Cosmidos, fasmidos y otros vectores avanzados.

Introducción

En la década de 1970, cuando se desarrolló por primera vez la tecnología de ADN

recombinante, solo había un número limitado de vectores disponibles y estos se basaban en
plásmidos de alto número de copias o en fagos λ. Más tarde, el fago M13 se desarrolló como
un vector especializado para facilitar la secuenciación del ADN. Gradualmente, se desarrollaron
varios vectores diseñados específicamente, de los cuales pBR322 es probablemente el mejor
ejemplo, pero la creación de cada uno fue una tarea importante. Con el tiempo, se construyó
una serie de vectores especializados, cada uno para un propósito particular. Durante este
período, hubo muchos argumentos sobre los beneficios relativos de los vectores de plásmidos
y fagos. Hoy, el biólogo molecular tiene disponible una enorme variedad de vectores y estos
son notables por tres razones. Primero, muchos de ellos combinan elementos tanto de
plásmidos como de fagos y se conocen como fásmidos o, si contienen una región M13 ori,
fagémidos. Un grupo de fásmidos que se usa ampliamente es la serie de vectores λZAP
utilizados para la clonación de ADNc y estos se describen en la p. 104. En segundo lugar, se
pueden encontrar muchas características diferentes que facilitan la clonación y la expresión
combinadas en un solo vector. En tercer lugar, el ADN vector purificado más los reactivos
asociados se pueden comprar a proveedores de biología molecular. El desafortunado científico
que abre un catálogo de biología molecular se enfrenta a una desconcertante selección de
vectores y cada vendedor promueve otros diferentes. Aunque los beneficios de usar cada
vector pueden ser claros, las desventajas rara vez son obvias. El objetivo de este capítulo es
proporcionar al lector una explicación detallada de la base biológica de los diferentes diseños
de vectores.

Hay dos usos generales para los vectores de clonación: clonación de grandes piezas de ADN y
manipulación de genes. Al mapear y secuenciar genomas, el primer paso es subdividir el
genoma en piezas manejables. Cuanto más grandes sean estas piezas, más fácil será construir
la imagen final (ver Capítulo 17); de ahí la necesidad de clonar grandes fragmentos de ADN.
También se necesitan fragmentos grandes si es necesario "caminar" a lo largo del genoma para
aislar un gen, y este tema se trata en el Capítulo 6. En muchos casos, el gen deseado será
relativamente fácil de aislar y se puede obtener un vector de clonación más simple usado. Una
vez aislado, el gen clonado puede expresarse como una secuencia de sonda o como una
proteína, puede secuenciarse o puede mutarse in vitro. Para todas estas aplicaciones, se
utilizan pequeños vectores especializados.

Vectores para clonar grandes fragmentos de ADN

Los cósmidos son plásmidos que se pueden empaquetar en partículas bacteriófagas l

Como hemos visto, los concameros de las moléculas de ADN λ de longitud unitaria pueden
empaquetarse de manera eficiente si los sitios cos, sustratos para la escisión dependiente del
empaque, están separados por 37-52 kb (75-105% del tamaño del ADN λ +). De hecho, solo se
requiere una pequeña región en la proximidad del sitio cos para que el sistema de empaque lo
reconozca (Hohn 1975).
Se han construido plásmidos que contienen un fragmento de ADN λ que incluye el sitio cos
(Collins y Brüning 1978, Collins y Hohn 1979, Wahl et al. 1987, Evans et al. 1989). Estos
plásmidos se han denominado cósmidos y pueden usarse como vectores de clonación génica
junto con el sistema de envasado in vitro. La figura 5.1 muestra un esquema de clonación
génica que emplea un cósmido. Empaquetar los recombinantes cósmidos en capas de fago
impone una selección deseable sobre su tamaño. Con un vector cósmido de 5 kb, exigimos la
inserción de 32–47 kb de ADN extraño, mucho más de lo que puede acomodar un vector fago-
λ.

Tenga en cuenta que, después del envasado in vitro, la partícula se usa para infectar un
huésped adecuado. El ADN del cósmido recombinante se inyecta y se circulariza como el ADN
del fago, pero se replica como un plásmido normal sin la expresión de ninguna función del
fago. Las células transformadas se seleccionan sobre la base de un marcador de resistencia a
fármacos del vector.

Fig. 5.1 Esquema simple para la clonación en un vector cósmido.

Los cósmidos proporcionan un medio eficiente para clonar grandes piezas de ADN extraño.
Debido a su capacidad para grandes fragmentos de ADN, los cósmidos son vectores
particularmente atractivos para construir bibliotecas de fragmentos de genoma eucariótico. La
digestión parcial con una endonucleasa de restricción proporciona fragmentos
adecuadamente grandes. Sin embargo, existe un problema potencial asociado con el uso de
resúmenes parciales de esta manera.

Esto se debe a la posibilidad de que dos o más fragmentos del genoma se unan en la reacción
de ligadura, creando así un clon que contiene fragmentos que inicialmente no eran adyacentes
en el genoma. Esto daría una imagen incorrecta de su organización cromosómica. El problema
puede superarse mediante el fraccionamiento por tamaño del digestión parcial. Incluso con
ADN extraño dimensionado, es posible que se produzcan clones de cósmidos que contienen
fragmentos de ADN no contiguos ligados para formar un único inserto. El problema se puede
resolver desfosforilando los fragmentos de ADN extraños para evitar su unión. Este método es
muy sensible a la proporción exacta de ADN de objetivo a vector (Collins y Brüning 1978)
porque puede ocurrir la ligadura de vector a vector. Además, los recombinantes con un vector
duplicado son inestables y se descomponen en el huésped por recombinación, dando como
resultado la propagación de un vector de cósmido no recombinante.

Tales dificultades se han superado en un procedimiento de clonación cosmídica ideado por Ish-
Horowicz y Burke (1981). Mediante el tratamiento apropiado del vector cósmido pJB8 (Fig.
5.2), se purifican los extremos del vector izquierdo y derecho que son incapaces de autoligarse
pero que aceptan ADN extraño desfosforilado. Por lo tanto, el método elimina la necesidad de
dimensionar los fragmentos de ADN extraño y evita la formación de clones que contienen ADN
extraño corto o secuencias de múltiples vectores.
Fig. 5.2 Esquema de cosmidclonación de Ish-Horowicz y Burke (1981). (a) Mapa del cósmido
pJB8. (b) Aplicación a la construcción de una biblioteca genómica de fragmentos obtenidos por
digestión parcial con Sau3A. Esta endonucleasa de restricción tiene un sitio de reconocimiento
de tetranucleótidos y genera fragmentos con los mismos términos cohesivos que BamHI.

Bates y Swift (1983) idearon una solución alternativa a estos problemas, quienes construyeron
el cósmido c2XB. Este cósmido lleva un sitio de inserción BamHI y dos sitios cos separados por
un sitio de restricción de extremo romo (Fig. 5.3). La creación de estos extremos romos, que se
ligan de manera muy ineficiente en las condiciones utilizadas, previene efectivamente la
autoligadura del vector en la reacción de ligadura. Los cósmidos modernos de las series pWE y
sCos (Wahl et al. 1987, Evans et al. 1989) contienen características tales como: (i) sitios de
clonación múltiple (Bates & Swift 1983, Pirrotta et al. 1983, Breter et al. 1987) para clonación
simple usando ADN sin tamaño seleccionado; (ii) promotores de fagos que flanquean el sitio
de clonación; y (iii) sitios únicos de NotI, SacII o Sfil (cortadores raros, ver Capítulo 17) que
flanquean el sitio de clonación para permitir la eliminación del inserto del vector como
fragmentos individuales. Los módulos de expresión en mamíferos que codifican marcadores
seleccionables dominantes (Capítulo 12) también pueden estar presentes, para la
transferencia de genes a células de mamíferos si es necesario.
Fig. 5.3 Esquema de cosmidclonación de Bates y Swift (1983). El cósmido c2XB contiene dos
sitios cos, separados por un sitio para la endonucleasa de restricción SmaI que crea extremos
romos. Estos extremos romos se unen de manera muy ineficiente en las condiciones utilizadas
y evitan eficazmente la formación de recombinantes que contienen múltiples copias del
vector.

Los BAC y PAC son vectores que pueden transportar fragmentos de ADN mucho más grandes
que los cósmidos porque no tienen restricciones de empaque

El fago P1 es un bacteriófago templado que se ha utilizado ampliamente para el análisis

genético de Escherichia coli porque puede mediar la transducción generalizada. Sternberg y
sus colaboradores han desarrollado un sistema de vector P1 que tiene una capacidad para
fragmentos de ADN de hasta 100 kb (Sternberg 1990, Pierce et al. 1992). Por lo tanto, la
capacidad es aproximadamente el doble que la de los clones de cósmidos, pero menor que la
de los clones de cromosomas artificiales de levadura (YAC) (ver pág. 213). El vector P1 contiene
un sitio de empaquetamiento (pac) que es necesario para el empaquetamiento in vitro de
moléculas recombinantes en partículas de fago. Los vectores contienen dos sitios loxP. Estos
son los sitios reconocidos por la fago recombinasa, el producto del gen fago cre, y que
conducen a la circularización del ADN empaquetado después de haber sido inyectado en un
huésped de E. coli que expresa la recombinasa (Fig. 5.4). Los clones se mantienen en E. coli
como plásmidos de bajo número de copias mediante la selección de un marcador de
resistencia a la kanamicina del vector. Un alto número de copias puede ser inducido por la
explotación del replicón lítico P1 (Sternberg 1990). Este sistema P1 se ha utilizado para
construir bibliotecas genómicas de ADN de ratón, humano, levadura de fisión y Drosophila
(Hoheisel et al. 1993, Hartl et al. 1994). Shizuya y col. (1992) han desarrollado un sistema de
clonación bacteriana para mapear y analizar genomas complejos. Este sistema BAC
(cromosoma artificial bacteriano) se basa en el factor sexual de una sola copia F de E. coli. Este
vector (Fig. 5.5) incluye los sitios λ cos N y P1 loxP, dos sitios de clonación (HindIII y BamHI) y
varios sitios de enzimas de restricción G + C (por ejemplo, SfiI, NotI, etc.) para la posible
escisión de los insertos. El sitio de clonación también está flanqueado por promotores T7 y SP6
para generar sondas de ARN. Este BAC se puede transformar en E. coli de manera muy
eficiente, evitando así los extractos de empaque que se requieren con el sistema P1. Los BAC
son capaces de mantener fragmentos genómicos humanos y vegetales de más de 300 kb
durante más de 100 generaciones con un alto grado de estabilidad (Woo et al. 1994) y se han
utilizado para construir bibliotecas de genomas con un tamaño de inserto promedio de 125 kb
(Wang et al. 1995a). Posteriormente, Ioannou et al. (1994) han desarrollado un cromosoma
artificial (PAC) derivado de P1, combinando características de los sistemas de factor P1 y F.
Dichos vectores PAC pueden manejar insertos en el rango de 100–300 kb.
Fig. 5.4 El sistema del vector fago P1. El vector P1 Ad10 (Sternberg 1990) se digiere para
generar brazos de vectores cortos y largos. Estos están desfosforilados para prevenir la
autoliguación. El ADN de inserto seleccionado por tamaño (85–100 kb) se liga con brazos de
vector, listo para un procesamiento en dos etapas mediante el empaquetado de extractos.
Primero, el ADN recombinante se escinde en el sitio pac por pacase en el extracto de
empaquetado. Luego, el paquete funciona en concierto con el extracto de cabeza / cola para
insertar el ADN en las cabezas de los fagos, primero en el sitio del pac, cortando un puñado de
ADN a 115 kb. Cara y cruz se unen. La partícula de fago resultante puede inyectar ADN
recombinante en el huésped E. coli. El anfitrión es cre +. La recombinasa cre actúa en los sitios
loxP para producir un plásmido circular. El plásmido se mantiene con un número de copias
bajo, pero puede amplificarse induciendo el operón lítico P1.
Fig. 5.5 (izquierda) Estructura de un vector BAC derivado de un plásmido mini F. Los genes oriS
y repE median la replicación unidireccional del factor F, mientras que parA y parB mantienen el
número de copias en un nivel de uno o dos por genoma. CmR es un marcador de resistencia al
cloranfenicol. cosN y loxP son los sitios de escisión para la terminación λ y la proteína P1 cre,
respectivamente. HindIII y BamHI son sitios de escisión únicos para insertar ADN extraño.
(Adaptado de Shizuya et al. 1992.)

El primer vector BAC, pBAC108L, carecía de un marcador seleccionable para recombinantes.

Por lo tanto, los clones con insertos tuvieron que ser identificados por hibridación de colonias.
Si bien esto alguna vez fue una práctica estándar en el trabajo de manipulación genética, hoy
se considera inconveniente. Dos vectores BAC ampliamente utilizados, pBeloBAC11 y
pECBAC1, son derivados de pBAC108L en los que el sitio de clonación original se reemplaza con
un gen lacZ que lleva un sitio de clonación múltiple (Kim et al. 1996, Frijters et al. 1997).
pBeloBAC11 tiene dos sitios EcoRI, uno en el gen lacZ y otro en el gen CMR, mientras que
pECBAC1 solo tiene el sitio EcoRI en el gen lacZ. Se han realizado mejoras adicionales a los BAC
al reemplazar el gen lacZ con el gen sacB (Hamilton et al. 1996). La inactivación por inserción
de sacB permite el crecimiento de la célula huésped en medios que contienen sacarosa, es
decir, selección positiva para insertos. Frengen y col. (1999) han mejorado aún más estos BAC
al incluir un sitio para la inserción de un transposón. Esto permite modificar los insertos
genómicos después de la clonación en bacterias, un procedimiento conocido como
retroadaptación. Los principales usos de la adaptación son la introducción simplificada de
deleciones (Chatterjee y Coren 1997) y la introducción de genes informadores para su uso en
el huésped original del ADN genómico (Wang et al. 2001). Por ejemplo, Al-Hasani et al. (2003)
y Magin-Lachmann et al. (2003) han utilizado la adaptación para desarrollar BAC que faciliten
la transfección, el mantenimiento episomal y el análisis funcional de grandes fragmentos
genómicos en células eucariotas.

La ingeniería recombinogénica (recombinación) simplifica la clonación de ADN,

particularmente con construcciones de alto peso molecular
Los BAC y PAC son los vectores de elección si se desea clonar un gran fragmento de ADN (por
ejemplo,> 100 kb). Son especialmente útiles para clonar operones completos o grupos de
genes muy grandes. Sin embargo, la posterior ingeniería de clones es muy difícil y hay dos
razones para esto. Primero, los plásmidos muy grandes son difíciles de manipular in vitro sin
que ocurra el cizallamiento e, incluso si pueden mantenerse intactos, tienen una movilidad
muy restringida en los sistemas de electroforesis en gel. En segundo lugar, cuanto más largo
sea el inserto de ADN, más probabilidades hay de tener múltiples sitios para cada una de las
endonucleasas de restricción comunes. Por lo tanto, cualquier reacción de escisión y ligadura
podría reducir el tamaño del inserto de ADN y provocar la codificación de fragmentos. Para
evitar estos problemas, es necesario realizar las manipulaciones in vivo en lugar de in vitro
mediante el uso de recombinación homóloga. La recombinación homóloga permite el
intercambio de información genética entre dos moléculas de ADN de manera precisa,
específica y fiel. Ocurre a través de regiones de homología que son tramos de ADN
compartidos por las dos moléculas que se recombinan. Debido a que la secuencia de las
regiones de homología se puede elegir libremente, cualquier posición en una molécula diana
se puede alterar específicamente. Debido a que la recombinación homóloga es un evento raro,
se necesita alguna forma de selección para identificar las células que portan el recombinante.
Por lo tanto, la ingeniería del ADN mediante recombinación homóloga (ingeniería
recombinogénica) utiliza un procedimiento de selección como la resistencia a los antibióticos.
Si todo lo que se desea es eliminar parte de un BAC o PAC, entonces solo se requiere una
ronda de recombinación homóloga (Fig. 5.6a). En muchos casos, la persistencia del gen
seleccionable en el sitio de recombinación en el producto es indeseable y se requieren dos
rondas de ingeniería recombinogénica. En la primera ronda, la recombinación homóloga se usa
para generar un producto inicial mediante la integración del gen seleccionable, junto con
elementos funcionales adicionales, en el sitio deseado. En la segunda ronda, los elementos
funcionales adicionales se utilizan para eliminar el gen seleccionable, generando así el
producto final. Se han utilizado diferentes tipos de elementos funcionales, y la Fig. 5.6b
muestra uno de estos sitios objetivo para recombinasas específicas del sitio como Cre o FLP
(como se describe en el Cuadro 3.3). En este caso, el primer producto se expone a la
recombinasa específica del sitio relevante, que elimina el casete seleccionable.
Fig. 5.6 Dos variaciones de la ingeniería recombinogénica in vivo. En ambas variaciones, la
molécula objetivo permanece intacta y podría ser un BAC, PAC, cualquier otro plásmido o el
cromosoma de E. coli. (a) Reemplazo de un segmento de una molécula diana con una molécula
de ADN lineal que se introduce en la célula huésped del plásmido por electroporación. (b)
Eliminación del gen seleccionable por recombinación en sitios objetivo de recombinasa (por
ejemplo, FRT o loxP). sm, marcador seleccionable; puntas de flecha, sitios objetivo de
recombinasa; A y B, regiones de homología.

Hay varias formas de llevar a cabo la ingeniería recombinogénica (ver revisiones de Muyrers et
al. (2001) y Copeland et al. (2001)) pero aquí solo se describirá la más utilizada, conocida como
recombinación ET. En este método, la recombinación está mediada por RecE / RecT del fago
Rac o por Redα / Redβ del fago λ. Estos dos sistemas son funcionalmente equivalentes. RecE y
Redα son exonucleasas 5 'a 3' y RecT y Redβ son proteínas de recocido de ADN. También se
requiere una interacción funcional entre RecE y RecT o Redα y Redβ para la recombinación
homóloga. La forma más fácil de suministrar estas funciones de recombinación es
proporcionarlas a través de genes codificados por plásmidos, p. el plásmido pBAD-ETγ (Zhang
et al. 1998). Además de los genes RecE y RecT, este plásmido codifica el gen fago gam. El
beneficio de esto es que el producto del gen gam inhibe cualquier destrucción del casete de
orientación dependiente de RecBCD.

Con la recombinación ET, como se ilustra en la Fig. 5.6, un ADN de direccionamiento lineal que
lleva regiones de homología cortas que flanquean un gen seleccionable se introduce por
electroporación en células que llevan el BAC o PAC a modificar. La longitud de homología
requerida para una recombinación eficiente es de 35 a 60 nucleótidos y estos pueden
incorporarse en cebadores de PCR para la amplificación del marcador seleccionable (p. 9).
Cabe señalar que la expresión del gen gam impide la replicación normal de los plásmidos con
funciones de replicación ColEl. La pérdida de pBAD-ETγ se puede prevenir hasta después del
paso de ingeniería recombinogénica seleccionando el marcador de resistencia a la ampicilina
que también porta.

Varios factores gobiernan la elección del vector para clonar grandes fragmentos de ADN

El tamaño máximo de inserción que acomodarán los diferentes vectores se muestra en la Tabla
5.1. El tamaño del inserto no es la única característica importante. La ausencia de quimeras y
eliminaciones es aún más importante. En la práctica, alrededor del 50% de los YAC
(cromosomas artificiales de levadura) muestran inestabilidad estructural de los insertos o son
quimeras en las que se han incorporado dos o más fragmentos de ADN en un clon. Estos YAC
defectuosos no son adecuados para su uso como reactivos de mapeo y secuenciación y se
requiere un gran esfuerzo para identificarlos. Los insertos cósmicos a veces contienen las
mismas aberraciones, y el mayor problema con ellos surge cuando el ADN que se clona
contiene matrices en tándem de secuencias repetidas. El problema es particularmente grave
cuando la matriz en tándem es varias veces mayor que el tamaño permitido de un inserto de
cósmido. Las ventajas potenciales de los sistemas BAC y PAC sobre los YAC incluyen niveles
más bajos de quimerismo (Hartl et al. 1994, Sternberg 1994), facilidad de generación de
bibliotecas y facilidad de manipulación y aislamiento del inserto de ADN. Los clones BAC
parecen representar el ADN humano mucho más fielmente que sus equivalentes YAC o
cósmidos y parecen ser excelentes sustratos para el análisis de secuencia de escopeta, lo que
da como resultado datos de secuencia contigua precisos (Venter et al. 1998).