIEZA DE APARATOS Y EQUIPO
Antes de usarse, se recomienda limpiar el aparato y el equipo con adecuados agentes de

limpieza, por ejemplo, ácido clorhídrico, hidróxido de sodio, detergentes, etanol, ácido
sulfúrico/peróxido de hidrógeno y, siempre que sea adecuado, se esterilizan térmica o
químicamente (por ejemplo, con solución de hipoclorito). No se aconseja emplear ácido
cromosulfúrico.
El enjuague repetido del aparato con agua destilada (o agua con el mismo grado de pureza),
garantiza que no hayan quedado vestigios del agente de limpieza o desinfección.
A fin de remover los vestigios del uso anterior, se recomienda el lavado con ácido antes del
lavado final con agua destilada.
7. TRATAMIENTO PREVIO Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS
7.1 GENERALIDADES
El siguiente diagrama de flujo (véase la Figura 1) contiene información sobre términos

comúnmente empleados (aunque algunas veces en forma diferente) en las normas y parámetros
del ensayo biológico.
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Muestra, (ejemplo: sustancia,

agua (residual))
Etapa preparatoria, ejemplo: disolución,

homogeneización, filtrado, neutralización, aeración
Muestra para ensayo, (ejemplo:

sustancia disuelta, agua residual
neutralizada)
Agua de dilución
Medio nutriente
Medio de ensayo Medio de control

incluyendo muestra excluyendo muestra para
para ensayo (diluida) ensayo
Lote de ensayo Organismos de ensayo, Lote de control

inóculo.
Figura 1. Preparación de las muestras para bioensayo
La muestra, es decir una sustancia química, es una preparación, sólida o en solución, una
mezcla de varias sustancias, agua o agua residual. La muestra de ensayo se elabora a partir de
la muestra por medio de varios pasos específicos de la toma de muestra y el ensayo, por
ejemplo, por medio de disolución, homogenización, sedimentación, filtrado, neutralización o
aeración. Se adiciona agua de dilución para preparar una serie de diluciones definidas. El medio
de ensayo (incluyendo la muestra de ensayo) se obtiene luego de la adición del medio nutriente.
El lote de ensayo final se obtiene por medio de la adición de organismos de ensayo, que en el
caso de microorganismos, se llama inóculo. En el lote de control o, en varios lotes paralelos, se
preparan los controles a partir de una mezcla de agua de dilución y solución nutriente con
organismos de ensayo sin muestra de ensayo.
Cuando el efecto o el comportamiento de una sustancia se conoce a partir de ensayos previos

(“sustancia de referencia”) y cuando dicha sustancia se examina dentro del marco de una serie
de ensayos como muestra de ensayo, esto se denomina lote de referencia.
7.2 DESHIELO
Se aconseja deshelar las muestras almacenadas congeladas antes de su uso. Se recomienda el

agua corriente o un baño de agua caliente a una temperatura que no exceda los 25 °C, junto con
una suave sacudida, a fin de evitar el sobrecalentamiento local.
Resulta esencial el deshiele de las muestras antes de usarse, puesto que el proceso de
congelación puede tener el efecto de concentrar algunos componentes en la parte interior de la
muestra que se congela en último lugar. El tratamiento con microondas involucra el riesgo de
sobrecalentamiento.
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7.3 HOMOGENEIZACIÓN
Es recomendable asegurar una distribución uniforme de todos los componentes solubles y

particulados. Se puede aplicar una agitación suave, una sacudida vigorosa, tratamiento
ultrasónico o dispersión mecánico de alta velocidad, de acuerdo con la naturaleza de las
muestras. Durante este paso del tratamiento, se debería prestar atención a la pérdida potencial
de ingredientes volátiles.
Como regla general, se debería tener cuidado de que el estado original de la muestra se restaure
o por lo menos se altere lo mínimo posible.
7.4 SEPARACIÓN DE MATERIA SOLUBLE Y PARTICULADA
En general, los ensayos biológicos se realizan con la muestra original. Sin embargo, en algunos
casos, grandes cantidades de materia particulada, lodo y sedimento interfieren con los requisitos
comportamentales de los organismos de ensayo (atascamiento de agallas de peces, deterioro del
filtro de alimentación de dahpnids, limitación ligera de algas).
Si no se quiere que estos efectos deletéreos se reflejen en los resultados del ensayo, se pueden
evitar o superar dichas interferencias por diferentes medios.
Las aguas ricas en partículas pueden dar origen a interferencias, por ejemplo, al realizar
cuantificación por medio de un contador de partículas. De igual manera, el conteo microscópico
se ve bastante deteriorado. La dosificación continua se considera poco confiable debido al
atascamiento y bloqueo de la tubería.
Sin embargo, la filtración, la centrifugación y otros métodos de separación involucran el riesgo de

que los componentes activos, que se adhieren a las partículas, sean removidos antes del
ensayo. Además, se deben tener en cuenta los problemas relacionados con la filtración, por
ejemplo la adsorción y lixiviación en materiales de filtro. La sedimentación y centrifugación evitan
estos problemas. Al realizar ensayos en presencia de partículas que causen problemas severos,
se recomienda permitir que la muestra se asiente durante de 30 min a 2 h ó se lleva a cabo una
filtración gruesa (>50 µm), removiendo así solo partículas gruesas. La masa de la partícula
separada puede examinarse por separado.
Algunos de los métodos de ensayo ofrecen la posibilidad de determinar un factor de corrección

para parámetros tales como la turbidez.
Las aguas ricas en bacterias interfieren en los ensayos relacionados con actividad de bacterias,
por ejemplo, la inhibición de la respiración. Por lo menos en forma parcial, se puede dar cuenta
de la interferencia debida a la actividad de las bacterias en la muestra, por medio del ejercicio de
controles convenientes. Al ensayar algunas algas, cardúmenes de peces pequeños o cultivos
celulares, las infecciones bacteriales pueden causar interferencia. Todos los métodos de
esterilización disponibles, tales como el tratamiento térmico o UV o la filtración de la membrana
(0,2 µm) involucran un alto riesgo de efectos secundarios. Cuando es necesario el filtrado es
preferible la filtración de fibra de vidrio. Generalmente, la centrifugación, por ejemplo 10 min a 4 500 g
± 1 500 g, es preferible a la filtración.
7.5 CONCENTRACIÓN PREVIA
La concentración previa de las muestras incrementa la concentración no solo de sustancias

peligrosas sino también de otros constituyentes del agua, los cuales pueden ser deletéreos en
altas concentraciones.
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Adicionalmente resulta esencial tener en cuenta que en cualquier caso la concentración previa es
selectiva según del procedimiento aplicado, lo cual altera el patrón de composición original de los
ingredientes del agua, por ejemplo:
- La extracción líquido / líquido con solventes orgánicos y la extracción de fase

sólida por medio de la adsorción de sólidos (por ejemplo las resinas XAD) resultan
particularmente eficientes para los componentes hidrofóbicos del agua. La
intensidad iónica y la presión osmótica pueden atenuarse. Se pueden excluir los
iones tóxicos, los químicos polares y los ingredientes coeficientes de agua (por
ejemplo, el enmascaramiento), tales como ácidos húmicos.
- La evaporación y la congelación-secado pueden conllevar a pérdida de sustancia

volátiles y aumentar la intensidad y la presión osmótica;
- La ultrafiltración puede conducir a una pérdida especialmente de pequeñas

moléculas que penetran la membrana.
El incremento en la concentración por encima del umbral de solubilidad puede conducir a la

precipitación o floculación de sustancias disueltas previamente.
La acumulación biológica no se puede simular por medio de la concentración previa de muestras,

puesto que los factores de bioconcentración (BCF) no pueden relacionarse o extrapolarse.
Algunos ingredientes de la muestra de agua que se esté concentrando pueden experimentar

reacciones químicas a una tasa superior a la de la muestra original.
Se pueden obtener valores adecuados blancos sólo si se encuentran disponibles muestras de

referencia descontaminadas, por ejemplo aguas arriba de la fuente de contaminación. Es
permisible el incremento en la salinidad al preparar blancos con igual osmolaridad y composición
iónica similar (por ejemplo, la proporción Na:K).
No es posible extrapolar a partir de ensayos agudos con muestras concentradas previamente

hasta los efectos crónicos de la muestra original.
Por consiguiente, es preferible escoger un sistema de ensayo más sensible o prolongar el tiempo
de exposición en vez de realizar previa concentración de la muestra. Si no existe método
sensible disponible para ensayar la muestra original y se aplica un procedimiento de
concentración previa, el resultado es más discutible entre mayor sea el factor de concentración.
Por las razones mencionadas anteriormente, por lo general los ensayos para toxicidad aguda y
crónica con muestras concentradas previamente son insignificantes y no se recomiendan. En
todos los casos, los resultados de ensayo obtenidos con muestras de agua previamente
concentradas deberían interpretarse con extrema precaución. Las investigaciones preliminares
de este tipo no pueden normalizarse y deberían validarse por medio de investigaciones
extensivas adicionales.
7.6 AJUSTE DEL pH
La selección del valor del pH al cual se debe ajustar la muestra se rige por el objetivo del ensayo,
es decir:
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- El ajuste del pH del agua de recibo producirá resultados más representativos del
efecto de los tóxicos una vez se hallan en el ambiente;
- El ajuste de un pH definido entre 6 y 9 (el cual generalmente es tolerable para la

biota) permitirá la expresión de tóxicos ionizables que de otra manera serían
enmascarados por las condiciones de pH por fuera de esta escala.
Por lo general, se neutralizan las muestras con valores pH extremos que exceden los límites de
tolerancia de los organismos de ensayo. Se recomienda omitir la neutralización si el efecto del pH
se va a reflejar en el resultado del ensayo o si se observa modificación física o reacciones
químicas (por ejemplo, precipitación) debido al ajuste del pH. La concentración del ácido o base
requerida para la neutralización debe ser tal que la modificación del volumen sea la menor
posible. Se aconseja evitar el paso del punto neutral.
No es recomendable que el agente de neutralización experimente una reacción con los

ingredientes en la muestra, que pudiera, por ejemplo, conducir a la precipitación o al
acomplejamiento. Además, no se debería influenciar el organismo de ensayo por medio de la
ampliación o inhibición. Por lo general, se recomiendan las soluciones de ácido clorhídrico o
hidróxido de sodio.
7.7 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE PARTIDA Y LOTES DE ENSAYO
7.7.1 Sustancias solubles en agua
Al preparar la solución de partida, la porción pesada de la sustancia no debería exceder la

cantidad máxima por disolver (<concentración de saturación). Por medio de la agitación o
calentamiento o ambos, se puede ampliar la cinética de la solución. No obstante, esto no debiera
conducir a la pérdida de sustancia o descomposición térmica de la muestra de ensayo.
7.7.2 Emulsiones y suspensiones estables en agua residual
En el caso de las emulsiones (por ejemplo, las emulsiones de aceite de corte) y las suspensiones
(por ejemplo leche de látex) que son estables en agua y también con las sustancias que forman
estas entidades estables con agua, se recomienda preparar diluciones graduadas.
Si no se obtiene una distribución homogénea en el licor de partida, se recomienda agitar o

sacudir la mezcla hasta por un día.
7.7.3 Sustancias con poca solubilidad
7.7.3.1 Generalidades
Las sustancias con una solubilidad en agua inferior a aproximadamente 100 mg/l deberían
considerarse como escasamente solubles. Al examinar sustancias con poca solubilidad, se debe
garantizar que no permanezca materia no disuelta como sedimento, como partículas flotantes o
en forma dispersa. Por lo tanto, a fin de asegurar resultados reproducibles, se deben emplear
métodos que aseguren la mejor distribución homogénea del compuesto de ensayo en el lote.
En el caso de ensayos de toxicidad, es aconsejable indagar si la sustancia tiene efectos en la

escala de su solubilidad en el agua. Se debería tener presente que en el caso de ciertas
sustancias puras algunas veces existe traslape entre sistemas dispersos-moleculares y
micelares, y dispersos coloidales hasta dispersos separados (por ejemplo surfactantes de
isómero puros). En el caso de las mezclas de isómero, por ejemplo, surfactantes, no existe límite
9
de solubilidad de sustancia-específica. Los métodos ópticos simples (por ejemplo, las mediciones
de dispersión luminosa) no permiten ninguna determinación confiable del grado de dispersión.
Resulta imposible recomendar un método único para generar una solución óptima o distribución
de las sustancias en el medio, puesto que el método seleccionado debería corresponder a las
propiedades físicas de la sustancia. Por tal razón se debe dejar la selección de un método
adecuado a disposición del investigador de acuerdo con su experiencia o del fabricante según la
información de la producción.
La siguiente guía se deriva de la experiencia práctica y contiene sugerencias acerca de las

formas y medios que posibilitan al investigador, luego de sopesar los pros y los contras,
seleccionar el método más conveniente.
7.7.3.2 Ensayo en la escala de solubilidad del agua
Para este propósito, se mezcla una porción pesada definida de la sustancia (por ejemplo 100 mg)
por medio de agitación o sacudida con 1 litro de agua destilada aproximadamente durante 24 h,
preferiblemente en la oscuridad. Debe indicarse la porción pesada para preparar el licor de
partida. Siguiendo la separación de la fase, se separa por completo la fase no disuelta por medio
de filtración (cuando sea necesario se emplea un filtro de membrana, de tamaño de poro de 0.2 µm)
o por centrifugación. Se prepara la serie de dilución con la fase acuosa. De comprobarse necesario,
según las propiedades de la sustancia (por ejemplo, la alta viscosidad o descomposición en el
agua), se deberían considerar tiempos menores o mayores de mezcla, probablemente
involucrando el empleo de agentes auxiliares.
Nota. Dependiendo de las sustancias por ensayarse, las técnicas de centrifugación y filtración pueden conducir a
diferentes resultados.
Si se reduce la solubilidad a través de la adición de componentes medios (por ejemplo, sales

nutrientes), resulta ventajoso preparar una solución saturada mezclando la sustancia con el
medio de ensayo. En casos individuales, se debe considerar el remplazo de las sales (por
ejemplo, iones de Ca ó Mg) por otros (por ejemplo, iones de Na ó K), que no se precipitan.
Se puede lograr una distribución fina de fluidos altamente viscosos por medio de la fragilización a
bajas temperaturas (por ejemplo, empleando nitrógeno líquido) seguida por aplastamiento
mecánico (por ejemplo en molinos batidores).
Se deben recocer los filtros para la recolección de constituyentes no disueltos (filtros

inorgánicos). Los filtros orgánicos, por ejemplo de policarbonato, requieren de tratamiento
repetido en agua destilada en ebullición con el propósito de garantizar que no se transfieran
componentes del material de filtro en la solución de ensayo. No se recomiendan los filtros de
acetato de celulosa. Según el material del filtro, no solo se puede capturar constituyentes sin
disolver por filtración, sino que la sustancia de ensayo disuelta también puede eliminarse por
medio de la sorción. A concentraciones <1mg/l esto puede conducir a una considerable pérdida
de sustancia. La pérdida puede reducirse descartando la primera porción del filtrado. El empleo
de materiales de filtros inorgánicos, en general, conducirá a pérdidas menores que las obtenidas
con filtros orgánicos.
Existe una variedad de medios mecánicos y químicos para alcanzar la concentración de

saturación. No obstante, se aconseja tener en mente que debería darse preferencia a auxiliares
mecánicos para la preparación de soluciones saturadas. Sólo en casos excepcionales se debería
recurrir a auxiliares químicos (ácidos, bases, solventes).
Los auxiliares que se pueden emplear para alcanzar la concentración de saturación son:
10
a) Rectificador de velocidad alta/sonicación (ventaja: mayor velocidad de disolución;

desventajas: separación de fase más difícil, posible descomposición y
calentamiento por medio de la entrada de energía). En la norma ISO 10634 se
ofrecen mayores detalles.
b) Incremento de la temperatura (ventaja: por lo general mayor solubilidad y mayor

velocidad de disolución; desventajas: incremento de volatilización, riesgo de
descomposición y reacciones de hidrólisis, posibilidad de sobresaturación con el
resultante retraso de precipitación). No es aconsejable enfriar las soluciones
saturadas.
c) Empleo de ácidos/bases con la resultante neutralización (ventaja: explotación de

mayor solubilidad de forma protonada; desventajas: sólo es aplicable en casos
excepcionales, cuando existe extremo riesgo de que los valores de pH sufran
modificación química en la muestra de ensayo, por ejemplo por medio de
hidrólisis, algunas veces tal vez muy lento establecimiento de equilibrio siguiente
a la neutralización, por ejemplo, los ácidos grasos / jabones).
d) Disolución de la sustancia en un solvente volátil, no acuoso, miscible (por ejemplo,

n-hexano ó éter de petróleo) que se desactiva después de mezclar con agua
(ventaja: distribución fina rápida de la sustancia de ensayo; desventajas: la
sustancia de ensayo también puede arrastrarse, los residuos de solvente lentos en
el lote de ensayo no pueden evitarse).
e) Disolución de la sustancia en un solvente no tóxico, miscible en agua (por ejemplo,

etanol, acetona, acetonitrilo, dimetil sulfóxido, dimetil formamida). Al seleccionar el
solubilizador, se deben tener en cuenta su capacidad de solubilización, toxicidad,
degradabilidad y su volatilidad. Los agentes solubilizantes (concentración <0,1 g/l)
inicialmente permanecen durante algún tiempo en el lote de ensayo. Es
improbable que conduzcan a un mayor incremento en la concentración de
saturación en el agua; en cambio, conllevan a la rápida distribución fina de la
sustancia de ensayo en el licor de partida. Se hace necesario un lote de control
adicional con la concentración máxima del solvente empleado en el ensayo.
Incluso si no se han observado efectos de deterioro, no se puede excluir el hecho
de que la presencia del solvente afecta la acción de la sustancia del ensayo en los
organismos del mismo, por ejemplo, ayudándole a atravesar la pared de la celda.
f) Sorción de la sustancia sobre un portador inerte. Se puede preparar una solución

acuosa saturada por medio de la aplicación de la sustancia, cuando sea
necesario, empleando un solvente volátil tal como el n-hexano o el éter de petróleo
en un transportador inerte (por ejemplo, perlas de vidrio, sílica gel, resinas de
cromatografía). Esta solución se introduce en un sistema de flujo continuo y se
enjuaga con agua. Con frecuencia las sustancias disolventes se encuentran como
soluciones genuinas dispersas molecularmente.
7.7.3.3 Ensayo por encima del límite de solubilidad. En estudios de degradación, las sustancias
poco solubles eventualmente se ensayan por encima del límite de solubilidad. Es importante
alcanzar una tasa de distribución alta en la materia no disuelta a fin de asegurar un área de
contacto amplia entre los microorganismos y la sustancia. Siempre es necesario sacudir o agitar
los lotes de ensayo en todo el ensayo con el propósito de garantizar una disolución constante de
la sustancia. Se recomiendan los siguientes métodos.
11
a) Dosis directa
Se introduce la sustancia directamente en el lote de ensayo. Las platinas de

microscopio resultan convenientes para la introducción de sustancias sólidas o
líquidos de alta viscosidad. Los solventes miscibles en agua, no tóxicos, no
degradables, por ejemplo, dimetil sulfóxido, se emplean a menudo como
solubilizadores (véase numeral 7.7.3.2. Esta técnica se restringe a sustancias de
ensayo no volátiles.
b) Tratamiento ultrasónico
Con frecuencia, el tratamiento con ultrasonido (por ejemplo, 20 kHz, 30 min)

puede conducir a una dispersión mecánica suficientemente estable que, luego de
aprox. 15 min a 30 min de sedimentación, puede distribuirse directamente a lotes
de ensayo individuales. Son necesarios métodos analíticos adecuados, por
ejemplo, el de Carbón Orgánico Total (TOC) o el análisis específico para
determinar la concentración inicial del lote de ensayo.
c) Adsorción de la sustancia sobre un portador inerte
Esta debería estar de acuerdo con los procedimientos delineados en el numeral 7.7.3.2
(adsorción de la sustancia sobre un portador inerte). El portador con la sustancia
de ensayo aplicada en forma homogénea ahora hace parte del lote de ensayo.
Este método no es conveniente para sustancias volátiles, puesto que se eliminan
durante la aplicación y subsecuente secado del portador.
d) Dispersión de las sustancia con un agente emulsificante
Los agentes emulsificantes de la concentración empleada (≤100 mg/l) deberían

ser no tóxicos y estables durante el período de ensayo. Se pueden emplear las
siguientes sustancias como agentes emulsificantes:
- monolaurato de sorbitol y polietileno;
- trioleato de sorbitol y polietileno;
- nonilfenol-20 EO-acetal (muy adecuado para ensayos de degradación);
- aceite de ricino modificado (menos adecuado para ensayos de

degradación)
- copolímeros de óxido de etileno/óxido de propileno (adecuado para

ensayos de degradación)
A fin de preparar una emulsión químicamente estable, se recomienda mezclar la sustancia de

ensayo con el agente emulsificante antes de introducirla en el agua. En caso de que se emplee
un solvente volátil no miscible en el agua adicional (por ejemplo n-hexano o éter de petróleo) para
la preparación de una emulsión, se recomienda arrastrar la muestra de ensayo tratada
previamente antes de introducir el organismo de ensayo.
Las sustancias sólidas con poca solubilidad por lo general no se ensayan por encima de su límite
de solubilidad. Los ensayos de toxicidad por encima de dicho límite son solo aconsejables para
sustancias sólidas de rápida dispersión y sustancias sólidas comercializadas como dispersiones o
que entran en contacto con agentes emulsificantes cuando se emplean adecuadamente.
12
Los estudios de bioacumulación y los ensayos biológicos no deberían realizarse por encima del límite de
solubilidad.
La propensión de una sustancia a dispersarse en el agua depende sobre todo de su densidad, su

viscosidad y su tensión superficial. Al incrementar la entrada de energía, se puede lograr un
tamaño de partícula menor y por lo tanto, a menudo, una mayor estabilidad de la dispersión. No
obstante, existen indicaciones de que el efecto de deterioro de una emulsión también se ve
influenciado por el tamaño de las gotitas emulsificadas. Es probable que se encuentren
disponibles diferentes recorridos para que los organismos capten las partículas emulsificadas de
las sustancias disueltas.
Con frecuencia las dispersiones mecánicas son inestables. Algunas veces la separación de la
fase puede evitarse por medio de la agitación constante, sacudida u otro modo de mezclar la
muestra de ensayo durante el mismo. Se debería tener cuidado para evitar cualquier daño
mecánico a los organismos de ensayo.
Nota. Las gotitas de aceite y películas superficiales pueden tener efectos deletéreos sobre los organismos,
especialmente en los daphnids. Es posible evitar el contacto de estos con las películas superficiales por medio de la
separación mecánica mediante redes / tamices u oscurecimiento de la superficie.
Se puede valorar la estabilidad de las emulsiones por observación visual, análisis químico (por
ejemplo, Carbón Orgánico Disuelto (DOC)/TOC; y por mediciones de turbidez. En principio, se da
prioridad a las dispersiones preparadas en forma mecánica sobre las realizadas con agentes
emulsificantes.
Existen dos maneras de producir una serie de dilución a partir de una dispersión de partida con
agentes emulsificantes:
- manteniendo una concentración constante del agente emulsificante;
- manteniendo una proporción de concentración constante de sustancia de ensayo

a agente emulsificante.
Generalmente, se debería preferir mantener la misma concentración del agente emulsificante en

todos los lotes de ensayo a fin de asegurar que la proporción concentración-efecto dependa
solamente de la concentración de la sustancia del ensayo, con lo que se evita la degradación de
la emulsión en diluciones más altas. Siempre es necesario un lote de control adicional con la
máxima concentración del emulsificador.
Al interpretar los resultados, se debería tener presente que los efectos observados son efectos
combinados, incluso si el emulsificador en sí no muestra ningún efecto en el lote de control.
7.7.3.4 Problemas especiales con mezclas de sustancia o productos técnicos. Al ensayar sustancias
con subingredientes tóxicos de rápida solubilidad (por ejemplo, el tetrabutil estaño contaminado con
óxido de tributil estaño ) y mezclas de sustancias poco solubles (por ejemplo, productos de aceite
mineral), se pueden enriquecer los componentes de más rápida solubilidad en el extracto acuoso.
Con frecuencia esto se hace evidente por un alza en el DOC con incremento de porción masiva en la
presencia de una fase no disuelta ya existente. Con el propósito de registrar efectos de esta clase, se
recomienda preparar una solución acuosa saturada adicional y ensayarla con una proporción mayor
de mezcla (por ejemplo, 0,1 g ó 1 g de sustancia por litro de agua). La comparación de los hallazgos
obtenidos con varias proporciones de mezcla puede indicar los efectos de componentes de rápida
solubilidad de una mezcla heterogénea.
13
Como alternativa a este procedimiento, es aconsejable ensayar mezclas de sustancias que no

presenten rápida solubilidad y sustancias con componentes menores de rápida solubilidad por
medio de la preparación de una serie de extractos acuosos en la que la tasa de carga disminuya
geométricamente. Los extractos acuosos deberían ensayarse de forma no diluida y el resultado
debería referirse no a la concentración en la fase acuosa sino a las tasas de carga. Es importante
observar que los extractos acuosos no se deberían diluir.
Puesto que la composición química de la fracción disuelta de las mezclas con frecuencia varía
considerablemente desde el producto original, es aconsejable examinar los efectos del producto
original en forma dispersa (véase el numeral 7.7.3.3).
8. TRATAMIENTO DE MUESTRAS DURANTE EL ENSAYO
8.1 AIREACIÓN
Debería darse cuenta de la demanda de oxígeno de animales de ensayo y microorganismos

heterotróficos por ejemplo por medio de la aireación continua o intermitente. En casos especiales,
por ejemplo en aguas residuales con una demanda de oxígeno bioquímico extremadamente alta
(BOD), es necesario suministrar oxígeno puro en vez de aire. Se recomienda evitar la
sobresaturación. Los problemas de arrastre de volátiles y perdidas de sustancias por espumado
pueden evitarse mediante métodos especiales (véase el numeral 10.1.3)
8.2 SUSPENSIÓN
La materia particulada contenida en el agua puede suspenderse durante el ensayo si no se

anticipan interferencias (véase el numeral 7.4). Los microorganismos planctónicos deberían
mantenerse en suspensión durante el ensayo mediante métodos apropiados, por ejemplo, por
sacudida, agitación, rotación, aireación.
Se debería tener cuidado a fin de evitar el deterioro mecánico de los organismos de ensayo.
8.3 AJUSTE Y CONTROL DEL pH
En algunas circunstancias (por ejemplo, debido a la aireación) el pH se desviará incluso si la

muestra se ha neutralizado previamente. El ajuste y control del pH durante el ensayo deberían
decidirse de acuerdo con la causa de la desviación del pH y el objetivo del ensayo. La desviación
abiótica del pH puede distinguirse mediante un lote sin organismos.
A partir de la opinión del analista y el regulador puede ser deseable trabajar con un sustancia en
un estatus químico constante claramente definido. Se debería evitar o contrarrestar el incremento
en el nivel del pH, debido a problemas prácticos, por ejemplo despojamiento de CO2 por
aeración.
Esto es especialmente importante para el cambio dependiente del pH de la toxicidad del pescado
con amoníaco ionizado y no ionizado. Otros ejemplos de sustancias que presentan toxicidad
dependiente del pH son los sulfuros, cianuros, aminas, fenoles y ácidos orgánicos.
Sin embargo, si el cambio en el pH durante el ensayo es un efecto de los procesos vitales

fundamentales tales como la fotosíntesis en el crecimiento de las algas, la cual es necesaria junto
con el consumo de CO2, resulta razonable no ajustar el pH.
14
Una transición permitida sobre una amplia escala no sólo intensificaría la aplicabilidad y el valor
indicativo del ensayo, sino que también ofrecería la oportunidad de activar el efecto de un
compuesto químico que, de otra forma, podría no haberse detectado.
El incremento del valor de pH en los ensayos con algas puede reducirse por varios medios, a
saber:
- adición de amortiguador;
- adición de carbonato;
- adición de CO2 gaseoso;
- incremento del intercambio de gas mediante aeración o sacudida, o ambas.
- limitación de la luz;
- imitación de nutrientes;
- limitación de temperatura;
- limitación de la duración del ensayo;
- reducción del inóculo
Todas estas opciones tienen efectos y consecuencias secundarios indeseados, por ejemplo, la
reacción con un compuesto de ensayo, la precipitación, arrastre de volátiles, complicación del
diseño del ensayo, limitación de crecimiento, problemas de medición. En general, el intercambio
optimizado de gas y la conducción de ensayos en los límites inferiores de luz y temperatura
reducirán el problema.
Se puede lograr el control del valor pH en ensayos de peces mediante la adición de dióxido de
carbono o ácido clorhídrico o conduciendo ensayos bajo concentraciones de CO2 atmosféricas
específicas. El ajuste del pH durante el ensayo requiere de regulación de retroalimentación
separada para cada recipiente de ensayo.
9. GUÍA GENERAL EN CUANTO AL DISEÑO DEL ENSAYO
9.1 PREPARACIÓN DE DILUCIONES
Por razones fisiológicas, no se pueden llevar a cabo los ensayos biológicos que emplean
organismos acuáticos usando agua desionizada como medio. Dependiendo de la naturaleza del
análisis, se recomienda emplear agua de grifo libre de cloruro, agua fresca sintética o agua de
mar (posiblemente con aditivos nutrientes), agua freática o superficial. Esta última es menos
adecuada para investigaciones toxicológicas pero más indicada para investigaciones ecológicas,
por ejemplo, para valorar la capacidad para soportar carga del agua en relación con la situación
local (adaptación de carga existente).
15
Si no se emplea un medio sintético estandarizado, será necesario ajustar la dureza del agua, el
pH y, posiblemente, la proporción molar específica de iones de calcio a iones de magnesio al
realizar ensayos de toxicidad específica de la sustancia. Para algunos ensayos con organismos
marinos, es esencial el empleo de agua marina natural.
Se combinan las cantidades definidas de la muestra con los volúmenes correspondientes del
agua de dilución con el propósito de brindar la concentración deseada de la dilución.
Se emplea como agua de la dilución el agua especificada en la norma adecuada. Por lo general,
se utilizan niveles de concentración progresiva en series geométricas.
9.2 ENSAYOS DE LÍMITE Y DEFINICIÓN DE LA ESCALA
No es necesaria una serie de dilución cuando solo se desea averiguar si una concentración
determinada o nivel de dilución presenta algún efecto (ensayo de límite).
Resulta conveniente en un ensayo de definición de escala preliminar con pocos organismos de

ensayo determinar primero la serie aproximada de concentraciones efectivas, y sólo después
conducir el ensayo principal. Las muestras inestables (por ejemplo de agua residual) pueden
alterar las propiedades durante el tiempo necesario para el ensayo preliminar. En este caso se
aconseja realizar el ensayo principal de inmediato, posiblemente con gradaciones preliminares
sobre una amplia serie de concentración.
9.3 ENSAYOS COMPLEMENTARIOS
Cuando, en casos particulares, las concentraciones seleccionadas no cubren completamente la

serie de concentraciones efectivas, se aconseja repetir el ensayo o conformar una serie de
ensayos complementarios. En este caso, por lo menos dos concentraciones deberían ser
idénticas con dos de las series de ensayos precedentes. Solo es posible una evaluación conjunta
de las dos series de ensayos si las concentraciones graduadas no presentan variaciones
mayores que las existentes entre los lotes paralelos dentro de una serie. Los ensayos
complementarios no son practicables en el caso de aguas y aguas residuales sujetas a
alteración.
9.4 LOTES DE REFERENCIA Y CONTROL
Para cada ensayo, se recomienda examinar uno o, cuando sea apropiado, varios lotes de control
paralelos (véase el numeral 9.5). Los lotes de control o de referencia deberían ser idénticos al lote de
ensayo, pero no deberían contener los ingredientes por ensayarse. A fin de identificar las
interferencias posibles en el curso del ensayo y excluir organismos de ensayo inconvenientes, se
aconseja ensayar una sustancia de efecto conocido (sustancia de referencia) a intervalos regulares.
En el caso de los experimentos animales que requieren autorización, se debería mantener en el
mínimo la cantidad de lotes paralelos y de referencia. Las sustancias que se emplean con frecuencia
en ensayos de toxicidad son, por ejemplo, dicromato de sodio, 3,5-diclorofenol.
9.5 LOTES PARALELOS/RÉPLICAS
9.5.1 Generalidades
Al ensayar réplicas para cada nivel de concentración / dilución, se hace posible obtener
observaciones independientes bajo condiciones que de otro modo serían idénticas. Las
condiciones marginales tales como la temperatura y luz deberían ser iguales y constantes en la
medida posible. A fin de equilibrar las diferencias restantes, es aconsejable no reorganizar las
réplicas en disposición colateral.
16
Notas:
1) Repetición de mediciones: Al realizar varias mediciones del mismo lote de ensayo (por ejemplo, diversos
conteos de un único lote en el ensayo de algas), estas no son observaciones verdaderamente independientes
(réplicas) y, más bien, sirven para corregir imprecisiones en la medición. En dichos casos, es posible
determinar el valor medio de las repeticiones y emplearlo como el “mejor valor único” en cálculos estadísticos.
En el caso del ensayo de inhibición de crecimiento de algas, consecuentemente se pueden considerar los
lotes paralelos como réplicas verdaderas, independientemente del número de muestras que se tomaron de
ellos.
2) Pseudoréplicas: Si, por ejemplo, en un ensayo de reproducción de Daphnia, se mantienen varios animales en
un recipiente, lo cual si
gnifica que la cantidad de prole generada se puede determinar sólo por recipiente ( y no por animal), el número de
observaciones independientes (réplicas) corresponde al número de recipientes y no al número de animales.
La cantidad de lotes paralelos a menudo es restringida debido a la reducción del tiempo, espacio
o recursos financieros. Adicionalmente, en el caso de los ensayos con animales vertebrados, es
imperativo que el número de animales de ensayo se mantenga en el mínimo por razones éticas.
Un requisito adicional para determinar la cantidad de lotes paralelos por nivel de concentración y en
experimentos de control es el tipo de la evaluación propuesta del ensayo (véase el numeral 12).
9.5.2 Concentraciones de umbral (NOEC/LOEC)
En contraste con los ensayos de límite (véase el numeral 9.2), las concentraciones de umbral
(NOEC/LOEC, véase el numeral 12.3.1) se determinan por medio del análisis de la varianza
(ANOVA) (por ejemplo, el ensayo de Dunett) a fin de reconocer si una concentración específica
produce un efecto importante.
La cantidad requerida de réplicas depende de la varianza del punto final, la cantidad y la distancia
entre los pasos de concentración y la magnitud de la diferencia del efecto entre el lote de ensayo
y el experimento de control, verificada estadísticamente a un nivel de importancia determinado.
Por lo general, se recomienda que el número de lotes de control sea mínimo dos veces el de
réplicas por nivel de concentración / dilución o incrementado por √p, donde p es el número de
concentraciones de ensayo.
9.5.3 Relación concentración/respuesta
Al determinar la relación concentración/respuesta, resulta de importancia decisiva para el diseño

del ensayo el tipo de datos de punto final, es decir, si se determinan variables de respuesta
(cualitativas) o métricas (cuantitativas).
La mortalidad (o inmovilidad) de los organismos de ensayo determinada en el ensayo agudo es

una variable de respuesta común.
En contraste, las variables métricas presentan incrementos continuos, es decir un gradiente de

respuesta. Las variables métricas típicas son, por ejemplo, la longitud del cuerpo o la biomasa,
las tasas metabólicas, las tasas de producción o consumo de oxígeno o de transformación
enzimática. La cantidad de animales jóvenes producidos también puede considerarse como
variable métrica aproximada.
En el caso de variables métricas, se evalúan los resultados en cuanto con los niveles de
concentración/dilución individual en relación con los lotes de control. Por lo tanto, se debería
prestar especial atención a fin de garantizar la confiabilidad estadística de los controles.
17
Al determinar las variables de respuesta, se deben incluir las observaciones relacionadas

directamente en la relación de concentración / respuesta. Por lo tanto, no es necesario que el
número de réplicas en el experimento de control sea superior a los lotes de ensayo.
Por lo general, al determinar la relación de concentración-respuesta, es aconsejable reducir el

número de paralelos en los lotes de ensayo e incrementar la cantidad de niveles de
concentración. Esto es permisible puesto que los puntos de medición adyacentes en una serie de
dilución de estrecha graduación pueden apoyarse mutuamente entre sí. El mínimo son dos
réplicas por nivel de concentración.
Los pasos adyacentes de concentración no deberían establecerse con demasiada estrechez, a

fin de evitar que las concentraciones efectivas sean virtualmente idénticas debido a la variabilidad
del sistema de ensayo.
10. GUÍA ESPECIAL EN CUANTO A LA REALIZACIÓN DEL ENSAYO
10.1 PROBLEMAS Y MEDIDAS PREVENTIVAS PARA MUESTRAS QUE CONTENGAN

INGREDIENTES REMOVIBLES
10.1.1 Generalidades
Los componentes de una muestra de agua pueden perderse en el sistema de ensayo por varias
razones:
- evaporación de sustancias volátiles;
- biodegradación;
- degradación abiótica (por ejemplo, hidrólisis, fotólisis);
- sorción hacia o en materiales del recipiente, en especial en el caso de ingredientes

hidrofóbicos;
- espumado de agentes superficiales-activos;
- precipitación;
- floculación.
En estos casos, las fracciones de sustancia empleadas en los sistemas de ensayo no se

encuentran disponibles para los organismos a un nivel constante a lo largo del ensayo.
Un ensayo preliminar con o sin organismos de ensayo puede ayudar a clarificar cuál trayecto de
eliminación es el responsable de la pérdida de sustancia. Las mediciones comparativas de
concentración, por ejemplo, de parámetros de suma, pueden revelar los mecanismos de pérdida.
La comparación de
- un recipiente abierto con uno cerrado ofrece una indicación de las pérdidas por
evaporación;
18
- una muestra expuesta con una no expuesta a la luz indica la extensión de la

degradación fotolítica;
- un recipiente de ensayo sin tratar con uno salinizado indica perdida de sorción.
- una muestra contaminada [por ejemplo con cloruro de mercurio (II) u otro
contaminante inorgánico adecuado[ posibilita un cálculo de eliminación por medio
de biodegradación.
Sin embargo, la pérdida de sustancia durante el ensayo biológico puede deberse simplemente a
la adsorción y acumulación en los organismos de ensayo o adsorción de partículas de alimentos.
En estos casos, los organismos todavía se encuentran expuestos en forma sustancial, aunque
solo una fracción de la sustancia pueda determinarse analíticamente en el agua. Se puede
explicar si ocurren pérdidas de sustancia reales o simuladas, mediante análisis comparativos de
lotes con o sin organismos y alimentación.
Estas representan indicaciones de que, en el caso de los microorganismos (por ejemplo,

bacterias de algas), la sensibilidad del sistema de ensayo disminuye con el incremento de la
densidad del organismo. La pérdida de sustancias puede compensarse mediante dosis
subsecuentes o, mejor, por medio de sistemas semi-estáticos o de flujo continuo a fin de evitar la
acumulación de metabolitos en el sistema de ensayo.
Sin embargo, existen límites, en el caso de sustancias poco solubles a partir de los cuales no se
pueden preparar soluciones de partida con suficiente concentración.
10.1.2 Volatilización
Las sustancias volátiles se arrastran con rapidez desde el sistema de ensayo en especial en los
métodos de ensayo que requieren aeración,. En tales casos, se debería considerar el empleo de
sistemas de ensayo cerrados o de flujo continuo. Se aconseja tener presente que, por ejemplo en
el caso del ensayo de inhibición de multiplicación celular con bacterias o algas, se debería
garantizar un intercambio de gas suficiente.
En el caso de sustancias tóxicas volátiles, se debería asegurar que no exista riesgo para el
personal que conduce el ensayo.
10.1.3 Espumado
En la superficie de un líquido se acumulan sustancias superficiales-activas y tienden a formar

burbujas cuando se airea el lote de ensayo.
Mediante el incremento de la proporción superficie: volumen (recipientes de ensayo planos) o,

siempre que sea apropiado, por medio de un ventilador para airear la superficie, se puede
garantizar el suministro de oxígeno necesario sin formación de espumado.
El empleo de agentes anti-espumado conduce a una interacción impredecible con la sustancia de

ensayo y por lo general se debería evitar excepto en casos especiales (por ejemplo, estudios de
biodegradación).
19
10.1.4 Adsorción
Las sustancias hidrofóbicas pueden adsorberse en las paredes del recipiente y luego - en
especial en concentraciones bajas - dejar de ser biodisponibles por completo. A fin de evitar
pérdidas grandes de sustancia, se recomienda incubar los recipientes durante mínimo 30 min con
la muestra en la concentración considerada antes del ensayo, la cual es desechada luego, y
subsecuentemente llenar el recipiente con la muestra fresca con el propósito de preparar el lote
de ensayo.
La silanización de los recipientes puede reducir la capacidad de sorción de la superficie de la

pared. No obstante, sólo se puede recomendar si no se cuenta con ningún otro material inerte y
si se puede garantizar que no lixivie ninguna silicona residual (véase el numeral 6.2).
10.1.5 Precipitación/floculación
Durante el ensayo puede ocurrir precipitación del material de ensayo, debido a las reacciones con
componentes del medio nutriente (por ejemplo, iones de calcio) en especial cuando el pH cambia en
el lote de ensayo. Las mediciones para mantener un pH constante (véase el numeral 8.3) pueden
ayudar a evitar esta interferencia.
10.1.6 Degradación
Los ingredientes pueden experimentar diferentes tipos de degradación, a saber biológica,

hidrolítica o fotolítica, durante el ensayo. Esto puede conducir a la formación de productos
secundarios (metabolitos) cuya toxicidad es diferente del producto original.
Con frecuencia es difícil evitar la biodegradación en sistemas de ensayo estáticos, puesto que los
organismos de ensayo tales como pescado y otros no se pueden separar de sus bacterias
acompañantes.
En ciertos casos, por ejemplo en el ensayo del pescado, se puede aplicar una temperatura de
ensayo inferior que conlleve a la reducción de la biodegradación si se puede cambiar la especie
del pescado (por ejemplo, trucha arco iris en vez de pez cebra).
En ensayos de bacterias, la biodegradación a menudo es inherente al sistema y se refleja por los

incrementos con respecto al criterio del ensayo (por ejemplo, la tasa de consumo de oxígeno, la
proliferación celular). En algunos casos, se pueden emplear sistemas de flujo continuo.
Normalmente, los colectores térmicos evitan la dispersión de la infección bacterial de retorno a la
tubería.
10.1.7 Hidrólisis
Algunos ingredientes (por ejemplo, los isocianatos, ésteres, anhídridos) se hidrolizan en el agua,
lo cual significa que en el curso del ensayo, los ensayos se exponen progresivamente a
productos de descomposición. En caso de hidrólisis, se puede alterar el valor del pH del lote de
ensayo, lo cual algunas veces conlleva a cambios en la tasa de hidrólisis. Bajo estas
circunstancias, se recomienda ajustar el pH ó incrementar la capacidad de amortiguador. En
casos individuales, mediante la selección de otras especies de ensayo, se puede aplicar una
temperatura inferior de ensayo, que conduzca a una reducción en la tasa de hidrólisis. Al emplear
sistemas de ensayo semiestáticos o de flujo continuo, se puede examinar con mayor facilidad el
efecto de la muestra sin descomponer.
20
En el caso de los ensayos de biodegradación, la hidrólisis del material de ensayo puede originar
una desviación de las escalas de inhibición de pH durante el ensayo. Cuando no se puede
controlar el pH mediante amortiguadores o ajustes, se recomienda preparar una solución de
partida acuática, permitir la hidrólisis, por ejemplo durante 24 h, neutralizar la solución y
comenzar el ensayo de biodegradación con la muestra hidrolizada.
10.1.8 Fotólisis
Algunos ingredientes (por ejemplo, el hexaclorociclopentadieno, EDTA, hexacianoferrato) se

descomponen por medio de la exposición a la luz. En el caso de los ensayos con algas, el efecto
de la luz es inherente al sistema.
En otros ensayos, tales reacciones de descomposición con frecuencia pueden reducirse o

evitarse mediante el trabajo en un ambiente oscurecido (donde sea necesario empleando luz
roja). Al igual que con la degradación biológica e hidrolítica es preferible realizar el ensayo en
sistemas de flujo continuo y semiestáticos.
10.2 PROBLEMAS Y MEDIDAS PREVENTIVAS CONCERNIENTES A LAS MUESTRAS

CON COLORACIÓN O TURBIAS, O AMBAS
En algunos ensayos biológicos, la determinación de punto final se basa en una medición

espectrométrica (fotometría, fluorometría). En el caso de las muestras con alta coloración o
turbidez, el efecto inhibidor producido no puede determinarse con confiabilidad. Se pueden llevar
a cabo los siguientes pasos para superar esta situación:
- diferente método para la determinación del punto final (por ejemplo, el conteo
celular en vez de la medición de turbidez en el ensayo de algas);
- medición de turbidez causada por los organismos mediante el uso de una o dos
longitudes de onda diferentes (con frecuencia los tintes cuentan con
características de longitud de onda diferentes a la dispersión luminosa causada
por microorganismos);
- combinación con otro método adecuado, por ejemplo, medición de tasa de

consumo o producción de oxígeno al finalizar un ensayo de inhibición de
multiplicación celular, en este caso, se recomienda renovar la administración del
medio nutriente;
- determinación de la influencia sobre el resultado del tinte o turbidez o ambos con

la ayuda de recipientes de medición / ensayo combinados en los que la muestra
de ensayo y los organismos se encuentran separados entre sí (por ejemplo la
célula de corrección del color en el ensayo de bacteria luminiscente).
En el ensayo de algas, las sustancias con coloración y turbias pueden impedir directamente el
crecimiento celular como consecuencia de la atenuación de la iluminación; esto no debería
malinterpretarse como efectos tóxicos. La siguientes acciones son adecuadas para diferenciar
entre interferencias físicas y de toxicidad de las sustancias con coloración en el ensayo de algas:
a) ensayo a diferentes intensidades de luz puesto que la tasa de crecimiento por

encima de la saturación luminosa es casi independiente de la intensidad de la luz;
21
b) reducción de la trayectoria luminosa por medio de la disminución de la profundidad

o el volumen;
c) medición de la reducción de proliferación celular en un lote de control cuando la

luz pasa previamente a través de un filtro de transmisión de luz, por ejemplo, un
disco plano que contenga las correspondientes diluciones de la muestra con el
correspondiente color y grosor de capa;
d) utilización de un filtro de transmisión de luz mediante la preparación de diluciones

recíprocas a la concentración de exposición, y de esta forma se mantiene una
longitud de trayecto común (profundidad constante) y las características de
absorbancia espectral de la muestra.
11. ENSAYOS BIOLÓGICOS ESPECIALES
11.1 ENSAYO DE BIODEGRADACIÓN
La determinación experimental de degradabilidad de las sustancias y aguas residuales y los

estudios de bioacumulación también son ensayos biológicos. La degradación puede considerarse
como la descomposición de un compuesto orgánico en simples componentes (metabolitos) por
medio de efectos físico-químicos (por ejemplo, la degradación fotolítica mediante luz) y/o
actividad biológica (por ejemplo, degradación biológica por medio de microorganismos).
Se realizó una distinción entre:
a) degradación primaria por medio de la cual la sustancia pierde propiedades

específicas (identidad, actividad) y se degrada en componentes más simples;
b) degradación última, es decir, degradación completa en productos inorgánicos

estables termodinámicamente, por ejemplo el dióxido de carbono y el agua. Esta
conduce a la creación de nueva biomasa además del dióxido de carbono, el agua
y las sales minerales.
Los criterios para la biodegradación son, por ejemplo:
- la reducción de componentes de reacción (por ej. O2) necesarios para la

biodegradación;
- el incremento en los productos de la reacción que surgen de la degradación total

(por ejemplo CO2);
- la transformación de la sustancia rotulada 14C en 14CO2;
- la reducción de la sustancia inicial detectable mediante análisis específicos;
- la reducción de la sustancia detectable mediante parámetros de suma

inespecíficos, (por ejemplo, TOC, DOC).
22
Nota 1. Las dos últimas afirmaciones no ofrecen indicación de si se trata de biodegradación o eliminación físico química
(por ejemplo a través de arrastre) o si han ocurrido cambios estructurales químicos (por ejemplo, por medio de
degradación primaria).
Se puede hacer una distinción entre eliminación por medio de sorción de lodo y biodegradación
cuando se emplea el lodo (adaptado potencialmente) al final del ensayo de degradabilidad
inherente como el inóculo para un ensayo de degradabiliad rápida, cuando se examina
paralelamente un lote contaminado en el cual no ocurren procesos biológicos o cuando se ha
probado que la ocurrencia de metabolitos es analítica.
Los métodos de ensayo de biodegradación pueden clasificarse en los siguientes grupos:
a) Métodos para medir la biodegradabilidad rápida:
Al medir la biodegradabilidad rápida, se pone en contacto la sustancia de ensayo

con una pequeña cantidad de microorganismos polivalentes. Los ensayos se
diseñan como ensayos discontinuos, es decir, involucran la inoculación de un solo
sustrato. Se puede observar el curso de la biodegradación por medio de diversos
parámetros. Cuando las sustancias no pueden reunir los criterios mínimos de
degradabilidad en este sistema de ensayo, se puede examinar su degradabilidad
en un sistema de ensayo más extensivo.
b) Métodos para determinar la biodegradabilidad potencial (inherente):
En los métodos para determinar la biodegradabilidad potencial, se hace una

distinción entre sistemas de ensayo de lote y semicontinuos. Ambos presentan
una densidad de inoculación relativamente alta con microorganismos polivalentes.
Los sistemas de lote están diseñados para funcionar con administración de

sustancia e inoculación única, mientras que la sustancia de ensayo en el sistema
semiestático se administra sobre una base diaria.
Nota 2 El uso de los términos biodegradabilidad “rápida” e “inherente” tal como se definen en los parámetros OECD
debería restringirse al ensayo de acuerdo con dichos parámetros. Para detalles adicionales véase la norma ISO 15462.
Adicionalmente la biodegradación se determina por:
a) Ensayos de simulación
Los ensayos de simulación sirven para determinar la biodegradabilidad bajo

condiciones ambientales pertinentes. Se requieren modelos validados que
representen dichas condiciones ambientales. Los mejores modelos hasta el
momento son los de simulación para plantas de tratamiento de alcantarillado en
los cuales se observa la degradación de una sustancia de ensayo bajo
condiciones de flujo continuo.
23
b) Otros métodos
Estos incluyen, por ejemplo, los métodos de ensayo en los cuales el lote contiene
sedimento, y métodos anaeróbicos en los que se observa la conversión de la
sustancia de ensayo en CO2 y CH4.
c) Mediciones
Básicamente, se realiza una distinción entre los parámetros que cubren la

mineralización de una sustancia de ensayo (medición de consumo de oxígeno,
medición de emisión de CO2) y los parámetros que registran la desaparición de la
sustancia original o una propiedad característica de la sustancia original o ambas,
por ejemplo, el efecto superficial activo en el caso de los surfactantes. En los
casos individuales, por ejemplo al ensayar pesticidas, los ensayos se centrarán no
solo en la degradabilidad de las sustancias mismas sino también en los principales
metabolitos en el suelo, agua y en las plantas. Al ensayar la degradabilidad de las
mezclas y preparaciones de sustancia, se aconseja tener presente que no se
pueden realizar declaraciones acerca de la degradabilidad de componentes
menores y aditivos.
Se pueden encontrar detalles adicionales acerca de la ejecución y evaluación de los ensayos de

degradación por ejemplo en las normas: ISO 7827, ISO 11734, ISO 11733, ISO 10707, ISO 9408,
ISO 9439, ISO 9887, ISO 9888, ISO 10634, ISO 10708, ISO 14592, ISO 14593, ISO 15462.
11.2 ENSAYO DE BIOACUMULACIÓN
La bioacumulación se puede considerar como la acumulación de sustancias en organismos vivos

del medio ambiente o por los alimentos. La acumulación de sustancias en la cadena alimenticia
se conoce como bioampliación. Los procesos bioacumulativos conducen a concentraciones
finales de sustancias en organismos acuáticos posiblemente excediendo la concentración inicial
en varias órdenes de magnitud.
La bioacumulación de sustancias químicas se ve influenciada por las propiedades de la sustancia

tales como la lipofilia, las solubilidad en el agua y la estructura / tamaño molecular, por la
estabilidad de las sustancias químicas en el agua y por la actividad metabólica del organismo.
El criterio para la bioacumulación es el factor de bioconcentración (BCF), el cual describe los

cocientes de la concentración en el organismo (c1) y la concentración de la sustancia en el medio
(por ejemplo, agua) u otro parámetro (por ejemplo alimentos) (c2) a tiempos específicos o bajo
condiciones de estado estables (BCFst).
BCF = c1/c2 = k1/k2 (1)
Donde:
k1 : es la tasa de captación;
k2 : es la tasa de eliminación
Se ha logrado un estado estable o de altiplano cuando tres análisis subsecuentes a intervalos de

mínimo 2 d no difieren en ± 20 %.
24
Es posible un cálculo preliminar del potencial de bioacumulación mediante el coeficiente de partición

n-octanol-agua, log10 Pow, el cual es una medida de la propiedad lipofílica de una sustancia [41]. En la
escala de log10 Pow 3 a 6, a menudo se observa una relación de BCF = 0,1 Pow.
El log10 Pow no es adecuado para calcular el potencial de bioacumulación en el caso de
- iones (por ejemplo metales pesados);
- surfactantes (desestimación)
- sustancias con pesos moleculares MW > 700 (sobreestimación debida a la no

disponibilidad de moléculas grandes);
- sustancias altamente lipofílicas (log10 Pow >6) (sobreestimación puesto que no se

mantuvo más la relación lineal).
Nota. Los experimentos de acumulación con sustancias altamente lipofílicas pueden arrojar resultados erróneos, o se
evitan, por definición, debido a que las condiciones de estado estable no han sido establecidas aún o a que la
determinación analítica de la sustancia disuelta en agua permanece incierta, o ambas.
En general, los resultados de los experimentos de bioacumulación son más afirmativos que los
cálculos mediante relaciones log10 Pow. Las determinaciones BCF no deberían realizarse con
concentraciones de sustancia en la escala de efectos tóxicos a los organismos. Adicionalmente,
no se debería exceder la escala de solubilidad en el agua.
Generalmente, en el pescado las sustancias se incorporarán vía las agallas y a través de la piel.
Resulta pertinente una ingestión en la alimentación en la mayoría de los casos solo para
sustancias altamente lipofílicas (log10 Pow>5 y la mayoría >7).
Para una valoración más elaborada del potencial de bioacumulación, además del BCF, son
factores indicativos
- la cinética de depuración
- la altura del altiplano de residuos y
- la distribución de órganos específicos
Si la eliminación sigue un modelo de un compartimento de cinética de primer orden, es posible

calcular un valor CT50 (tiempo para el 50 % de la eliminación) de la manera siguiente:
Loge 2
CT50 =
K2
25
A menudo se observa una excreción de dos fases, es decir una eliminación rápida seguida de
una más lenta debido a las diferentes tasas de captación en órganos específicos, procesos
metabólicos o diferentes trayectorias de excreción. Para investigaciones de esta clase, resultan
más adecuadas las técnicas de trazador radioactivo.
La concentraciones de ensayo generalmente muy bajas en un ensayo de acumulación (1/100 ó

1/1 000 de LC50) imponen requisitos especiales sobre la eficiencia de los métodos analíticos que
acompañan el ensayo. En algunas áreas (transformación de sustancias de ensayo) se pueden
emplear sustancias radio-etiquetadas.
En el Parámetro 305 de OECD se pueden encontrar detalles adicionales acerca de la

determinación de la bioacumulación.
11.3 ENSAYO DE GENOTOXICIDAD
Los ensayos de genotoxicidad / mutagenicidad sirven como medidas preventivas dentro de un

sistema de mantenimiento de salud pública general. En el tiempo presente existe poco
conocimiento confiable acerca de los efectos de las sustancias mutagenéticas en sistemas
ecológicos acuáticos.
La genotoxicidad puede considerarse como una alteración del genoma celular bajo la influencia
de sustancias. En la medida en que estos cambios se trasmiten a la siguiente generación celular,
es posible hablar de efecto mutagénico de genotipo cambiante. Los efectos tóxicos desempeñan
un papel esencial en la etología del cáncer. Sin embargo, no todas las alteraciones genotóxicas
son heredadas por las células hijas, puesto que las células cuentan con sistemas de reparación
compensatorios para el ácido deoxiribonucléico (ADN) que son capaces de revertir muchas
alteraciones adversas. Adicionalmente, a menudo los efectos drásticos conducen a la muerte
celular. Se puede considerar la inducción de sistemas de reparación como prueba de la
concurrencia de efectos genotóxicos. Las mutaciones se dividen de tres tipos.
a) Mutaciones genéticas, en las cuales la secuencia de base en un gen se modifica a

través del intercambio de una base de ADN (mutación de punto) o por medio de la
introducción o extracción de una o más bases de ADN (cambios en el código de
lectura, mutaciones de cambio de estructura)
b) Las mutaciones de cromosomas, en las cuales se altera la estructura del

cromosoma visible, por ejemplo a través de la eliminación, traslocación o
inversión. Las mutaciones de cromosomas pueden conducir a la formación de
eliminaciones reconocidas como micronúcleos. La estructura de los cromosomas
puede percibirse especialmente bien durante la metafase del ciclo celular.
c) Las mutaciones de genoma en las cuales se cambia la cantidad total de células.

En este tipo, la cantidad de las células individuales (aneuploidia) o el conjunto
entero de cromosomas (poliploida) puede cambiar.
Las mutaciones de cromosomas y genomas sólo pueden observarse en células de organismos

eucarióticos. Los procedimientos de ensayo in vivo e in vitro son distintos. Los procedimientos in
vitro posibilitan la demostración del potencial genotóxico de un lote de ensayo y resultan
apropiados a fin de reducir al máximo los ensayos de animales. No obstante, puesto que los
procedimientos in vitro constituyen sistemas de ensayo suborgánicos, su valor informativo es
limitado.
26
Se puede indagar acerca del mecanismo del efecto genotóxico en forma diferencial mediante
procedimientos in vitro. Como regla general, estos se realizan con cultivos de células provenientes de
mamíferos (por ejemplo células de CHO, células V79). Su potencial metabólico en xenobióticos es
comparativamente inferior. Por esta razón las enzimas microsómicas (fracción S9), por ejemplo de
tejido de hígado inducidas por bifenilos policlorados (PCBs), se adicionan (activación metabólica)
como serie paralela de ensayo. Aunque la fracción S9 puede causar una reducción en la actividad
con algunas sustancias, es posible que primero induzca a un efecto mutagénico con otras numerosas
sustancias (promutagénico) por medio de la biotransformación.
Además la fracción S9 se adiciona en sistemas de ensayos bacteriales (procarióticos) (por

ejemplo en el procedimiento de ensayo de Ames) en una serie paralela de ensayo. Con
bacterias, los potenciales de alteración de genoma pueden identificarse rápida y fácilmente. Sin
embargo, una extrapolación de los resultados a organismos superiores pone limitantes
significativas.
Al realizar ensayos bacteriales y procedimientos in vitro eucarióticos, es conveniente trabajar bajo

condiciones estériles. Al igual que el agua, y en especial el agua residual, muy a menudo las
muestras contienen muchas bacterias y dichas muestras generalmente deben filtrarse por medio
de un filtro de membrana antes de usarse en la mayoría de los sistemas de ensayo. Las
concentraciones / diluciones empleadas no deberían ser deteriorantes de células (citotóxicas).
Los lotes de referencia (controles positivos) para verificar la reactividad de las células deberían
prepararse en forma simultánea.
12. EVALUACIÓN
12.1 GENERALIDADES
La evaluación de los resultados del ensayo primero involucra la inspección crítica de datos y una
presentación y descripción de los resultados de ensayo empleando gráficos, tablas y parámetros
estadísticos adecuados, por ejemplo valores medios y variaciones (estadísticas prescriptivas).
En muchos casos se sigue un procesamiento estadístico más extensivo que se dirija a

determinar las relaciones de concentración o dosis/respuesta a fin de calcular parámetros
adecuados para el quantum de acción y examinar la importancia estadística (estadísticas de
cálculo y ensayo). Esta evaluación estadística más extensiva es útil solo si los datos son
suficientes para este propósito, lo cual requiere primero que todo de examen crítico de los datos.
12.2 INSPECCIÓN Y DESCRIPCIÓN DE DATOS BÁSICOS
Toda evaluación debería comenzar con un examen crítico de los resultados de ensayo obtenidos.
Se verifica la credibilidad de todos los datos, lecturas primarias o datos transformados deducidos
de las mediciones, en especial en el caso de los anómalos.
Nota. Se recomienda que el evaluador elimine los anómalos solo después del juicio experto. Los ensayos de anómalos
pueden emplearse aquí como auxiliares matemáticos.
En las consideraciones acerca de la credibilidad resulta útil una presentación gráfica,

preferiblemente de los valores sin transformar. A menudo es muy conveniente un gráfico
semilogarítmico de los efectos medidos. Cualquier gráfico debería presentar en forma clara las
unidades de concentración, la cantidad de controles y lotes paralelos y los parámetros del efecto.
27
Adicionalmente, los gráficos ofrecen información valiosa acerca del comportamiento de los
componentes de ensayo y el punto hasta el cual es aconsejable la determinación de una relación
matemática concentración/respuesta. También puede indicar cuál modelo estadístico es
probablemente el más adecuado.
En el caso de la evaluación más avanzada, en principio, se debería dar prioridad a los métodos
aritméticos sobre los puramente gráficos puesto que, por lo general, permiten el cálculo de
escalas de confianza y varianzas . Se aconseja presentar los datos en forma tabular junto con los
valores medios calculados, los coeficientes de variación y el número de observaciones
independientes de los lotes paralelos (réplicas).
En algunos casos en que se van a reportar parámetros definidos simples, por ejemplo las
diluciones de umbral, no hay necesidad de una evaluación estadística más extensiva. En estos
casos, la evaluación termina con el cálculo del porcentaje de las inhibiciones y la decisión acerca
de si un efecto medido es superior o inferior que un valor límite determinado.
12.3 EVALUACIÓN ESTADÍSTICA
12.3.1 Generalidades
La evaluación estadística más extensiva se propone
a) presentar una relación matemática entre el efecto medido y la concentración

empleada (relación concentración / respuesta)
b) calcular los parámetros estadísticos que caracterizan el efecto y
c) realizar ensayos estadísticos o proporcionar escalas de confiabilidad (por ejemplo

refiérase a la norma ISO 8466)
Se acostumbra proporcionar concentraciones como parámetros estadísticos para el efecto de

una sustancia en la que se observó un quantum de acción específico (EC: concentración
efectiva, ECx; x: % efecto x).
Por ejemplo, el EC50 ofrece la concentración a la cual el efecto puede observarse en el 50% de
los animales de ensayo ó el 50 % del efecto (por ejemplo la mortalidad, inmovilidad)
(concentración de efecto medio, 50 % de cuantil). Estos parámetros para el quantum del efecto
se derivan de la relación concentración / respuesta.
En algunos ensayos se determina una concentración de efecto, por encima de la cual se observó
un efecto importante estadísticamente, por ejemplo LOEC (Concentración inferior de efecto
observado) y NOEC (Concentración de efecto no observado). Estos parámetros pueden
determinarse mediante comparación de los resultados de ensayo de varios niveles de
concentración con los resultados de control empleando ensayos estadísticos para el análisis de
la variación (ANOVA) o, si no se cumplen los prerrequisitos, métodos no paramétricos (por
ejemplo ensayos U múltiples).
Nota. Dicha figura, por definición, será una de las concentraciones ensayadas. En forma alternativa, el LOEC puede ser
un cálculo de punto, ECX. El valor de x se determina a partir de la experiencia práctica con el método de bioensayo
particular. En muchas situaciones un EC10 será un cálculo LOEC apropiado. Para algunos métodos de ensayo con
mayor variabilidad o más generalmente en situaciones donde los límites de confiabilidad alrededor de EC10 son
superiores, el EC10 puede remplazarse por un EC20.
28
El factor decisivo en la selección de una evaluación estadística o método de ensayo es la

posibilidad de que el criterio del ensayo se relacione con el tipo de variable de respuesta
(cualitativo) o métrico (cuantitativo) de variables (véase el numeral 9.5.3).
12.3.2 Variables de respuesta (cualitativas)
Los métodos enunciados aquí son adecuados para los bioensayos en los cuales se estudia la
variable “mortalidad” ó “inmovilidad” (por ejemplo, ensayos de toxicidad aguda con peces y
daphnia). El método de cálculo clásico para variables cuánticas de esta clase se basa en el
principio de probabilidad máxima. En el caso de la distribución normal este conduce a análisis
probit (30), (31), con distribución logística para análisis logit (32) empleando la distribución
Weibull para el análisis Weibit (33). En el caso de las variables cuánticas, los cálculos de
parámetro que emplean el principio de probabilidad máxima tienen en cuenta la heterogeneidad
de la varianza de los valores de medición. Esto constituye una diferencia muy importante para
una regresión no pesada siguiendo la linealización de las curvas de respuesta de la
concentración (por ejemplo, mediante el uso de papel probit). En esta situación, no se llega a
escalas de confiabilidad válidas.
12.3.3 Variables métricas (cuantitativas)
Los métodos de análisis probit, logit o Weibit arriba mencionados no son adecuados para
variables métricas (cuantitativas). Por lo general, el principio de los mínimos cuadrados de la
regresión lineal y no lineal se emplea para los métodos de cálculo. El propósito es seleccionar
una función que permita el mejor ajuste a los datos (varianza residual inferior). Si los valores de
medición revelan diferentes varianzas para las concentraciones de ensayo individual, se
recomienda realizar los análisis de regresión con factores de pesaje adecuados (34).
No se recomienda relacionar los efectos medidos en los lotes de ensayo con los controles no
tratados e ingresarlos contra los logaritmos de la concentración. Esta transformación puede
conducir a la heterogeneidad de las varianzas y, por tanto, conlleva mayores desventajas con
respecto a la evaluación estadística. Por esta razón, la evaluación siempre debería realizarse con
datos sin transformar.
Se calculan las concentraciones de efecto, siempre que sea posible, a partir de las funciones de
respuesta de la concentración. En el caso de las variables cuánticas (por ejemplo del ensayo de
peces o daphnia agudos), se acostumbra proporcionar el EC0, EC50 y EC100 que también se
pueden describir como LC0, LC50 y LC100 (LC: concentración letal).
Donde:
- EC0: concentración ensayada superior a la cual no se observa ningún efecto en

línea con el criterio del ensayo (LC0: todos los organismos sobreviven);
- EC50: concentración a la cual existe un efecto sobre el 50% de los organismos en

línea con el criterio del ensayo (LC50: 50% de los organismos mueren);
- EC100: concentración inferior a la cual existe un efecto sobre el 100% de los organismos
en línea con el criterio del ensayo (LC100: todos los organismos mueren)
- El EC0 y EC100 son parámetros derivados directamente del experimento y no

concentraciones de umbral determinadas estadísticamente. La NEC
(Concentración sin efecto) se deriva de una relación concentración/efecto
extrapolada a cero.
29
En el caso de variables métricas, por lo general se calcula el EC50 , algunas veces también el
EC10 (por ejemplo en el ensayo de inhibición de crecimiento de algas). Se debería tener presente
que, por ejemplo, el EC50 no corresponde a una concentración de efecto medio, como en el caso
de las variables cuánticas, pero designa la concentración a la cual una variable métrica es en
promedio 50 % inferior a la de control.
Nota. IC (concentración inhibitoria para el efecto x %). La designación EC50 algunas veces también se emplea en casos en
los cuales una variable se inhibe en un 50% en relación con el control (por ejemplo cantidad de animales jóvenes en el
ensayo de reproducción de daphnia, biomasa y tasa de crecimiento en el ensayo de inhibición de algas). Con el propósito de
diferenciar estas concentraciones de efecto, determinadas a partir de las variables métricas de las arriba mencionadas,
algunos autores sugieren que se deberían describir como ICx (concentración inhibitoria para el efecto x%).
El intervalo de confiabilidad puede calcularse empleando el método Fieller (30), (36), (38).
Si la situación de datos es tal que ninguno de los métodos arriba mencionados puede aplicarse,
la EC50 y su escala de confianza puede ser aproximada empleando métodos alternativos, por
ejemplo, (Método Promedio de Desplazamiento, Método Kärber Sperman Ajustado (30,31) o la
simple interpolación (de ser necesario de EC0 y EC100). Si no se obtiene EC100 con muestras no
diluidas, se debería reportar el máximo EC obtenido.
En muchos ensayos de biodegradación la cantidad de valores de degradación medidos en la

fase de altiplano no es suficiente para permitir un tratamiento estadístico. Sin embargo, el último
resultado de la fase de altiplano a menudo no es representativa de esta fase. En dichos casos, se
recomienda indicar el resultado del ensayo en una escala del 10 %, por ejemplo, grado de
biodegradación 70 % a 80 % de la remoción DOC.
12.3.4 Confirmación estadística de resultados
12.3.4.1 Generalidades. Los ensayos estadísticos aquí mencionados se emplean para determinar
si en general la sustancia ensayada presenta un efecto importante o a partir de cúal
concentración se observa un efecto importante o ambas. Esta concentración se describe como
FOEC/LOEC (Concentración de Efecto Observado Primero/Inferior) y la siguiente concentración
más baja (sin efecto importante) como NOEC (Concentración de Efecto No observado).
Estos parámetros dependen de:
- la varianza del parámetro medido;
- la cantidad de paralelos en las concentraciones de ensayo y controles (réplicas);
- la cantidad de concentraciones ensayadas;
- los incrementos de los niveles de concentración.
Por tanto, el resultado se ve influenciado en gran medida por el diseño del ensayo. Aquí, además
la elección de un método estadístico adecuado depende de si se examinan variables de
respuesta cuánticas o cuantitativas (métricas).
30
12.3.4.2 Variables cuánticas. Los métodos mencionados aquí son adecuados para ensayos en
los cuales se examina la variable “mortalidad” o “inmovilidad” (por ejemplo, el ensayo de
toxicidad aguda con peces y daphnia). Con el propósito de confirmar estadísticamente el efecto
observado, resultan convenientes los ensayos para escalas de datos nominales. Y para
determinar LOEC/NOEC, es apropiado el ensayo binomial de acuerdo con Fisher.
12.3.4.3 Variables métricas. La selección de un método de ensayo adecuado depende de si el

criterio de ensayo (por ejemplo, biomasas, tasas de crecimiento, producción de animales jóvenes
y tasa metabólicas) sigue una distribución normal aproximada y si la varianza es homogénea.
Entonces, los métodos estadísticos pueden emplearse como los más confiables.
En el caso de una distribución normal y homogeneidad de varianza, se intenta la confirmación

estadística empleando análisis de varianza simple (ANOVA). Se determinan NOEC y LOEC
empleando el ensayo Dunnett o Williams (35).
Si no se cumplen estas condiciones previas, se puede confirmar el efecto empleando el ensayo

Kruskal-Wallis. En ese caso, resultan adecuados los ensayos U múltiples (por ejemplo de
acuerdo con Bonferroni-Holm (39) ) para determinar las LOEC/NOEC.
Notas:
1) La EC0 no se puede igualar con la NOEC, ya que se determina directamente de los datos sin emplear un
método estadístico. Sin embargo, ambos se determinan en un mayor grado mediante el diseño del ensayo
(por ejemplo, la cantidad y magnitud de la concentración incrementan).
2) La determinación de la NOEC empleando los métodos estadísticos arriba mencionados se discute

críticamente en la actualidad (40). En forma alternativa, se propone determinar la concentración umbral de
efecto NEC a partir de la relación concentración- respuesta (71).
13. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS
13.1 ENSAYOS DE TOXICIDAD
Los ensayos de toxicidad brindan principalmente las concentraciones de umbral o efectivas, por
ejemplo, NOEC/LOEC, EC10, EC50 y EC90 ó LC (concentración letal), respectivamente, cuando
resulte apropiado. Los datos de la concentración deberían indicar en forma clara si estos se
basan en el ión efectivo, en el compuesto o por ejemplo en la etapa de dilución.
Siempre que sea posible, la curva de respuesta de la concentración debería presentarse junto
con los resultados del ensayo en un gráfico, por ejemplo como se muestra en la Figura 2, donde
se presentan los resultados del ensayo y los valores de ECx. Esta ofrece una clara
representación del carácter de la relación entre la concentración y la respuesta y el acuerdo de
los resultados con respecto al modelo.
Deberían determinarse el criterio de ensayo (“punto final”), organismo de ensayo, tiempo de

exposición y, siempre que sea posible, las escalas de confianza, por ejemplo para la EC50 (véase
el numeral 12.3.4).
Nota. Al ensayar las aguas residuales por medio de diluciones graduadas, se puede reportar la menor dilución sin
efecto (véase el Anexo A).
31
100
% de inhibición 80
60
40
20
0
EC 1 10 20 50 80 90 99
0,03 0,08 0,14 0,37 0,97 1,61 5,35
Concentración mg/l
Figura 2. Ejemplo de curva de concentración / respuesta adaptada a la distribución normal para la inhibición
13.2 ENSAYOS DE DEGRADACIÓN
El grado de degradación se describe mediante el porcentaje de disminución en la concentración

de un (o varios) parámetro(s) como se menciona en el numeral 11.1.
Se recomienda describir la cinética de la degradación (fase de retardo para adaptación, tiempo

de media vida, “ventana de 10 días”).
13.3 ENSAYOS DE BIOACUMULACIÓN
Se debería describir el transcurso de tiempo de concentración de la sustancia en todo el

organismo o tejidos especiales mediante gráficos o tablas a fin de demostrar que se ha
alcanzado un estado estable. Se aconseja reportar los BCF como una figura sin dimensiones
rodeada de no más de tres figuras importantes.
Se debería establecer la base de los BCF (por ejemplo cuerpo, órgano, masa fresca o seca) y su
diseño experimental (estático, semiestático, dinámico).
13.4 ENSAYOS DE GENOTOXICIDAD
En general, el número de incidentes observados (por ejemplo, las aberraciones cromosomáticas)

o capacidades metabólicas adquiridas (por ejemplo la inducción de enzimas de reparación) se
reporta en relación con concentraciones determinadas de una sustancia o diluciones de una
muestra de agua. Este valor se relaciona con un valor correspondiente de lote de control. El valor
puede normalizarse de acuerdo con el número de células al finalizar el ensayo. La relación
concentración / efecto puede evaluarse de acuerdo con el numeral 12. Si se ensayan sustancias,
el resultado generalmente se reporta en forma cualitativa (positivo/negativo).
Nota. Si se ensayan aguas, el resultado se puede reportar como la menor dilución sin efecto
32
14. REPORTE DEL ENSAYO
Se recomienda registrar los siguientes datos en el reporte del ensayo:
a) nombre del laboratorio que realiza el ensayo;
b) fecha y período de ensayo;
c) referencia al método de ensayo (número de la norma internacional o nacional)

empleado;
d) organismo de ensayo (por ejemplo, nombre científico, cepa, fuente), tratamiento

previo terapéutico o de aclimatación (si existe alguno);
e) designación del material de ensayo (número de lote, origen, fecha y período de

muestreo);
f) pretratamiento de la muestra (por ejemplo, preservación, preconcentración,

homogenización, ajuste del pH, tipo de agente neutralizante, pre-aireación);
g) datos, derivados, condensados o transformados, incluyendo, si es apropiado, los

resultados de controles positivos (lote de referencia);
h) datos químicos y físicos determinados durante el ensayo (por ejemplo, la

temperatura, el contenido de CO2, pH, turbidez, precipitación, posible cambio en la
concentración de la sustancia, etc.);
i) cualquier desviación del protocolo de ensayo (naturaleza del agua de dilución,

solución nutriente, aeración, temperatura, etc., cantidad de organismos o densidad
del inóculo, cantidad de lotes paralelos y controles);
j) método de evaluación (logit, probit, gráfico, computacional);
k) detalles de los resultados del ensayo;
l) comentarios acerca de los resultados del ensayo, si son necesarios;
m) firma del investigador responsable;
n) firma del controlador de calidad, si resulta apropiado.
15. PRINCIPIOS BÁSICOS DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD PARA ENSAYOS

BIOLÓGICOS
15.1 GENERALIDADES
El término “aseguramiento de la calidad” abarca todas las medidas tomadas a fin de determinar y
reportar los errores potenciales y la calidad en los resultados de ensayo. También se puede
aplicar la mayoría de medidas en una serie de Normas Internacionales (serie ISO 9000, etc.)
introducidas bajo el término “aseguramiento de la calidad analítico” a los métodos de ensayo
biológicos.
33
El aseguramiento de la calidad de un ensayo incluye la planeación del muestreo, las mediciones

y la evaluación, la documentación y valoración de los resultados y su registro.
Consecuentemente con la importancia del aseguramiento de la calidad en el procedimiento, se

debería incorporar en forma adecuada un programa correspondiente a la estructura de la
organización general considerando que algunas veces, según del método de ensayo empleado,
hasta el 30 % del tiempo del laboratorio debe dedicarse al logro del aseguramiento de la calidad
adecuado.
Las medidas de aseguramiento de la calidad se pueden subdividir en cuatro secciones:
- fase preparatoria;
- control interno de calidad;
- auditoría de control externo de la calidad;
- evaluación y documentación.
15.2 FASE PREPARATORIA
15.2.1 Organización y personal del laboratorio de ensayo
Los usuarios de esta guía deberán tratar de garantizar lo siguiente:
- El laboratorio de ensayo se organiza de modo que permita que una cantidad

suficiente de personal con la capacitación y experiencia necesaria inicial y
adicionales necesarias para que realice las tareas asignadas.
- El gerente general de la instalación de ensayo es normalmente, el responsable de

los aspectos organizacional y administrativo y, entre otras cosas, de garantizar
que se cumplan los requisitos relacionados con el personal y equipo para la
conducción de los ensayos.
- Un supervisor de ensayo biológico vigila la operación y desempeño. El es

responsable de supervisar que el ensayo se realice de forma correcta y adecuada
y que se documente como un reporte de ensayo.
- Las tareas de aseguramiento de la calidad involucran la verificación de la

conformidad del desempeño del ensayo con los métodos y criterios fijados en la
Norma Internacional y del registro correcto de la información bruta, la cual además
debe corresponder con los resultados ofrecidos en el reporte.
- En laboratorios más grandes, puede ser aconsejable asignar una persona con la
preparación necesaria para supervisar el aseguramiento de la calidad sobre una
base de tiempo completo o parcial. Una unidad organizacional independiente
puede asumir las tareas.
- Se proporciona capacitación continua regular y adecuada tanto para el gerente del

laboratorio como para otros miembros del personal del mismo.
34
15.2.2 Equipo de laboratorio
Los usuarios de esta guía deberían garantizar lo siguiente.
- El laboratorio de ensayo cuenta con el equipo apropiado para conducir los

ensayos. Además del equipo técnico, el laboratorio debería contar con adecuadas
instalaciones en el edificio, disposición de cuartos e instalaciones de ingeniería
domésticas (por ejemplo, electricidad, suministro de agua y gas, filtrado de
emisiones, ventilación o aire acondicionado) a fin de cumplir con los requisitos de
los ensayos por realizarse. La disposición de todos los desechos debería cumplir
con las disposiciones de seguridad pertinentes.
- La distribución del espacio dentro del área del laboratorio debería ser tal que se
evitara la contaminación de las instalaciones, equipo, personal y sistemas de
ensayo, lo mismo que la indeseada mezcla de las sustancias y medios de ensayo.
En especial, el cultivo y mantenimiento de los organismos de ensayo debería
separarse del sitio de preparación y ensayo.
- Para métodos de ensayo biológico, también deberían cumplirse las

precondiciones de aprobación del estatuto correspondientes (por ejemplo, los
requisitos de legislación de protección animal y las disposiciones acerca de la
protección contra epidemias), además de los preceptos relacionados con el
laboratorio y equipo técnico.
15.3 FIJACIÓN DE LOS OBJETIVOS DE CALIDAD
Los objetivos de calidad se fijan como base de las decisiones sobre selección del método y de
los pasos que hacen parte del aseguramiento de la calidad. Los objetivos de calidad abarcan
tanto los parámetros estadísticos como las declaraciones acerca de la selectividad o
especificidad del método de ensayo.
15.4 DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO
Resulta esencial que todas las partes del método de ensayo se describan como realmente se
emplearon, el equipo e instrumentos empleados y las medidas de aseguramiento de la calidad
tomadas. Las etapas de ocurrencia frecuente, que son parte rutinaria de todos los ensayos o de
un método de ensayo específico, pueden fijarse en las descripciones estándar (procedimientos
operantes estándar (SOPs) ), lo que significa que no es necesario mencionarlas específicamente
en cada plan de ensayo. Son típicos de dichos procedimientos el tratamiento de las muestras, el
mantenimiento y la calibración de los instrumentos de medición, la limpieza del equipo y los
instrumentos, la cría y cultivo de los organismos de ensayo, las instalaciones de seguridad y
emergencia, etc.).
Se debe informar por anticipado el alcance, contenido y tiempo programado del ensayo a todo el
personal que hace parte del ensayo. La hoja de trabajo debe contener información clara acerca
de las personas responsables, los objetivos del ensayo, la realización del mismo y los métodos
de ensayo empleados, al igual que el tiempo y el tipo de mediciones por realizarse.
35
15.5 DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE ENSAYO
Antes de la aplicación práctica de un método de ensayo, deben determinarse los parámetros de

ensayo pertinentes (por ejemplo, las desviaciones estándar y los coeficientes de variación).
También se deben definir los criterios de validez. En el caso de los métodos estandarizados,
normalmente se ofrecen parámetros estadísticos y criterios de validez en el procedimiento
normalizado.
Adicionalmente, la fase preparatoria abarca la selección de una estrategia de calibración

adecuada para los instrumentos, el ensayo de la conveniencia de los materiales y el examen de
la posibilidad de que el método sea el adecuado para el objetivo.
15.6 CONTROL DE CALIDAD
15.6.1 Control de calidad interno
El control de calidad interno es una parte integral del método de ensayo general. Se aplica
normalmente en aquellas mediciones biológicas que se conducen sobre una base rutinaria.
Incluye mediciones para identificar, superar y evitar errores y debería incluir los siguientes pasos:
- ensayo de las precondiciones reales con respecto al personal, muestreo,

laboratorio, equipo, organismos de ensayo, instrumentos y métodos analíticos;
- calibración de instrumentos;
- ensayos con sustancias de referencia;
- mantenimiento de cuadros de control;
- determinaciones múltiples;
- control de credibilidad;
- validación
Todas las medidas y resultados de control de calidad interno deben documentarse

cuidadosamente, presentarse de manera clara y actualizarse con frecuencia.
15.6.2 Control de calidad externo (auditoría)
Una comparación de los resultados de los ensayos y mediciones con los de otros laboratorios
puede ser parte importante del control de calidad externo. La cooperación en los ensayos inter-
laboratorio que involucran un mayor número de participantes sirve para dar a los resultados
mayor autoridad y posibilitar correcciones de fallas menores. La intención de la auditoría externa
es confirmar (o no) que el control de calidad interno funciona.
15.6.3 Evaluación
La evaluación de la información bruta obtenida de las etapas individuales del método de examen
debería realizarse de acuerdo con el método documentado de evaluación. El desempeño del
ensayo debería tener relación con los resultados intermedios y finales, y controlarse en forma
regular mediante controles de credibilidad selectivos.
36
15.6.4 Documentación
Se aconseja establecer los registros e instrumentos de la documentación completa, todos los

datos e información pertinentes en el curso del examen y los resultados y mediciones del control
de calidad analítico y estadístico.
37
Anexo A (informativo)
Menor dilución sin efecto (LID)
En el ensayo de toxicidad de agua residual mediante diluciones definidas (D), la menor dilución
sin efecto (LD) expresa el lote de ensayo con mayor concentración en el cual no se ha
observado inhibición ni siquiera efectos que no excedan la variabilidad específica de ensayo. D
se expresa como el valor recíproco de la fracción de volumen de agua residual en el lote de
ensayo.
EJEMPLO.
¼ de agua residual (fracción de volumen de 25 %) es nivel de dilución D= 4.
38
Anexo B (informativo)
Bibliografía
B.1 NORMAS INTERNACIONALES
1. ISO 6341:1996, Water quality – Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia
magna Straus (Cladocera, Crustacea).
2. ISO 7346-1: 1996, Water quality – Determination of the acute lethal toxicity of
substances to a freshwater fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprindae)) – Part 1: Static method.
3) ISO 7346-1: 1996, Water quality – Determination of the acute lethal toxicity of
Cyprindae)) – Part 2: Semistatic method.
4) ISO 7346-1: 1996, Water quality – Determination of the acute lethal toxicity of
Cyprindae)) – Part 3: Flow-through method.
5) ISO 7827:1994, Water quality – Evaluation in an aqueous medium of the ultimate

aerobic biodegradability of organic compounds – Method by analysis of dissolved
organic carbon (DOC)
6) ISO 8192:1986, Water quality – Test for inhibition of oxygen consumption of activated
sludge.
7) ISO 8466-1:1990, Water quality –Calibration and evaluation of analytical methods and
estimation of performance characteristics – Part 1: Linear functions
8) ISO 8466-1:1990, Water quality –Calibration and evaluation of analytical methods and
estimation of performance characteristics – Part 2: Non-linear functions
9) ISO 8692:1989, Water quality –Fresh water algal growth inhibition test with
Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.
10) ISO 9000:1987, Quality management and quality assurance standards – Guidelines for
selection and use.
aerobic biodegradability of organic compounds – Method by determining the oxygen
demand in a closed respirometer.
aerobic biodegradability of organic compounds – Method by analysis released carbon
dioxide.
13) ISO 9509:1989, Water quality – Method for assessing the inhibition of nitrification of
activated sludge microorganisms by chemicals and waste waters.
39
14) ISO 9887:1992, Water quality – Evaluation of the aerobic biodegradability of organic
compounds in an aqueous medium – Semicontinuous activated sludge method (SCAS).
15) ISO 9888:1991, Water quality – Evaluation of the aerobic biodegradability of organic
compounds in an aqueous medium – Static test (Zahn-Wellens method).
16) ISO 7827:1994, Water quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances
to freshwater fish – Method for evaluating the effects of substances on the growth rate
of rainbow trout )Oncprhynchus mykiss Walbaum (Teleostei, Salmonidae)).
17) ISO 7827:1994, Water quality –Marine algal growth inhibition test with Skeletonema
costatum and Phaeodactylum tricornutum.
18) ISO 7827:1994, Water quality – Measurement of biochemical parameters – Spectometric

determination of the chlorophyll-a concentration.
19) ISO 7827:1994, Water quality – Guidance for the preparation and treatment of poorly
water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability
in an aqueous medium.
aerobic biodegradability of organic compounds – Method by analysis of biochemical
oxygen demand (closed bottle test).
aerobic biodegradability of organic compounds – Method by determining the biochemical
oxygen demand in a two-phase closed bottle test.
22) ISO 10712:1995, Water quality – Pseudomas putida growth in inhibition test
(Pseudomas cell multiplication inhibition test).
23) ISO 11733:1995, Water quality – Evaluation of the elimination and biodegradability of
organic compounds in an aqueous medium – Activated sludge simulation test.
24) ISO 11734:1995, Water quality – Evaluation of the ultimate anaerobic biodegradability of
organic compounds in digested sludge – Method by measurement of the biogas
production.
25) ISO 13289:1), Water quality – Determination of genotoxicity of water and waste water –
Umu test
26) ISO/CD 14442:1997, Water quality – Guidance for algal growth inhibition tests with
poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waste water.
27) ISO/DIS 14593, Water quality – Evaluation in an aqueous medium of the ultimate
aerobic biodegradability of organic compounds – Method by analysis of released
inorganic carbon in sealed vessels.
28) ISO/TR 15462, Water quality – Selection of tests for biodegradability.
29) EN 45001: 1989, General criteria for the operation of testing laboratories.
40
B.2 OTRAS PUBLICACIONES Y GUÍAS
30) Finney, D.Y. (1971): Statistical methods in biological assay, 3rd Edition, University Press,
London.
31) Weber, E. (1980): Grundriβ der bilogischen Statistik, Fischer Verlag, Stuttgart.
32) Ashton, W.D (1972): The logit transformation with special reference to its uses in
bioassay. Griffin, London.
33) Christensen, E.R. (1984): Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the
Weibull model. Water Res. 18, pp. 213-221
34) Carrol, R.J and Ruppert, D (1988): Transformation and weighting in regression.
Chapman and Hall, London.
35) Dunnett, C. W. (1955): A multiple comparison procedure for comparing several

treatments with a control Amer. Statist. Ass. J., 50: pp. 1096-1121.
36) Fieller, E.L. (1944): A fundamental formula in the statistics of biological assay and some
applications. Quart. J. Pharm. Pharmacol., 17: pp. 117-123.
37) Girling, A.E., Whale, G.F., Adema D.M.M (1994): A guideline supplement for determining
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fractions. Chemosphere, 29 (12): pp. 2645-2649.
38) Morgan, B.J.T (1992): Analysis of quantal response data, Chapman & Hall, London.
39) Holm, S. (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand J. Statist, 6:
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40) Hoekstra, J.A. and van Ewijk, P.H. (1993): Alternatives for the no-observed-effect-level.
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44) OECD 202 Part I Daphnia sp., Acute Immobilisation Test – 4 April 1984.
45) OECD 202 Part II Daphnia, Reproduction Test- Draft 6/93
46) OECD 203 Fish, Acute Toxicity Test – 17 July 1992
47) OECD 204 Fish, Prolonged Toxicity Test, 14-day study – 4 April 1984
48) OECD 209 Activated Sludge, Respiration Inhibition Test – 4 April 1984
49) OECD 210 Fish, Early-life Stage Toxicity Test – 17 July 1992
50) OECD 301 A Ready Biodegradability: DOC-Die Away Test – 17 July 1992
41
51) OECD 301 B Ready Biodegradability: CO2-Evolution Test – 17 July 1992
52) OECD 301 C Ready Biodegradability: Modified MITI-Test – 17 July 1992
53) OECD 301 D Ready Biodegradability: Closed Bottle Test – 17 July 1992
54) OECD 301 E Ready Biodegradability: Modified OECD Screening Test – 17 July 1992.
55) OECD 301 F Ready Biodegradability: Manometric Resporimetry Test – 17 July 1992
56 OECD 302 A Inherent Biodegradability: Modified SCAS – Test- 12 May 1981
57) OECD 302 B Inherent Biodegradability:Zahn-Wellens/EMPA-Test – 17 July 1992
58) OECD 302 C Inherent Biodegradability:Modified MITI-Test (II) – 12 May 1981
59) OECD 303 A Simulation Test-Aerobic Sewage Treatment: Coupled units-Test- 12 May
1981
60) OECD 305 A Bioaccumulation: Sequential Static Fish Test – 12 May 1981
61) OECD 305 B Bioaccumulation: Semi-Static Fish Test – 12 May 1981
62) OECD 305 C Bioaccumulation: Test for the Degree of Bioconcentration in Fish – 12
May 1981
63) OECD 305 D Bioaccumulation: Static Fish Test – 12 May 1981
64) OECD 305 E Bioaccumulation: Flow through Fish Test – 12 May 1981
65) OECD 306 Biodegradability in Seawater – 17 July 1992
66) OECD 471 Genetic Toxicology: Salmonella typhimurium, Reverse Mutation Assay –
26 may 1983
67) OECD 473 Genetic Toxicology: In vitro Mammalian Cytogenetic Test – 26 May 1983
68) OECD 476 Genetic Toxicology: In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests – 4
April 1984
69) OECD 479 Genetic Toxicology: In vitro Sister Chromatid Exchange Assay in
Mammalian Cells – 23 October 1986
70) OECD 480 Genetic Toxicology: Saccharomyces Cerevisiae, Gene Mutation Assay –
23 October 1986
71) OECD 481 Genetic Toxicology: Saccharomyces Cerevisiae, Mitotic Recombination

Assay – 23 October 1986
72) OECD 482 Genetic Toxicology: DNA Damage and Repair /Unscheduled DNA
Synthesis in Mammalian Cells in vitro – 23 October 1986
73) OECD (1995): Guidance Document for Aquatic Effects Assessment OECD Environment
Monographs No. 92 OCDE/GD (95) 18, Paris 1995.
42
74) OECD (1995): Aquatic testing Methods for Pesticides and Industrial Chemical, Paris
(Draft Final Report, March, 1995).
75) American Society for Testing and Materials (1991): Standard guide for collection,
storage, characterization and manipulation of sediments for toxicological testing, ASTM
E 1391-90, Philadelphia PA
76) American Society for Testing and Materials (1993): Standard guide for conducting
sediment toxicity tests with freshwater invertebrates, ASTM E 1383-93, Philadelphia PA.
77) American Society for Testing and Materials (1980): Standard practice for conducting
acute toxicity tests with fishes, macroinvertebrates and amphibians, ASTM E 729-80,
Philadelphia PA2)
78) ECETOC (1996): Aquatic toxicity testing of sparingly soluble, volatile and unstable
substances, Monograph No. 26, pp. 1-67, Brussels
2)
En el subcomité ISO/TC147/SC6 se puede obtener información adicional acerca del ensayo biológico
(pretratamiento de muestreo, desempeño y evaluación) y acerca de legislación internacional acerca del
ensayo biológico en el contexto de la valoración y abatimiento de la contaminación del agua.
43
DOCUMENTO DE REFERENCIA
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Water Quality - Sampling. Part 16:

Guidance on Biotesting of Samples. Switzerland, ISO, 1998. 32 p. (International Standard
ISO 5667-16:1998 )
44

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NORMA TÉCNICA NTC-ISO

CALIDAD DEL AGUA.

E: WATER QUALITY. SAMPLING. PART 16. GUIDANCE ON

CORRESPONDENCIA: esta norma es equivalente (EQV) a la

DESCRIPTORES: agua; ensayo biológico; muestreo;

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

La norma NTC-ISO 5667-16 fue ratificada por el Consejo Directivo el 2000-12-15.

ACEITES Y GRASAS VEGETALES INGEOMINAS

CALIDAD DEL AGUA.

En la medida de lo posible, se ha hecho referencia a normas internacionales y parámetros

Se trataron principalmente problemas relacionados con la sustancia, en cuanto a muestreo,

Se pone especial énfasis en el ensayo ecotoxicológico con organismos (“ensayo biológicos de

La escogencia de puntos de muestreo representativos, frecuencia de muestreo, tipo de

No obstante, algunos ensayos requieren de una particular manipulación y conservación del

De acuerdo con el tipo de investigación (por ejemplo, ensayos de toxicidad o biodegradación) y

El volumen, la forma y el material de los recipientes depende de la naturaleza de la muestra

3.3 ESTADO DE LLENADO DE LOS CONTENEDORES

Los problemas relacionados con el llenado parcial pueden ser:

- Agitación intensificada durante el transporte, que conduce a la degradación de las

- interacción con la fase de gas, que conlleva al arrastre;

- oxidación de sustancias, que conduce, por ejemplo, a la precipitación de

Los problemas relacionados con el llenado completo pueden ser:

- agotamiento del oxígeno, con posible descomposición, que conduce a la

- deterioro de la homogenización debido a la sacudida o agitación del volumen total.

Los contenedores de muestras, cuando se contempla la congelación para la preservación, no

Se recomienda proteger las muestras recogidas de la fragmentación, incremento de la

- Es aconsejable procesar las muestras para ensayo biológico preferiblemente sin

- Si no es posible realizar el ensayo inmediatamente después del muestreo (o

- La forma más común y recomendada de preservar muestras de agua residual

- La experiencia ha demostrado que la calidad del agua residual puede afectarse

- Se aconseja excluir el uso de preservativos biocidales para el propósito del ensayo

- Se debería enfatizar que, si existe duda, el analista químico y el técnico del

6.1 SELECCIÓN DEL APARATO

6.3 LIMPIEZA DE APARATOS Y EQUIPO

Antes de usarse, se recomienda limpiar el aparato y el equipo con adecuados agentes de

7. TRATAMIENTO PREVIO Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS

El siguiente diagrama de flujo (véase la Figura 1) contiene información sobre términos

Muestra, (ejemplo: sustancia,

Etapa preparatoria, ejemplo: disolución,

Muestra para ensayo, (ejemplo:

Medio de ensayo Medio de control

Lote de ensayo Organismos de ensayo, Lote de control

Figura 1. Preparación de las muestras para bioensayo

Cuando el efecto o el comportamiento de una sustancia se conoce a partir de ensayos previos

Se aconseja deshelar las muestras almacenadas congeladas antes de su uso. Se recomienda el

Es recomendable asegurar una distribución uniforme de todos los componentes solubles y

7.4 SEPARACIÓN DE MATERIA SOLUBLE Y PARTICULADA

Sin embargo, la filtración, la centrifugación y otros métodos de separación involucran el riesgo de

Algunos de los métodos de ensayo ofrecen la posibilidad de determinar un factor de corrección

7.5 CONCENTRACIÓN PREVIA

La concentración previa de las muestras incrementa la concentración no solo de sustancias

- La extracción líquido / líquido con solventes orgánicos y la extracción de fase

- La evaporación y la congelación-secado pueden conllevar a pérdida de sustancia

- La ultrafiltración puede conducir a una pérdida especialmente de pequeñas

El incremento en la concentración por encima del umbral de solubilidad puede conducir a la

La acumulación biológica no se puede simular por medio de la concentración previa de muestras,

Algunos ingredientes de la muestra de agua que se esté concentrando pueden experimentar

Se pueden obtener valores adecuados blancos sólo si se encuentran disponibles muestras de

No es posible extrapolar a partir de ensayos agudos con muestras concentradas previamente

7.6 AJUSTE DEL pH

- El ajuste de un pH definido entre 6 y 9 (el cual generalmente es tolerable para la