UNIVERSIDAD DEL ATLANTICO

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

PROGRAMA DE BIOLOGIA

INFORME DE LABORATORIO: TECNICA DE PCR Y ELECTROFORESIS

Rodríguez Sanjuán Deiwer

Estudiante del programa de Biología de la Universidad del Atlántico

INTRODUCCION:

La técnica de PCR (Polymerase chain Reaction) es de gran utilidad hoy en día en

el campo de la Biología Molecular, ya que este método es importante a la hora de
sintetizar muchas veces un pedazo o fragmentos de ADN in vitro, utilizando una
polimerasa que puede resistir a muy elevadas temperaturas ya que proviene de la
bacteria thermus aquaticus de ahí el nombre de taq polimerasa en el mercado.
Para la realización de esta técnica tal cual como sucede en las células ha de tener
todos los componentes necesarios en el tubo tales como los oligonucleótidos
(necesarios para que dé inicio a la transcripción), dinucleotidos (dNTPs), y las
condiciones para que se trabaje correctamente (pH, determinada cantidades de
MgCl2, KCl, y pueden utilizarse otras sales y reactivos), además de agua y buffers.
Para describir este método para llevar a cabo la amplificación del fragmento a
estudiar se necesita pasar necesariamente por 35 ciclos (Parkers, 2003) la cual
necesita de los siguientes pasos: la desnaturalización del ADN, alineamiento y
extensión. Por lo anterior se dice que la reacción de PCR los fragmentos se
amplifican de manera exponencial (Vierstracte, 2001).
Al final de la PCR, para saber a ciencia cierta si las reacciones funcionaron
correctamente, las ampliaciones son visualizadas a través de una electroforesis en
gel de agarosa.

En esta práctica se tuvo como objetivo de reforzar el conocimiento sobre

replicación apoyado en un método In Vitro como es la PCR Y así identificar y
analizar lo que se necesita para la amplificación de un fragmento de ADN de
interés.

METODOS Y MATERIALES
La práctica de laboratorio donde se desarrolló la técnica de PCR y posteriormente
la electroforesis para su posterior análisis, donde el primer método se utilizó dos
métodos el de coctel y el Master Mix, en mi caso me correspondió trabajar con el
Mater Mix, los primers de leptospira (7a y 7b), ADN y dNTPs, anteriormente se
mezclaron en tubos de eppendorf con los siguientes volúmenes, el Master Mix
con 56.25 μL, 3 μL de los dos primers (7a y 7b), ADN 1.25 Μl y dNTPs con 2 μL,
los materiales mencionados anteriormente se mezclaron en tubos de eppendorf
donde se homogenizo y se mezcló bien, para luego colocarlos en el termociclador
para comenzar los ciclos necesarios, en este caso fueron 25 ciclos.
Luego se llevó a cabo la electroforesis en gel de agarosa con marcador de pesos
molecular de 100 pb a unos 100 voltios para dos horas para conocer y verificar si
la reacción funcionó de manera eficiente y su posterior análisis.

Tubos de eppendorf Termociclador

RESULTADOS

CALCULO COCTEL

A continuación se hará los cálculos para las respectivas concentraciones finales

de cada ingrediente del coctel

a) Buffer de PCR: como está 10 veces concentrado, debemos diluirlo 10

veces. Así tendremos que agregar 50 μl del tampón 10 veces concentrado,
 a 500 μl de volumen final, para obtener tampón 1 vez concentrado (1X) en
la Master Mix.
b) MgCl2:
Se basara para calcular la CF la siguiente ecuación

CONCENTRACIÓN INICIAL x VOLUMEN INICIAL = CONCENTRACIÓN FINAL x VOLUMEN FINAL

Ci x Vi = Cf x Vf

C1 x V1 = C2
V2

50 m M x 2.5 μL = 10 m M
12.5 μL

C) dNTPs

C1 x V1 = C2
V2

2 m M x 6.25 μL = 1 m M
12.5 μL

D) Primers

C1 x V1 = C2
V2

10 m M x 2.5 μL = 2 m M
12.5 μL

E) Dmso

C1 x V1 = C2
V2

2 % x 1.25 μL = 0.002 %
12.5 μL

F) taq
C1 x V1 = C2
V2

5 u / μL x 1 μL = 0.4 u / μL
 12.5 μL

INGREDIENTE C1 C2 V1 V2
Buffer 10X 1X 6.25 μL 12.5 μL
dNTPs 2mM 1mM 6.25 μL 12.5 μL
Primers 10 m M 2nM 2.5 μL 12.5 μL
MgCl2 50 m M 25 m M 2.5 μL 12.5 μL
Dmso 2% 0.002 % 1.25 μL 12.5 μL
taq 5 u / μL 0.4 u / μL 1 μL 12.5 μL

Tabla 1. Concentraciones y volúmenes para llevar a cabo el coctel para la

realización de PCR.

Figura 1. Electroforesis en gel de Agarosa de la PCR realizada en la práctica.

DISCUSION:

Luego de realizar los protocolos pertinentes para la PCR, se obtuvieron los

resultados de la electroforesis para verificar de manera más simple su
amplificación en la figura 1, se puede deducir lo siguiente, como se trabajó con un
marcador de peso molecular de 100 pb, que en las corridas de los pozos
subrayados con los números 1, 2 y 3 que son del Master Mix, el primero puede
tener aproximadamente unos 750 a 800 pb, la segunda a unos 700 pb, los otros
que son por medio del coctel (4,5 y 6), la dos primeras las 4 y la 5 se observa de
manera fragmentada por lo que se puede inferir un mal manejo del protocolo o
quizás también Los inhibidores pueden actuar directamente inhibiendo la acción
de la Taq polimerasa o como en el caso de las proteínas y carbohidratos pueden
unirse los iones de magnesio no dejándolos disponibles para la polimerasa, por lo
que se puede notar en el pozo 6 donde claramente no se puede observar nada,
además la calidad va disminuyendo cuando se observa los 7,8 y 9, donde el 7 y el
8 se puede observar un amplicon que puede oscilar de 600 y 200 pb
respectivamente, mientras que la corrida del pozo 9 se observa un gran manchón
por lo que no se puede valorar como efectivo el taq en este segmento de ADN y
ya en los siguientes 3 corridas de los pozos 9,10 y 12 no se observa nada y yal
cual ocurrió como en el 6, por ser del mismo medio, es decir del coctel pudo haber
influido el mal manejo al igual inhibidores que no ayudaron a observar amplicones
en estas zonas.

CONCLUSION

Con la experiencia y los resultados abordados durante la práctica se puede

concluir que como todo protocolo que se lleve a cabo en Biología Molecular deben
ser exactos no se deben cometer errores ya que así no se obtendrán los
resultados esperados como sucedió en el caso de esta práctica, además nos
ayudó a implementar nuestros conocimientos acerca del funcionamiento de la
polimerasa en este caso de manera in vitro, de tal manera que se pudo entender
mejor de como este trabaja, en que medio y en cuales condiciones para llevar a
cabo su función, además que todo esto nos ayuda abrir campo sobre de tan cuán
importante es la Biología molecular como herramienta para el conocimiento ya que
gracias a estos métodos en este caso como lo es el PCR y toda su
fundamentación ayuda a entender mejor la transcripción de manera in vivo.

 BIBLIOGRAFIA

 http://www.revistaaquatic.com/aquatic/html/art1501/basespcr.htm

 Fundamentos de la reacción en cadena

de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real, Tamay de Dios L,
Ibarra C, Velasquillo C, http://www.medigraphic.com/rid

 Application of Multilocus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis for

Molecular Typing of the Agent of Leptospirosis, Laurence Salau¨ Fabrice
Me´rien, Svetlana Gurianova, Guy Baranton, and Mathieu Picardeau.

 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), Cátedra de Biología Celular y

Molecular (Bqca), UNIVE RSI DAD NACIO NA L DE MIS IO NES