UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

LICENCIADO EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
CURSO DE INGENIERÍA GENÉTICA

Síntesis Enzimática de Ácidos Nucleicos, Síntesis del ADNc de αGlucosidasa

Elaborado por:
Fecha Monterubio M. Leonardo
10/OCTUBRE /2019
Vargas Santoy Daniela Páginas 4
Herrera Mercado Nancy
Turrubiartes Suarez Alondra

1. OBJETIVO

 Realizar la síntesis enzimática de ADNc de αGlucosidasa mediante la amplificación por PCR

para su posterior análisis en electroforesis

2. FUNDAMENTO

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones
de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco
es copiada. La PCR depende de una ADN polimerasa termoestable, la Taq polimerasa, y requiere de
cebadores de ADN diseñados específicamente para la región de ADN de interés. La idea básica de la
técnica es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede
trabajar a temperaturas muy elevadas.
Generalmente, la PCR inicia con la desnaturalización o separación de la doble hélice de ADN mediante
el calentamiento de la muestra a una temperatura entre 94 y 96 °C para romper los puentes de hidrógeno
que las unían, de esta manera cada cadena queda como molde para la síntesis de una nueva cadena
complementaria de ADN. Una vez separadas las cadenas del ADN, se alinean los iniciadores a sitios
específicos complementarios de las cadenas sencillas de la región que se va a amplificar, para que esto
suceda se desiende la temperatura entre 40 y 60 °C lo que permite la unión de los iniciadores. Finalmente,
se sintetiza una nueva cadena en sentido 5’ a 3’ para lo cual se incrementa la temperatura, por lo general
a 72 °C, ya que es la temperatura óptima a la cual la ADN polimerasa se une a los iniciadores y comienza
la replicación. Estas tres etapas se repiten sucesivamente, en cada nuevo ciclo se amplifica
simultáneamente la región de interés de las dos cadenas complementarias, los productos generados
aumentan su concentración de manera exponencial porque cada nueva copia sirve de molde en los ciclos
subsecuentes dando origen a millones de copias del fragmento seleccionado. Esta técnica cambio los
paradigmas de la ingeniería genética permitiendo producir in vitro grandes cantidades de una secuencia
de ADN concreta sin recurrir a la clonación en un organismo huésped un método largo y tediosos, de tal
forma que la amplificación de ADN diana abrió un gran abanico de posibilidades y usos.

3. MATERIALES Y EQUIPOS

Equipos
Termociclador Juego de micropipetas
Camara de electroforesis

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Materiales
Bolsas de plástico Contenedores para deshechos químicos
Gradillas de plástico Contenedores para deshechos de material biológico
Hieleras de plástico Cajas de plástico para guardar tubos con muestras
Tubos Eppendorff de 0.2 mL estériles. Puntillas estériles para micropipetas (amarillas y
blancas)

Material biológico, soluciones, medios de cultivo y reactivos

Agua MilliQ Taq polimerasa
Buffer Green ADN Plasmidico pTOPOαGlu
Oligonucleotidos 3´ ADN Genómico Pichia pastoris
Oligonucleotidos 5´ Buffer de Carga
dNTP´s GelRed

4. PROCEDIMIENTO
Preparación de reacción de PCR

Reactivos Conc. Conc. final Volumen Volumen Volumen

Stock 1 Rxn 4 Rxn 5 Rxn
Agua MiliQ - - 13.3 μL 53.2 μL 66.6 μL
Buffer Green 10 X 1X 5 μL 20 μL 25 μL
Oligonucleótido 3’ 5 μM 500 nM 2.5 μL 10 μL 12.5 μL
Oligonucleótido 5’ 5 μM 500 nM 2.5 μL 10 μL 12.5 μL
dNTP’s 10 mM 200 mM 0.5 μL 2 μL 2.5 μL
Taq DNA 5 U/μL 0.04 U/μL 0.2 μL 0.8 μL 1 μL
polimerasa (1U total)
DNA plasmídico 20 ng/ μL - 2 μL - -
Tabla 1. Volúmenes de reactivos para la reacción de PCR

1. Calcular los volúmenes de reactivos necesarios para la reacción de PCR

2. Realizar el cóctel en un tubo Eppendorff de 2 mL:
a) Agregar 5 μL de buffer Green.
b) Agregar 2.5 μL de oligonucleótido 1.
c) Agregar 2.5 μL de oligonucleótido 2.
d) Agregar 0.5 μL de dNTP`s.
e) Agregar 0.2 μL de Taq DNA polimerasa.
3. Preparar dos dilución de ADN plásmidico y genómico, muestra y control + respectivamente
a) Preparar dilución de 1:100 del plásmido pTOPOαGlu, 99 μL de agua MiliQ y 1 μL de DNA
b) Preparar dilución de 1:10 del ADN genómico de Pichia Pastoris, 9 μL de agua MiliQ y 1
μL de DNA
4. Homogeneizar el cóctel con la micro pipeta

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5. Transferir 24 μL del cóctel a tres diferentes tubos Eppendorff de 0.2 mL (control (+), muestra 1,
muestra 2) reservar el sobrante como muestra (-).
6. Agregar 1 μL de agua MiliQ al control (-)
7. Agregar 1 μL de DNA pTopoαGlu al control (+)
8. Agregar 1 μL de Muestra ME a la muestra.
9. Introducir los tubos al termociclador y programar los ciclos.

Análisis de ADN amplificado por electroforesis en gel de agarosa

10. Preparar el gel de agarosa al 0.8%
11. Anadir en el carril1 1 μL del marcador “1kb DNA Ladder”
12. Mezclar en un papel 4μL de muestra y 2μL de GelRed para su trasferencia al gel
13. Repitiendo el procesos con cada muestra y controles
14. Correr gel a 100v, 84mA por 45 minutos

Notas aclaratorias: Las muestras de ADN plasmidico y genómico fueron extraídas en prácticas
anteriores y almacenadas a 4°C.

Precauciones: Todas las puntillas y tubos deben ser esterilizados, realizar el coctel en un área
asignada libre de interrupciones y con material a utilizar cerca.

5. RESULTADOS

M C+ C- 1 2 C+ C- 3 4 5

Pb
10000
8000
6000
4000
3000
2500
2000
1500

1000
750

500

250

Fig.1 Electroforesis de gel agarosa a 0.8%, M: marcador molecular 1kb Ladder, C+: control positivo, C-: control negativo,
1: muestra equipo1, 2: muestra equipo 2, 3: muestra equipo 3, 4: muestra equipo 4, 5: muestra equipo 5

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6. DISCUCION

Utilizando la técnica de PCR se logró la correcta amplificación de ADNc correspondiente al gen de la

αGlucosidasa dicho resultado se corrobora con lo esperado en un análisis insilico ya que con
herramientas bioinformática como es ampliFX se puede realizar de manera virtual una reacción de PRC
de esta modo se puede predecir una longitud del fragmentos amplificados de 2,726 pb utilizando primer
específicos para una correcta amplificación la secuencia de interés(Yu B., 2011); Por su parte utilizando
un método de análisis electroforético de los productos amplificados registro una amplificación aceptable
de la secuencia de ADN blanco, ya que se visualiza un solo bandeado en cada muestra de los 5 equipos
de una longitud aproximada a 2,700 pb resultado que en el análisis in silico simulando con los primer
forward y reverse se espera un valor aproximado a 2,726 pb, al igual estos resultados son tomados como
una fuente aceptable por los bandeados visualizados en los controles tanto positivos como
negativos(Robertson A.L, 2008); El control negativo no expresó ninguna señal visible de una posible
bandeado, signo de que en la preparación del coctel mix no ocurriera por accidente del analista una
contaminación de ADN, que se expresaría en el análisis de electroforesis como una tenue banda
indicando que la muestras amplificadas no son únicamente de la secuencia de interés
amplificadas(Garibyan, L., 2013), finalmente el control positivos nos da una segunda confirmación de
que la reacción de PCR fue preparada con volumen de reactivos correctos expresando en otra muestra de
ADN una amplificación, sin embargo este resultado solo se mostró en uno de los dos controles positivos,
se esperaría visualizar una amplificado de cualquier fragmento de ADN presente en el control pero este
no fue el caso, este inconveniente posiblemente se deba a errores del analista al no añadir una muestrea
de ADN a la reacción control.

7. RECOMENDACIONES
Revisar las condiciones de todo el equipamiento a utilizar, preparar un área libre donde se realizara el
coctel de PCR, mantener los reactivos y equipamiento al alcance del analista.

8. CONCLUSIONES
Fue obtenido por técnica de PCR fragmentos amplificados de ADNc de αGlucosidas, dichos fragmentos
presentaron una longitud aproximada a 2,700 pb, una longitud cercana a la predicha en herramientas
bioinformáticas, esta amplificación se expresó en un solo bandeado en el análisis de electroforesis en
todos las muestras utilizadas por cada equipo, afirmando que solo se amplifico la secuencia de interés,
corroborando con los controles tanto positivos como negativos que no existió alguna contaminación
externa de ADN, al igual se corrobora que el coctel se preparó correctamente de tal forma que con el uso
de ADN de una muestra diferente a la de interés se presentó una amplificación aceptable.

9. BIBLIOGRAFÍA
 Yu B., Zhang C.(2011). In silico PCR analysis. MethodsMol Biol. 2011;760:91-107. doi: 10.1007/978-1-
61779-176-5_6.
 Robertson, AL y Phillips, AR (2008). Integrando la teoría de PCR y la bioinformática en un ejercicio de diseño
de cebadores orientado a la investigación. Educación en ciencias de la vida de CBE , 7 (1), 89–95. doi: 10.1187
/ cbe.07-07-0051
 Garibyan, L., & Avashia, N. (2013). Polymerase chain reaction. The Journal of investigative dermatology,
133(3), 1–4. doi:10.1038/jid.2013.1
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