FACULTAD DE CIENCIAS DE LA VIDA

ESCUELA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA BIOMÉDICA

Subclonamiento desde el plásmido pCR-

Blunt II-TOPO a pGL3-Basic

Integrantes: Carla Arenas

Claudio Cortés
Docentes: Dr.Miguel Ávila
Lic.Daniela Verdugo
Fecha de entrega:01/Octubre/2018
Introducción
 Objetivos

Subclonar un segmento de una región promotora con sitio de unión a TCF/LEF, desde el
plásmido pCR-Blunt II-TOPO al pGL3-Basic
Materiales y métodos
 Resultados

Para obtener la secuencia del promotor se digirió el plásmido pCR- Blunt II-TOPO con las
enzimas de restricción Xhol y HindIII y posteriormente se realizó una electroforesis en gel
de agarosa para separar el plásmido de la secuencia del promotor (Fig. 1) en la que se
determinó que la secuencia del promotor era de xxxx

Fig 1. Electroforesis en gel de agarosa de la digestión del vector pCR- Blunt II-TOPO
con Xhol y HindIII . Se utilizó el ladder 1 Kb , rango de o,25 a 10Kpb (BM -1090) que se
observa en el primer carril y nuevamente posterior a la muestra 2. La banda de arriba (de
mayor tamaño) corresponde a al vector digerido pCR- Blunt II-TOPO Y las bandas de abajo
corresponde a la distintos tamaños de secuencia del promotor. La banda de más abajo
corresponde a la secuencia del promotor de xxx kb …
Se calculo tantos ng de trozo del gel blabla

Para purificar la secuencia del promotor se cortó del gen, un trozo de vector (banda de arriba
muestra 3 de Fig.1) y se eluyó por una matriz de DNA mini Hibind y en un espectrofotometro
se midió la absorbacia a 260 y 280nm en las que se obtuvo X y X respectivamente, además
de la concentración que fue de X ng/µl.
Posteriormente se realizó del protocolo de ligación para insertar el fragmento del promotor
purificado en el vector de destino pGL3- Basic y se transformaron bacterias pH5α quimio-
competentes con este vector y fueron crecidas en un medio con ampicilina (Fig. 2)
 Fig 2. Crecimiento de bacterias
transformadas en placa petri. Luego
de realizar el protocolo de
transformación bacteriana se dejaron
incubando en una estufa en un medio
suplementado con ampicilina. La
imagen muestra que hubo crecimiento
de colonias, por lo que las bacteria
fueron transformadas.

Finalmente se realizó una digestión del plásmido pGL.... con las enzimas Xhol y HindIII y se
corrió en una electroforesis en gel de agarosa (Fig 3.)

Fig 3. Electroforesis de productos de digestión de plásmido ….. digerido con enzimas de

restricción Xhol y HindIII. Ladder 1kb no se cuantito
 Discusión

3.3 Vectores. El vector de clonamiento pCR2.1-TOPO (Figura 7 A) (Invitrogen, 2006) de

3.900 pb se usó para clonar el ADNc del gen de la agmatinasa de hígado de ratón y como
templado para el subclonamiento del ADNc. Contiene el origen de replicación bacterial pUC,
promotor Lac, confiere resistencia a ampicilina y kanamicina, y región de clonamiento
TOPO-TA. El vector viene linealizado con extremos sobresalientes 3`-Timidina, donde cada
fosfato 3` está unido covalentemente al residuo Tyr-274 de la Topoisomerasa I del virus
Vaccinia. En un clonamiento TA de un producto de PCR con 3`-Adenina sobresalientes, el
hidroxilo 5` del inserto puede atacar la unión fosfotirosil entre el ADN y la enzima, liberando
a la Topoisomerasa I. PARA NO PERDERLO
http://repositorio.udec.cl/bitstream/handle/11594/2170/Tesis_Clonamiento_y_Analisis_funcio
nal.pdf?sequence=1&isAllowed=y
Conclusión
Bibliografía
 Anexos
Anexo 1.1

Diagrama 1: Esquema del vector pCR-Blunt II -TOPO

Anexo 1.2

Diagrama 2: Esquema del vector pGL3

Anexo 2: Cálculos

2.1 Cálculos para preparación de buffer de unión

Peso tubo solo=
Peso tubo con la muestra=
Peso muestra=
Hay que agregar tantos ml de buffer como ml de muestra haya
g de muestra
Volumen de buffer de unión =
densidad de la muestra
1mlx 0,40 g
Volumen de buffer de unión=
1g
Volumen de buffer de unión=
2.2 Calculo de a pureza producto de la purificación del segmento del promtor del gel.
|260|
Pureza de la muestra=
|280|
0 00
Pureza de la muestra= =
0,00
2.3 Cálculos para la ligación

1) Nanogramos de inserto (ng inserto) necesarios para 99 ng de vector.

( ng V x KbF ) x 3
ng inserto=
kbV

( ng x Kb ) x 3
ng=
kb
ng =

2) Volumen de solución de inserto.

ng del inserto
concentración del vector en ng

1uLx ng
ng
Volumen de solución de inserto= x ul de solución inserto.

3) Volumen de agua
Volumen total=volumen buffer T4+volumen ligasa T4+volumen inserto+ volumen H20 +
volumen vector.
20ul= 2ul+2ul+3,16ul+H2O ul+ 3ul
H2O= 9,84 ul
2.3 Calculo de a pureza producto de la purificación del plásmido
|260|
Pureza de la muestra=
|280|
 0 00
Pureza de la muestra =
0 00
Pureza de la muestra=
Como tiene que ser mayor a 1,8 se puede decir que la pureza es alta.