Bacteriófago l
relacionados con la regulación y la
La organización genética del bacteriófago l
favorece su subyugación como vector.
El bacteriófago λ es un virus de E. coli
genéticamente complejo pero muy
estudiado (cuadro 4.2). Debido a que ha
sido objeto de tanta investigación en
genética molecular, era natural que, desde
el comienzo de la manipulación genética,
debiera haber sido investigado y
desarrollado como un vector. El ADN del
fago λ, en la forma en que está aislado de
la partícula del fago, es una molécula
dúplex lineal de aproximadamente 48,5
kbp. Se ha determinado toda la secuencia
de ADN (Sanger et al. 1982). En cada
extremo hay proyecciones cortas de 5 'de
cadena sencilla de 12 nucleótidos, que son
complementarias en secuencia y por las
cuales el ADN adopta una estructura
circular cuando se inyecta en su célula
huésped, es decir, el ADN λ tiene
terminales cohesivos que se asocian para
formar El sitio cos.
Los genes funcionalmente relacionados del
fago λ se agrupan en el mapa, a excepción
de los dos genes reguladores positivos N y
Q. Los genes a la izquierda del mapa lineal
convencional (figura 4.10) codifican las
proteínas de la cabeza y la cola de la
partícula del fago. Los genes de la región
central están relacionados con la
recombinación (por ejemplo, rojo) y el
proceso de lisogenización, en el que el
cromosoma circularizado se inserta en su
cromosoma huésped y se replica de
manera estable junto con él como un
profágico. Gran parte de esta región
central, incluidos estos genes, no es
esencial para el crecimiento del fago y
puede eliminarse o reemplazarse sin
afectar gravemente el ciclo de crecimiento
infeccioso. Su capacidad de dispensación es
de vital importancia, como se verá más
adelante, en la construcción de derivados
de vectores del fago. A la derecha de la
región central se encuentran los genes
inmunidad a la superinfección de los fagos
(N, cro, cI), seguidos de la síntesis de ADN
(O, P), la regulación de la función tardía (Q)
y la lisis de la célula huésped (S, R ) La
figura 4.11 ilustra el ciclo de vida λ.
El bacteriófago tiene circuitos de control
sofisticados
Como veremos, es posible insertar ADN
extraño en el cromosoma del derivado del
fago-λ y, en algunos casos, los genes
extraños pueden expresarse de manera
eficiente a través de promotores λ. Por lo
tanto, debemos considerar brevemente los
promotores y los circuitos de control que
afectan la expresión del gen λ (ver Ptashne
(1992) para una monografía excelente
sobre los circuitos de control de fago-λ).
En el ciclo lítico, la transcripción λ ocurre
en tres etapas temporales: temprana,
media y tardía. Básicamente, la
transcripción genética temprana establece
el ciclo lítico (en competencia con la
lisogenia), los productos génicos medios
replican y recombinan el ADN, y los
productos génicos tardíos empaquetan
este ADN en partículas de fago maduras.
Después de la infección de un huésped
sensible, la transcripción temprana
procede de los principales promotores
situados inmediatamente a la izquierda
(PL) y a la derecha (PR) del gen represor (cI)
(Fig. 4.12). Esta transcripción está sujeta a
represión por el producto del gen cI y en
un lisógeno esta represión es la base de la
inmunidad a la superinfección de λ.
Temprano en la infección, las
transcripciones de PL y PR se detienen en
los sitios de terminación tL y tR1. El sitio
tR2 detiene cualquier transcripción que
escape más allá de tR1. Lambda cambia de
transcripción temprana a media etapa por
anti-terminación. El producto Ngene,
expresado desde PL, dirige este cambio.
Interactúa con la ARN polimerasa y,
antagonizando la acción de la proteína de
terminación del huésped ρ, le permite
ignorar las señales de parada para que las
transcripciones PL y PR se extiendan a
genes como el rojo, el O y el necesario para
la etapa intermedia. Las transcripciones
tempranas y medias y los patrones de
expresión, por lo tanto, se superponen. El
producto cro, cuando se ha acumulado
suficiente, impide la transcripción de PL y
PR. El gen Q se expresa desde la porción
distal de la transcripción PR extendida y es
responsable del cambio de medio a tardío.
Esto también funciona por anti-
terminación. El producto Q anti-termina
específicamente la transcripción PR corta,
extendiéndola a los genes tardíos, a través
de la región cos unida, de modo que
finalmente se producen muchas partículas
de fago maduras.

Tanto N como Qplay desempeñan papeles

reguladores positivos esenciales para el
crecimiento de fagos y la formación de
placa; pero un N-fago puede producir una
pequeña placa si el sitio de terminación tR2
es eliminado por una pequeña deleción
denominada nin (independiente de N)
como en λN-nin. Hay dos tipos básicos de vectores de
fagos: vectores de inserción y vectores de
reemplazo.

El ADN λ de tipo salvaje contiene varios

sitios objetivo para la mayoría de las
endonucleasas de restricción comúnmente
utilizadas y, por lo tanto, no es adecuado
en sí mismo como vector. Por lo tanto, se
han producido derivados del fago de tipo
salvaje que tienen un solo sitio objetivo en
el que se puede insertar ADN extraño
(vectores de inserción) o tienen un par de
sitios que definen un fragmento que se
puede eliminar (relleno) y reemplazar por
ADN extraño (vectores de reemplazo).
Dado que el fago λ puede acomodar solo
alrededor del 5% más que su complemento
normal de ADN, los derivados del vector se
construyen con deleciones para aumentar
el espacio dentro del genoma. Las
moléculas de ADN λ más cortas que
producen placas de tamaño casi normal
tienen un 25% de eliminación.
Aparentemente, si se elimina demasiado
ADN no esencial del genoma, no se puede
empaquetar en partículas de fago de
manera eficiente. Esto puede convertirse
en una ventaja, si el fragmento
reemplazable de un vector de tipo de
reemplazo se elimina por separación física
o se destruye eficazmente por tratamiento
con una segunda endonucleasa de
restricción que lo corta solo, entonces el
genoma del vector eliminado solo puede
dar lugar a placas si se inserta un nuevo
segmento de ADN en él. Esto equivale a
una selección positiva para fagos
recombinantes que llevan ADN extraño.
Varios grupos de investigadores
produjeron muchos derivados de vectores
tanto del tipo de inserción como de
reemplazo al principio del desarrollo de la
tecnología de ADN recombinante (por
ejemplo, Thomas et al. 1974, Murray &
Murray 1975, Blattner et al.1977, Leder et
al. 1977) . La mayoría de estos vectores se
construyeron para su uso con EcoRI, BamHI
o HindIII, pero su aplicación podría
extenderse a otras endonucleasas
mediante el uso de moléculas enlazadoras.
Estos primeros vectores han sido
reemplazados en gran medida por vectores
mejorados para la construcción rápida y
eficiente de bibliotecas de ADN genómico o
complementario (ADNc) (véase el Capítulo
6).
Se han descrito varios vectores de fagos
con propiedades mejoradas
Al igual que con los vectores plasmídicos,
se han desarrollado derivados de vector
fago mejorados. Ha habido varios
objetivos, entre los cuales se encuentran
los siguientes.
• Para aumentar la capacidad de
fragmentos de ADN extraños,
preferiblemente para fragmentos
generados por cualquiera de varias
enzimas de restricción (revisado por
Murray 1983).
• Diseñar métodos para seleccionar
positivamente la formación recombinante.
• Para permitir que las sondas de ARN se
preparen convenientemente mediante la
transcripción del inserto de ADN extraño;
Esto facilita la detección de bibliotecas en
los procedimientos de caminata
cromosómica. Un ejemplo de un vector con
esta propiedad es λZAP (ver pág. 104).
• Desarrollar vectores para la inserción de
ADNc eucariota (pág. 104) de modo que la
expresión del ADNc, en forma de un
polipéptido de fusión con βgalactosidasa,
se impulse en E. coli; Esta forma de vector
de expresión es útil en la detección de
anticuerpos. Un ejemplo de tal vector es
λgt11.
Los primeros dos puntos serán discutidos
aquí. La discusión sobre los vectores
mejorados en la construcción y selección
de bibliotecas se difiere hasta el Capítulo 6.
La capacidad máxima de los derivados del
fago-λ solo se puede lograr con vectores
del tipo de reemplazo, por lo que también
ha habido un incentivo para idear métodos
para seleccionar positivamente formación
recombinante sin la necesidad de una
eliminación previa del fragmento de
relleno. Incluso cuando se toman medidas
para eliminar el fragmento de relleno
mediante la purificación física de los brazos
del vector, pueden permanecer pequeñas
cantidades contaminantes, de modo que la
selección genética para la formación
recombinante sigue siendo deseable. El
método habitual para lograr esto es
explotar el fenotipo Spi.
El tipo salvaje λ no puede crecer en cepas
de E. coli lisogénicas para el fago P2; en
otras palabras, el fago λ es Spi + (sensible a
la inhibición de P2). Se ha demostrado que
los productos de λgenes redand gam, que
se encuentran en la región 64-69% en el
mapa físico, son responsables de la
inhibición del crecimiento en un lisógeno
P2 (Herskowitz 1974, Sprague et al. 1978,
Murray 1983) . Por lo tanto, se han
derivado vectores en los que el fragmento
de relleno incluye la región 64-69%, de
modo que los recombinantes en los que
este ha sido reemplazado por ADN extraño
son fenotípicamente Spi- y pueden
seleccionarse positivamente mediante el
enchapado en un lisógeno P2 (Karn et al.
1984, Loenen y Brammar 1980).
un sitio de chi dentro de la parte no
reemplazable del fago.
La generación más reciente de vectores λ,
que se basan en EMBL3 y EMBL4 (Frischauf
et al. 1983; Fig. 4.13), tienen una capacidad
de ADN de tamaño 9–23 kb. Además de ser
chi +, tienen polienlazadores que
desmenuzan el fragmento de relleno para
facilitar la construcción de la biblioteca. Los
fagos con insertos se pueden seleccionar
en función de su fenotipo Spi, pero existe
una alternativa. El vector se puede digerir
con BamHI y EcoRI antes de la unión con
fragmentos de ADN extraños producidos
con BamHI. Si se eliminan los pequeños
fragmentos BamHI – EcoRI de los
polilinkers, el fragmento de relleno no se
reincorporará.

La eliminación del gamgene tiene otras

consecuencias. El producto gam es
necesario para el cambio normal en la
replicación de ADN λ del modo
bidireccional al modo de círculo rodante
(ver Fig. 4.11). El fago gam no puede
generar el ADN lineal concatemérico, que
normalmente es el sustrato para empacar
en las cabezas de los fagos. Sin embargo,
los fagos de gam forman placas porque los
sistemas de recombinación roja y rec
actúan sobre moléculas de ADN circulares
para formar multímeros, que pueden
empaquetarse. los fagos gam-red-
dependen totalmente del intercambio
mediado por rec para la formación de placa
en bacterias rec +. El λDNA es un sustrato Al empaquetar el ADN en el fago lin vitro,
pobre para este intercambio mediado por es posible eliminar la necesidad de células
rec. Por lo tanto, tal fago crea placas muy competentes de E. coli
pequeñas a menos que contengan una o Hasta ahora, hemos considerado solo una
más secuencias cortas de ADN llamadas forma de introducir ADN de fago
sitios chi (crossover instigador de puntos manipulado en la bacteria huésped, es
calientes), que estimulan el intercambio decir, mediante la transfección de
remediado. Muchos de los vectores de bacterias competentes (ver Capítulo 2). La
reemplazo actuales generan clones red- transfección es la introducción de ADN de
gam-y, por lo tanto, se han construido con fago desnudo en una célula bacteriana.
Usando ADN λ recién preparado que no ha ADN concatemérico se escinde en
sido sometido a ningún procedimiento de monómeros y se encapsula. Se introducen
manipulación de genes, la transfección mellas en cadenas opuestas del ADN, con
producirá típicamente alrededor de 105 12 pares de nucleótidos separados en cada
placas / µg de ADN. En un experimento de sitio cos, para producir el monómero lineal
manipulación de genes en el que el ADN con sus terminales cohesivos. El producto
del vector se restringe y luego se liga con del gen D se incorpora a lo que ahora se
ADN extraño, esta cifra se reduce a convierte en una cabeza de fago completa.
aproximadamente 104-103 placas / µg de Los productos de los genes Wand FII, entre
ADN del vector. Incluso con una bioquímica otros, luego unen la cabeza con una
de ácido nucleico perfectamente eficiente, estructura de cola ensamblada por
parte de esta reducción es inevitable. Es separado para formar la partícula madura.
una consecuencia de la asociación aleatoria
de fragmentos en la reacción de ligadura,
que produce moléculas con una variedad
de combinaciones de fragmentos, muchas
de las cuales son inviables. Sin embargo, en
algunos contextos, se requieren 106 o más
recombinantes. La escala de tales
experimentos puede mantenerse dentro
de un límite razonable empacando el ADN
recombinante en partículas de fago
maduras in vitro.

Colocar el ADN recombinante en una capa

de fago permite que se introduzca en la
bacteria huésped mediante los procesos
normales de infección de fagos, es decir,
adsorción de fagos seguida de inyección de
ADN. Esto se conoce como transducción.
Dependiendo de los detalles del diseño
experimental, el empaquetamiento in vitro
produce aproximadamente 106 placas / µg
de vector de ADN después de la reacción
de ligadura.

La figura 4.14 muestra algunos de los

eventos que ocurren durante el proceso de
empaquetado que tienen lugar dentro del
huésped durante el crecimiento normal de
los fagos y que ahora debemos realizar in
vitro. El ADN del fago en forma
concatemérica, producido por un
mecanismo de replicación de círculo
rodante (ver Fig. 4.11), es el sustrato para
la reacción de envasado. En presencia del
precursor de la cabeza del fago (el
producto del gen E es la proteína principal
de la cápside) y el producto del gen A, el

El principio del empaquetado in vitro es
suministrar al ADN recombinante ligado
altas concentraciones de precursor de la
cabeza del fago, proteínas de empaque y
colas de fago. Prácticamente, esto se
realiza de manera más eficiente en un
lisado mixto muy concentrado de dos
lisógenos inducidos, uno de los cuales está
bloqueado en la etapa previa a la cabeza
por una mutación ámbar en el gen D y, por
lo tanto, acumula este precursor, mientras
que al otro se le impide formar estructura
de la cabeza por una mutación ámbar en el
gen E (Hohn y Murray 1977). En el lisado
mixto, se produce la complementación
y Murray 1977).
genética y se empaqueta el ADN exógeno
(Fig. 4.15). Aunque el ADN concatemérico
es el sustrato para el empaquetamiento
(los concatemeros unidos covalentemente,
por supuesto, se producen en la reacción
de ligadura por asociación de los extremos
cohesivos naturales de λ), el sistema in
vitro empaquetará ADN monomérico
agregado, que presumiblemente primero
concatemeriza no covalentemente.
Hay dos problemas potenciales asociados
con el envasado in vitro. Primero, el ADN
endógeno derivado de los profágicos
inducidos de los lisógenos utilizados para
preparar el lisado de empaquetamiento
puede empaquetarse. Esto puede
superarse eligiendo el genotipo apropiado
para estos profágicos, es decir, la escisión
inhibe la inducción por inducción
(Gottesmann y Yarmolinsky 1968) y la
inmunidad imm 434 evitará la formación
de placa si se usa una bacteria lisogénica
imm 434 para el recubrimiento de la
mezcla de reacción compleja. . Además, si
el vector no contiene ninguna mutación
ámbar, se puede usar una bacteria
huésped no supresora para que el ADN
endógeno no genere placas. El segundo
problema potencial surge de la
recombinación en el lisado entre el ADN
exógeno y los marcadores de fago
inducidos. Si es problemático, esto se
puede superar mediante el uso de
lisógenos deficientes en recombinación (es
decir, rojo-rec-) y mediante irradiación UV
de las células utilizadas para preparar el
lisado, eliminando así la actividad biológica
del ADN endógeno (Hohn