UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE AGRONOMÍA

INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA

RESUMEN DE LOS ELEMENTOS UTILIZADOS EN ADN

RECOMBINANTE Y CLONACIÓN MOLECULAR

Alumno: José Luis Pérez Miranda

Matricula: 1885521

UA: Genética Molecular

Catedrático: Hugo García G.

Cd. General Escobedo N.L; a 21 de Noviembre del 2019

¿Clonación?

Un método de aislamiento y amplificación de un gen de interés es clonar el gen

insertándolo en otra molécula de ADN que sirve como vehículo o vector que puede
ser replicado en células vivas. La molécula de ADN recombinante se coloca en
una célula huésped, ya sea procariota o eucariota. La célula huésped entonces se
replica (produciendo un clon), y el vector con su pieza extraña de ADN también se
replica. El ADN extraño se amplifica en número y después de su amplificación se
puede purificar para su análisis posterior.

Corte y unión de ADN

Dos categorías principales de enzimas son herramientas importantes en el

aislamiento del ADN y la preparación del ADN recombinante: las endonucleasas
de restricción y las ligasas de ADN.

Clases principales de endonucleasas de restricción

Existen tres clases principales de endonucleasas de restricción. Su agrupación se

basa en los tipos de secuencias reconocidas, la naturaleza del corte realizado en
el ADN y la estructura enzimática. Las endonucleasas de restricción de los tipos I
y III no son útiles para la clonación de genes porque dividen el ADN en sitios
distintos de los sitios de reconocimiento y, por lo tanto, causan patrones de
clonación aleatorios. En contraste, las endonucleasas de tipo II son ampliamente
utilizadas para mapear y reconstruir el ADN in vitro porque reconocen sitios
específicos y se dividen justo en estos sitios.

Secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción de tipo II

Algunas enzimas, como EcoR1, generan un corte escalonado, en el que las colas
complementarias de una sola hebra se denominan "pegajosas" o cohesivas
porque pueden unirse a las colas complementarias de una sola hebra de otros
fragmentos de ADN. Si las moléculas de ADN de diferentes fuentes comparten los
mismos sitios de reconocimiento palindrómico ambas contendrán extremos
pegajosos complementarios (colas de una sola hebra) cuando se digieren con la
misma endonucleasa de restricción. Al igual que otras proteínas de unión al ADN,
el primer contacto de una endonucleasa de restricción con el ADN no es
específico. La unión inespecífica no suele implicar interacciones con las bases,
sino sólo con la final de azúcar-fosfato del ADN. La endonucleasa de restricción
está ligeramente ligada y su centro catalítico se mantiene a una distancia segura
del fosfodiéster.

ADN ligasa

El ADN ligasa más utilizado en el laboratorio se deriva del bacteriófago T4. La

ligasa ADN T4 también liga fragmentos con puntas rotas, pero la reacción es
menos eficiente y se requieren concentraciones más altas de la enzima in vitro.

Clonación molecular

El procedimiento básico de la clonación molecular implica una serie de pasos. En

primer lugar, los fragmentos de ADN que se van a clonar se generan mediante el
uso de endonucleasas de restricción. En segundo lugar, los fragmentos
producidos por la digestión con enzimas de restricción se ligan a otras moléculas
de ADN que sirven como vectores. Los vectores pueden replicarse de forma
autónoma (independientemente de la replicación del genoma del huésped) en las
células huéspedes y facilitar la manipulación de la molécula de ADN recombinante
recién creada. Tercero, la molécula de ADN recombinante se transfiere a una
célula huésped. Dentro de esta célula, la molécula de ADN recombinante se
replica, produciendo docenas de copias idénticas conocidas como clones. A
medida que las células huéspedes se replican, el ADN recombinante se transmite
a todas las células de la progenie, creando una población de células idénticas,
todas ellas portadoras de la secuencia clonada. Finalmente, los segmentos de
ADN clonados pueden ser recuperados de la célula huésped, purificados y
analizados de varias maneras.

ADN vectorial

Los vectores de clonación son moléculas de ADN portadoras. Cuatro

características importantes de todos los vectores de clonación son que ellos: (i)
pueden replicarse de forma independiente a sí mismos y a los segmentos de ADN
extraño que transportan; (ii) contienen una serie de sitios únicos de división de
endonucleasa de restricción que están presentes sólo una vez en el vector; (iii)
llevan un marcador seleccionable (generalmente en forma de genes de resistencia
a los antibióticos o genes para las enzimas que faltan en la célula huésped) para
distinguir las células huésped que transportan vectores de las células huéspedes
que no contienen un vector; y (iv) son relativamente fáciles de recuperar de la
célula huésped. Hay muchas opciones posibles de vectores dependiendo del
propósito de la clonación. La mayor variedad de vectores de clonación se ha
desarrollado para su uso en el huésped bacteriano E. coli. Por lo tanto, la primera
habilidad práctica que generalmente requiere un biólogo molecular es la capacidad
de cultivar cultivos puros de bacterias.

La elección del vector depende del tamaño y la aplicación del inserto

Los vectores clásicos de la clonación son los plásmidos, fagos y cósmicos, que se
limitan al tamaño del inserto que pueden acomodar, tomando hasta 10, 20 y 45 kb,
respectivamente (Tabla 8.2). Las características de los plásmidos y los fagos y su
uso como vectores de clonación se analizarán con más detalle en secciones
posteriores. Un cósmido es un plásmido que lleva un fago λ sitio cos, lo que
permite que sea empaquetado en una cabeza de fago. Los cósmidos infectan una
bacteria huésped al igual que los fagos, pero se replican como los plásmidos y las
células huéspedes no son lisadas. Los genes de los mamíferos suelen tener un
tamaño superior a 100 kb, por lo que originalmente había limitaciones en la
clonación de secuencias completas de genes. Los vectores diseñados más
recientemente han evitado este problema imitando las propiedades de los
cromosomas de las células huéspedes. Esta nueva generación de vectores
cromosómicos artificiales incluye cromosomas artificiales bacterianos (BAC),
cromosomas artificiales de levadura (YAC) y cromosomas artificiales de
mamíferos (MAC).
El ADN plasmídico como vector

Los plásmidos son moléculas circulares de ADN extracromosómico de doble

cadena que llevan un origen de replicación y se replican de forma autónoma
dentro de las células bacterianas. El vector del plásmido pBR322, construido en
1974, fue uno de los primeros plásmidos genéticamente modificados que se
utilizaron en el ADN recombinante. Los plásmidos se denominan con un sistema
de letras mayúsculas y números, donde la "p" minúscula significa "plásmido". En el
caso de la pBR322, la BR identifica a los constructores originales del vector
(Bolívar y Rodríguez), y 322 es el número de identificación del plásmido
específico. Estos vectores tempranos eran a menudo de bajo número de copias, lo
que significa que se replican para producir sólo una o dos copias en cada célula.
pUC18, el vector mostrado en la es un derivado de pBR322. Se trata de un
plásmido de "número de copias elevado" (> 500 copias por célula bacteriana).

Los vectores de los plásmidos se modifican para contener un gen específico de

resistencia a los antibióticos y un sitio de clonación múltiple (también llamado
región de los polilinker) que tiene una serie de sitios objetivo-únicos para las
endonucleasas de restricción. El corte del vector circular del plásmido con una de
estas enzimas da como resultado un solo corte, creando un plásmido lineal. Una
molécula extraña de ADN, denominada "inserto", cortada con la misma enzima,
puede unirse al vector en una reacción de ligadura. Las ligaduras de la inserción al
vector no son 100% productivas, porque los dos extremos de un vector de
plásmido pueden ser fácilmente ligados juntos, lo que se llama autoligadura. El
grado de autoligado puede reducirse mediante el tratamiento del vector con la
enzima fosfatasa, que elimina el terminal 5′-fosfato. Cuando el 5′- fosfato es
removido del plásmido no puede ser recirculado por la ligasa, ya que no hay nada
con que hacer un enlace de fosfodiéster. Pero, si el vector se une con un inserto
extraño, el ADN extraño proporciona el 5′- fosfato.
Transformación: transferencia de ADN plasmídico recombinante a un
huésped bacteriano.

El método tradicional es incubar las células en una solución concentrada de sal de

calcio para que sus membranas tengan fugas. Las células "competentes"
permeables se mezclan con el ADN para permitir la entrada del ADN en la célula
bacteriana. Alternativamente, se puede utilizar un proceso llamado electroporación
que conduce el ADN a las células por medio de una fuerte corriente eléctrica.
Dado que las especies bacterianas utilizan un sistema de modificación de
restricciones para degradar ADN extraño que carece del patrón de metilación
apropiado, incluidos los plásmidos, surge la pregunta: ¿por qué las bacterias
transformadas no degradan el ADN extraño? La respuesta es que los biólogos
moleculares han eludido inteligentemente este sistema de defensa utilizando
cepas mutantes de bacterias, deficientes tanto para la restricción como para la
modificación, como la cepa común de laboratorio E. coli DH5α.

Las bacterias transformadas con éxito transportarán ADN plasmídico

recombinante o no recombinante. La multiplicación del ADN del plásmido ocurre
dentro de cada bacteria transformada. Una sola célula bacteriana colocada sobre
una superficie sólida (placa de agar) que contiene nutrientes puede multiplicarse
para formar una colonia visible formada por millones de células idénticas. A
medida que la célula huésped se divide, los vectores del plásmido pasan a la
progenie, donde continúan replicándose. Numerosas divisiones celulares de una
sola bacteria transformada resultan en un clon de células (visibles como una
colonia bacteriana) de una sola célula parental. Este paso es el que dio nombre a
la "clonación". El ADN clonado puede entonces ser aislado del clon de células
bacterianas.

Selección recombinante
¿Qué debe incluirse en el medio de recubrimiento de las células para que las
células bacterianas no transformadas no puedan crecer en absoluto? La respuesta
depende del vector en particular, pero en el caso de la pUC18, el vector lleva un
gen marcador seleccionable para la resistencia al antibiótico ampicilina. La
ampicilina, un derivado de la penicilina, bloquea la síntesis de la capa de
peptidoglicanos que se encuentra entre las membranas celulares interna y externa
de E. coli. La ampicilina no afecta a las células existentes con envolturas celulares
intactas, pero mata a las células que se dividen mientras sintetizan nuevo
peptidoglicano. Los genes de resistencia a la ampicilina transportados por los
plásmidos recombinantes producen una enzima, β-lactamase, que rompe un
enlace específico en el anillo de cuatro miembros (β-lactam ring) en la molécula de
ampicilina que es esencial para su acción antibiótica. Si el vector del plásmido se
introduce en una célula bacteriana sensible a los antibióticos sin plásmidos, la
célula se vuelve resistente a la ampicilina.

Cribado azul-blanco

Para distinguir los transformantes no recombinantes de los recombinantes, se

puede utilizar el blindaje azul-blanco o la "selección de laca" (también llamado α-
complementación) con este vector en particular. Las colonias bacterianas se
cultivan en un medio selectivo que contiene ampicilina y un compuesto
cromogénico incoloro llamado X-gal, para abreviar (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-
galactosido). pUC18 transporta una porción del gen lacZ (llamado lacZ ′) que
codifica los primeros 146 aminoácidos para la enzima β-galactosidase. Sin
embargo, mediante α-complementation las dos proteínas parciales pueden
asociarse y formar una enzima funcional. Cuando está presente, la enzima β-
galactosidasa cataliza la hidrólisis de X-gal, convirtiendo el sustrato incoloro en un
producto de color azul

Amplificación y purificación del ADN plasmídico recombinante

Se puede realizar un cribado adicional de las colonias positivas (blancas)

mediante la digestión de la endonucleasa para confirmar la presencia y orientación
del fragmento de inserción. Cuando una colonia positiva que contiene ADN
plasmídico recombinante se transfiere asépticamente a un medio de crecimiento
líquido, las células continuarán multiplicándose exponencialmente. El paso final en
la clonación molecular es la recuperación del ADN clonado. El ADN de los
plásmidos puede purificarse de los lisados de células crudas mediante
cromatografía utilizando gel de sílice o resinas de intercambio aniónico que se
unen preferentemente a los ácidos nucleicos en condiciones apropiadas y
permiten la eliminación de proteínas y polisacáridos. El ADN del plásmido
purificado puede eluirse y recuperarse por precipitación de etanol en presencia de
cationes monovalentes. La precipitación con etanol del ADN plasmídico de las
soluciones acuosas produce un gránulo claro que puede disolverse fácilmente en
una solución tamponada adecuada.

Bacteriófago lambda (l) como vector

Los vectores de Phage λ son particularmente útiles para preparar bibliotecas

genómicas, porque pueden contener un trozo más grande de ADN que un vector
de plásmidos. Los vectores de reemplazo han apareado sitios de clonación a
ambos lados de un grupo central de genes. La partícula viral recombinante infecta
las células huéspedes bacterianas, en un proceso llamado "transducción". Las
células huéspedes se lisan después de la reproducción de los fagos, liberando
partículas del virus de la progenie. Las partículas virales aparecen como una
mancha clara de bacterias lisadas o "placa" en una placa de agar que contiene un
césped de bacterias. Cada placa representa la progenie de un único fago
recombinante y contiene millones de partículas de fago recombinante. La mayoría
de los vectores contemporáneos llevan un gen lacZ′ que permite la selección azul-
blanco.

Vectores cromosómicos artificiales

Los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y los cromosomas artificiales de la

levadura (YAC) son herramientas importantes para mapear y analizar los genomas
eucariotas complejos. Gran parte del trabajo en el Proyecto del Genoma Humano
y otros proyectos de secuenciación del genoma depende del uso de BACs y
YACs, porque pueden contener más de 300 kb de ADN extraño. Los BAC se
construyen utilizando como punto de partida el plásmido del factor de fertilidad
(factor F) de E. coli. El plásmido tiene un tamaño natural de 100 kb y se presenta
con un número de copias muy bajo en el huésped. El vector BAC de ingeniería es
de 7.4 kb (incluyendo un origen de replicación, sitios de clonación y marcadores
seleccionables) y por lo tanto puede acomodar un inserto grande de ADN extraño.
Las características de los vectores del YAC se discuten a continuación.
Inmediatamente después de la construcción del primer YAC en 1983, se realizaron
esfuerzos para desarrollar un cromosoma artificial mamífero (MAC). De ahí en
adelante, pasaron 14 años hasta que se describió el primer prototipo MAC en
1997. Al igual que los YAC, los MAC dependen de la presencia de secuencias
centroméricas, secuencias que pueden iniciar la replicación del ADN y secuencias
teloméricas. Su desarrollo se considera un avance importante en la biotecnología
animal y la terapia génica humana por dos razones principales. En primer lugar,
implican la replicación autónoma y la segregación en las células de mamíferos, a
diferencia de la integración aleatoria en los cromosomas (como en el caso de otros
vectores). En segundo lugar, pueden ser modificados para su uso como sistemas
de expresión de grandes genes, incluyendo no sólo la región de codificación sino
todos los elementos de control. Sin embargo, una desventaja importante que limita
la aplicación en este momento es que son difíciles de manejar debido a su gran
tamaño y sólo pueden recuperarse en pequeñas cantidades. Existen dos
procedimientos principales para la generación de MAC. En un método, se utiliza la
fragmentación de cromosomas naturales dirigida por telómeros.

Vectores de cromosomas artificiales de la levadura (YAC)

La levadura, aunque es un eucarionte, es una célula pequeña y única que puede

ser manipulada y cultivada en el laboratorio de forma muy parecida a las bacterias.
Los vectores YAC están diseñados para actuar como cromosomas. Su diseño no
habría sido posible sin un conocimiento detallado de los requisitos para la
estabilidad y replicación cromosómica y el análisis genético de los mutantes de
levadura y las vías bioquímicas. Los vectores YAC incluyen un origen de
replicación (secuencia de replicación autónoma, ARS), un centrómero para
asegurar la segregación en células hijas, telómeros para sellar los extremos de los
cromosomas y conferir estabilidad, y marcadores de crecimiento seleccionables en
cada brazo. Estos marcadores permiten seleccionar las moléculas en las que se
unen los brazos y que contienen un inserto extraño. Los vectores del YAC se
mantienen como un círculo antes de insertar ADN extraño. Después de cortar con
endonucleasas de restricción BamHI y EcoRI, el brazo izquierdo y el brazo
derecho se vuelven lineales, con las secuencias finales formando los telómeros. El
ADN extraño se separa con EcoRI y los brazos del YAC y el ADN extraño se ligan
y luego se transfieren a las células huéspedes de la levadura. Las células huésped
de la levadura se mantienen como esferoplastos (sin pared celular de levadura).
Las células de levadura se cultivan en placas selectivas de regeneración de
nutrientes que carecen de uracilo y triptófano, para seleccionar las moléculas en
las que se unen los brazos que unen los genes URA3 y TRP1.

Fuentes de ADN para clonación

La clonación que se ha descrito hasta ahora funcionará para cualquier pieza

aleatoria de ADN. Pero como el objetivo de muchos experimentos de clonación es
obtener una secuencia de ADN que dirija la producción de una proteína específica,
primero debemos considerar dónde obtener dicho ADN. Las fuentes de ADN para
la clonación en vectores pueden ser fragmentos de ADN que representan un gen
específico o una porción de un gen o pueden ser secuencias de todo el genoma
de un organismo, dependiendo del objetivo final del investigador. Los
"insertos" típicos incluyen ADN genómico, ADNc, productos de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y oligonucleótidos químicamente sintetizados.
Cuando los clones previamente aislados se transfieren a un vector diferente para
otras aplicaciones, esto se denomina "subclonación".

Referencia bibliográfica
Allison, A. L. 2007. Fundamental Molecular Biology. Blackwell Publishing.
USA.