Universidad de los Llanos-Unillanos

Facultad de Ciencias Agropecuarias y Recurso Naturales-FCARN

Programa: Medicina Veterinaria y Zootecnia-MVZ
Laboratorio de Bioquímica Metabólica-LBM
Práctica 1
Profesor: Jairo Granados.,MSc

Práctica 1: Determinación Espectrofotométrica de Nitrógeno Total y Proteina Total

en muestras biológicas, método Biuret

1. Objetivos
 Determinar la concentración de Nitrógeno total y proteína cruda (PC) en muestras biológicas,
mediante la técnica espectrofotométrica del biuret
 Aplicar el método salting out, para extraer el nitrógeno y la proteina total en muestras de
carácter biológico.
 Elaborar una curva de calibración de proteínas totales, a partir de soluciones estándar de
albúmina sérica

2. Marco Conceptual

El Nitrógeno es un Bioelemento químico primario, perteneciente al grupo V-A de la tabla

periódica, de número atómico (Z) , siete(7) y masa atómica: 14 g/mol; se considera un
elemento biogenésico porque forma parte de la estructura de los seres vivos; El Nitrógeno
total(NT), presente en células animales y vegetales, está dado por las formas orgánica (NO)
e inorgánica (NI), que se presentan en las diversas biomoléculas de los seres vivos; el
Nitrógeno orgánico junto con el carbono, está incluído en los grupos funcionales: Amino (R-
NH2) y Amido (R-CO-NH2), en razón de sus capacidad para formar cadenas con enlaces
covalentes; un ejemplo de ello, es la urea (H2N-CO-NH2), considerada una diamida, con alta
riqueza de Nitrógeno que le confiere gran importancia en el sector agrícola y pecuario,
especialmente en fertilización de suelos y manejo nutricional de rumiantes; adicional a lo
anterior, se destaca el Nitrógeno Proteíco (NP), constituyente básico de los aminoácidos
(H2N-CH(R)-COOH), considerados como unidades elementales que originan proteínas
(biomoléculas poliméricas de alto peso molecular) mediante los denominados enlaces
peptídicos (-NH-CO-), generados por la unión entre un grupos carboxilo(-COOH) terminal de
un aminoácido y el grupo amino inicial de otro aminoácido; Las proteínas son originadas en
procesos metabólicos de biosíntesis como la fotosíntesis ý proteogénesis , derivada de
actividad de los ácidos nucleícos en núcleo y ribosoma celular; Este NP, también forma parte
de las llamadas bases Nitrogenadas(BN), que constituyen Biomoléculas importantes como
los ácidos nucleícos, ATP y cofactores REDOX, presentes en las vitaminas; La otra fracción
del NT, es el Nitrógeno no Proteíco (NNP),el cual está presente como Nitrógeno inorgánico,
en Nitratos (NO3-), Nitritos (NO2-), Amoníaco (NH3) y el catión Amonio(NH4+) que actúan en
los procesos de fijación biológica del nItrógeno (FBN).El NNP, destaca su papel en la
biosíntesis de proteínas a nivel ruminal.

Reactivos:
HCl 0.1 N, Indicador de Tashiro, Buffer Fosfato 0,05M pH=7,0; Albúmina 0,5% en Buffer
fosfato; Reactivo de Biuret; NaCl 1%.

Equipos:
Baño Termostatado, Balanza analítica, Espectrofotómetro, Agitador magnético,

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Programa: Medicina Veterinaria y Zootecnia-MVZ
Laboratorio de Bioquímica Metabólica-LBM
Práctica 1
Profesor: Jairo Granados.,MSc

Materiales:
Beakers de 100 y 250mL, embudo de filtración, probeta graduada de 100mL, papel filtro,
tubos de ensayo, pipeta graduada de 10mL;, espátula, Beakers de 100mL, 200mL y 400mL,
pipeta graduada de 10mL, Papel filtro; tubos de centrífuga;

3. Procedimiento
3.1 Curva de calibración de proteínas totales
 Alistar 6 tubos de ensayo, lavarlos, secarlos y rotularlos así: B: blanco; 1, 2, 3, 4 y 5.
 Colocarlos en la gradilla y adicionar cuidadosamente los siguientes reactivos en el orden
dado:
 Agitar vigorosamente los tubos de ensayo por 30 segundos y dejarlos reposar de 5 a 10
minutos, a temperatura ambiente
 Alistar el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nanómetros (nm)
 Calibrar el aparato con la solución presente en el tubo blanco (ajustar Absorbancia a 0,000,
Transmitancia: 100%)
 Colocar contenido del tubo 1, en celda espectrofotométrica, introducir la celda en el
compartimento del equipo, tapar y leer el valor de la Absorbancia(A)
 Proseguir con los demás tubos, consignar los valores de Absorbancia (A), en la tabla de datos
1.

3.2 Extracción de Nitrógeno y Proteina Cruda (Método salting out)

Reactivos Tubos
(mL ) B 1 2 3 4 5

Albúmina 0,5% 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Agua destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

Biuret 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0

Total 5 5 5 5 5 5

 Alistar las respectivas muestras de acuerdo a los protocolos indicados anteriormente

 Pesar más ó menos 2,0 gramos de muestra en la balanza analítica y registrar el valor exacto
como: Wm
 Colocar la muestra pesada en un beaker ó frasco de vidrio, adicionar 20mL de solución salina
de NaCl 1%
 Agitar con varilla de vidrio ó en agitador magnético durante 5 minutos, dejar reposar 3 minutos
 Depositar la solución salina de cada muestra en un sendos tubos de centrífuga, tapar y llevar
a la centrífuga
 Centrifugar a una velocidad de 3500rpm, durante 10 minutos

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Práctica 1
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 Alistar montaje de Filtración
 Sacar los tubos, filtrar sobre papel filtro, pasando el sobrenadante, medir el volumen del
extracto, registrar como: Vf (Volumen de filtrado), en la tabla de datos 2
 Extraer 5 mL del filtrado y depositarlo en un tubo de ensayo limpio, tapar y rotular así: ECPT:
Extracto de concentrado para proteínas totales
 Repetir procedimiento anterior con màs o menos 5g de suelo
 Rotular el extracto como: ESNT: Extracto de suelo para NT
 En un tubo de ensayo, Pipetear 0,5mL de plasma sanguíneo animal en 9,5mL de Na2SO4 del
22.6%, agitar cuidadosamente por 30segundos y rotular: SPPT: Solución de plasma para
proteínas totales

3.3 Mezcla de Reactiva para lectura espectrofotométrica

 Alistar 3 tubos de ensayo, rotularlos así: B: Blanco; m1, m2, m3

 Pipetear los siguientes reactivos:

Tubos
Reactivos (mL)
m1 m2 m3

ECPT 1,0 0,0 0,0

SPPT 0,0 1,0 0,0
ESNT 0,0 0,0 2,0
Biuret 4,0 4,0 3,0
Total 5,0 5,0 5,0

3.4 Lectura espectrofotométrica de extractos

 Alistar el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nanómetros (nm)

 Calibrar el aparato con la solución presente en el tubo blanco (ajustar Absorbancia a 0,000,
Transmitancia: 100%)
 Colocar contenido del tubo m1, en celda espectrofotométrica, introducir la celda en el
compartimento del equipo, tapar y leer el valor de la Absorbancia(A)
 Repetir el proceso con tubos m2 y m3 y consignar en la tabla de datos

4. Tablas de Datos

4.1 Tabla de datos Curva de Calibración para PT

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mL
Tubos Absorbancia (A)
Albúmina

4.2 Tabla de datos: Datos de la muestra para cálculo de NT y PC

Muestras
Indicadores Significado
m1 m2 m3

Wm (g) Peso de la muestra

Vf (mL) Volumen de filtrado

A Absorbancia