Guía de Prácticas de Bioquímica General - Semestre 2023-2

Práctica N°10:
TRANSAMINACIÓN

I. MARCO TEÓRICO

La Transaminación es una reacción mediante la cual el grupo alfa-amino de un

aminoácido es transferido al átomo de carbono alfa de un
cetoácido, originando que el alfa-cetoácido se transforme en un aminoácido y el
aminoácido que donó el grupo amino se convierta en el alfa-cetoácido correspondiente.
La ecuación general de esta reacción es:

R-CHNH2-COOH + R’-CO-COOH � R-CO-COOH + R’-CHNH2-COOH

Aminoácido 1 Cetoácido 1 Cetoácido 2 Aminoácido 2

La reacción de transaminación es probablemente una de las más difundidas en el

metabolismo de los aminoácidos. En estas reacciones participan principalmente los
aminoácidos denominados no esenciales. Esta reacción es catalizada por un grupo de
enzimas llamadas transaminasas, que actúan teniendo como coenzima a la vitamina B6
(Piridoxal fosfato, Piridoxamina fosfato) y su mecanismo de acción sería de transportador
del grupo amino.

Figura 1. Participación del piridoxal fosfato en la reacción de transaminación

Se conocen un gran número de transaminasas presentes en la mayoría de los tejidos,

siendo dos las más estudiadas. Una es la transaminasa Glutámico - Pirúvica (TGP) ó
Alanina aminotransferasa (ALAT, EC 2.6.1.2) que cataliza la transferencia del grupo amino
del glutamato al piruvato para generar cetoglutarato y alanina. La segunda es la
transaminasa Glutámico-Oxalacética (TGO) o Aspartato amino transferasa (ASAT, EC
2.6.1.1) que cataliza la transferencia del grupo amino del aspartato al -cetoglutarato para
generar el aminoácido glutamato y el -cetoácido oxalacetato.

La ALAT se encuentra predominantemente en hígado, mientras que la TGO tiene dos

isoformas la TGO1 presente en glóbulos rojos y corazón y la TGO2 en mitocondrias
hepáticas.
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En las actividades prácticas que desarrollaremos estudiaremos la actividad de la

transaminasa glutámico – pirúvica (TGP) presente en el hígado y emplearemos una
técnica cromatográfica para evidenciar su actividad.

Cromatografía

La cromatografía es un procedimiento de análisis mediante el cual podemos individualizar

un gran número de compuestos de interés biológico: carbohidratos, aminoácidos,
pigmentos, etc. Dentro de los diversos tipos de cromatografía, por ejemplo en capa fina y
en papel se basan en dos principios físicos:

a. Partición por solventes: Mediante el cual un soluto tiene mayor facilidad para
solubilizarse en un solvente que en otro.

b. Adsorción: Por el cual las sustancias se adhieren en la superficie de algunos medios

usados como soporte, con diferente afinidad.

En la práctica emplearemos la cromatografía en papel, que utiliza como soporte papel de

cromatografía Whatman N° 1 y una fase móvil (mezcla de solventes) para cumplir con los
dos principios enunciados.

Figura 2. Cámara para cromatografía

El reactivo ninhidrina es utilizado para revelar la presencia de aminoácidos en un

cromatograma, es ideal para detectar concentraciones bajas de aminoácidos. Es una de las
reacciones más sensibles para identificar aminoácidos, en general estos dan un color
violeta característico (llamado púrpura de Ruhemann) con la excepción de la prolina que
da una coloración amarillenta (recordar que en la prolina el grupo amino está sustituido).

La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) en presencia de compuestos que posee al

menos un grupo amino y otro carboxilo reacciona formando un derivado coloreado
generalmente azul y con desprendimiento de dióxido de carbono, lo que permite que esta
reacción sea a la vez un método general para estimación cuantitativa y cualitativa de los
aminoácidos.
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Figura 3. Formación del complejo coloreado de azul llamado púrpura de Ruhemann

OBJETIVOS:
- Demostración de la reacción de transaminación mediante cromatografía en papel.
- Detección y cuantificación de los aminoácidos empleando ninhidrina.

II. PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIENCIA 1: EVALUACIÓN DE LA REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN UTILIZANDO LAS

TRANSAMINASAS HEPÁTICAS

1.1. Preparación de homogenizado de hígado

a. En una placa de Petri colocada sobre hielo cortar 2 gr de hígado en trozos
empleando tijeras y enjuagar varias veces con buffer fosfato pH 7, para remover
los restos de sangre.
b. Transferir el tejido cortado al homogenizador y añadir aproximadamente 25 ml
de buffer fosfato y proceder a homogenizar.
c. Centrifugar el homogenizado a 2500 rpm durante 3 minutos.
d. Recuperar el sobrenadante en un tubo, adicionar buffer hasta llevar a 10% (p/v)
y rotular
e. Mantenerlo en baño de hielo.

1.2 Reacción enzimática

a. Preparar 2 tubos de prueba de acuerdo al siguiente esquema:

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Tubo
Reactivos (mL)
1 2
Alanina 0.2 M 0.3 -
Cetoglutarato 0.2 M 0.3 -
Glutamato 0.2 M - 0.3
Piruvato 0.2 M - 0.3
Arsenito 0.1 M 0.4 0.4
Enzima activa 1.0 1.0

b. Incubar los tubos en baño Maria por 30 min. a 37°C.

c. Cumplido el tiempo retirar los tubos y agregar 5 ml de etanol de 96° a cada tubo,
agitar vigorosamente y dejar en reposo durante 5 min.
d. A continuación centrifugar 15 min a 1500 rpm y reservar el sobrenadante para
la cromatografía.

1.3. Separación de aminoácidos por Cromatografía en papel

a. En nuestra práctica, utilizaremos papel Whatman N° 1 el cual se corta en

rectángulos de 5 cm x 13 cm de papel.
b. A 1.5 cm de la base trazar una línea con lápiz marcando sobre ella 4 puntos
denominados 1, 2, G y A y colocaremos 3 gotas del sobrenadante del tubo N°1 y
del tubo N°2 sobre los puntos 1 y 2 respectivamente y 1 gota de las soluciones de
aminoácidos alanina en el punto. A y 1 gota de glutamato en el punto G que
servirán como patrones de comparación.

TENER CUIDADO DE DEJAR SECAR ENTRE GOTA Y GOTA SOBRE EL MISMO

PUNTO
c. Colocaremos las tiras de papel en una cámara de cromatografía en la que
previamente se colocó como solvente una mezcla de propanol:agua en la
proporción de 80:20.
d. Dejamos correr hasta que el solvente haya recorrido aproximadamente 10 cm en
el papel.
e. Sacar los papeles de la cámara, marcar con lápiz el nivel al que ha alcanzado el
solvente y dejar secar completamente.
f. Para revelar aplicamos una solución de ninhidrina* al 0.1% en butanol y
colocamos el papel en la estufa por 10 min a 90°C.

Obtenemos los Rf de la siguiente manera:

Rf= Distancia del origen hasta el punto medio (mancha)

Distancia del origen hasta el nivel máximo (solvente)
.
De acuerdo al Rf de los patrones identificaremos los demás aminoácidos. Interpretar
los resultados.

1.4. Uso de Simulador para: Separación de aminoácidos empleando cromatografía

en capa fina.
Experimento virtual.
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http://biomodel.uah.es/lab/inicio.htm#cromat
Siga el protocolo del experimento y presente resultado en el informe

EXPERIENCIA 2: DETECCIÓN DE AMINOÁCIDOS CON NINHIDRINA

Prepare una batería de tubos con las soluciones indicadas según la siguiente tabla

Reactivo (mL) Tubos

Blanco 1 2 3 4 5 6

Sol. de histidina 150 µg/mL - 0.4 - - - - -

Sol. de treonina 150 µg/mL - - 0.4 - - - -

Sol. de prolina 150 µg/mL - - - 0.4 - - -

Sol.de leucina 150 µg/mL - - - - 0.4 - -

Sol. de albúmina 150 µg/mL - - - - - 0.4 -

Muestra problema - - - - - - 0.4

Agua destilada 1.8 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4

Reactivo de Ninhidrina 2% 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

a. Agite bien cada tubo y tápelos con papel aluminio.

b. Incube los tubos en baño María a ebullición durante 10 minutos. Transcurrido el tiempo
sumergir los tubos en un poco de agua fría cuidando que no se contaminen con el agua.
c. Analice los resultados de la reacción.

EXPERIENCIA 3: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE AMINOÁCIDOS CON NINHIDRINA

a. Prepare una batería de tubos con las soluciones indicadas según la siguiente tabla
Tubos
Reactivo (mL)
Blanco 1 2 3 4 5 6
Sol. de aminoácido 150 µg/mL - 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -
Agua destilada mL 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 1.0
Muestra problema mL - - - - - - 0.8
Reactivo de Ninhidrina 2% mL 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

b. Agite bien los tubos, tápelos con papel aluminio.

c. Incube los tubos en baño María a ebullición durante 10 minutos. Transcurrido el
tiempo enfríelos sumergiendo los tubos en un poco de agua fría cuidando que no se
contaminen con el agua.
d. Agregue a cada tubo 1 ml de agua destilada y agite.
e. Determine en el espectrofotómetro las Absorbancias a 570 nm de los tubos de la
curva patrón (tubos 1 al 5) como de la muestra problema (Tubo 6), calibrando el
espectrofotómetro con el contenido del tubo blanco de reactivos.
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III. PUNTOS DEL INFORME

El informe deberá contener una carátula y desarrollo de los siguientes puntos:

Resumen (que contenga 250 palabras, mencionando una breve introducción, el o los
objetivos de la práctica, las experiencias realizadas, resultados y conclusiones).

Experiencia 1: Evaluación de la reacción de transaminación

- Utilizando los cromatogramas obtenidos en la práctica, calcule los Rf de los patrones y
de los sobrenadantes de los tubos 1 y 2 e identifique el aminoácido presente.
- Explique en detalle los resultados obtenidos en la reacción de transaminación.

Experiencia 1.4. Usando el simulador virtual para la Separación de aminoácidos

empleando cromatografía en capa fina.
- Anote el código asignado a su experimento y qué aminoácido y muestra aplicó en
cada una de las posiciones de la placa. Añada la foto del resultado.
- Explique la distinta movilidad de cada patrón en relación con su estructura.
- Comparando el resultado de los Rf de los patrones y de las muestras, diga qué
aminoácidos contiene cada una de las muestras.

Experiencia 2: Detección de aminoácidos con ninhidrina

- Utilizando los resultados obtenidos de la experiencia determine la naturaleza de la
muestra problema y fundamente su conclusión.

Experiencia 3: Determinación cuantitativa de aminoácidos con ninhidrina

- Utilizando los resultados obtenidos, determine la concentración total de aminoácidos
en la solución de la muestra problema.

Para ello deberá determinar la concentración de aminoácidos en cada tubo y luego elaborar
una gráfica de la curva patrón en una hoja de excel, graficando concentración
aminoácidos(ug/mL) vs absorbancia (570 nm).

Material audiovisual complementario

- Cromatografía en capa fina (TLC):

https://www.youtube.com/watch?v=rMGQavOMAmc (duración de video: 5 min.)
- Tipos de cromatografía en papel:
https://www.youtube.com/watch?v=mz_xcNrTK_U (duración: 3 min.)
- Separación de aminoácidos por TLC:
https://www.youtube.com/watch?v=tDaKxskUwA0 (duración de video: 4 min. )
- Detección y Cuantificación de aminoácidos con ninhidrina:
https://www.youtube.com/watch?v=mzoHF3VK9Ek (duración de video: 3 min. )
https://www.youtube.com/watch?v=JdXbTWfOc18 (duración de video: 3 min. )

IV. CUESTIONARIO:

1. ¿Cree usted que puede haber diferencias en los contenidos de los sobrenadantes
obtenidos de los tubos 1 y 2? ¿A qué se debería?
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2. ¿Diga qué función cumple el arsenito de sodio en la mezcla de la reacción enzimática?

y ¿Por qué no fue necesario incluir fosfato de piridoxal en el tubo de muestra?
3. ¿Cómo se explica la separación de los aminoácidos contenidos en los sobrenadantes
de los tubos N° 1 y N° 2 por medio de la cromatografía en papel? ¿Qué factores
podrían estar influenciando en esas diferencias?
4. De variar la composición de los solventes de la fase móvil ¿habría diferencias en los
resultados obtenidos en la cromatografía, explique por qué?
5. ¿Qué importancia tiene la determinación del Rf de los aminoácidos estándar?
6. De variar la distancia recorrida por el solvente en la cromatografía ¿habría
diferencias en los valores de Rf obtenidos para los estándares utilizados en la
cromatografía?
7. ¿Cómo se explica la efectividad del reconocimiento de los aminoácidos presentes en
los tubos 1 y 2 al utilizar el reactivo de ninhidrina?
8. ¿Es posible identificar los aminoácidos utilizados en práctica mediante otros
reactivos diferentes a la ninhidrina?, ¿cuáles y por qué?

V. REFERENCIAS

- Berg, J. 2008. Bioquímica. 6ta edición. Editorial Reverté S.A., Barcelona.

- Devlin, T.M. 1986. Bioquímica. Libro de Texto con Aplicaciones Clínicas. Editorial
Reverté S.A., Barcelona.
- Jorrín, Jesús; Abril, Mª Nieves; Bárcena, José. Capítulo 1. Separación de aminoácidos
por cromatografía en capa fina y detección mediante reacción con ninhidrina.
- Koper K, Han SW, Pastor DC, Yoshikuni Y, Maeda HA. Evolutionary origin and
functional diversification of aminotransferases. J Biol Chem. 2022
Aug;298(8):102122. doi: 10.1016/j.jbc.2022.102122. Epub 2022 Jun 11. PMID:
35697072; PMCID: PMC9309667.
- https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/11%20CROMATOGRAFOA%20DE%20CAPA%20FINA%20DE%20AAs.pdf
- Plummer, David. 1981. Prácticas de Bioquímica. Editorial McGrawHill. Segunda
Edición. Bogotá-Colombia

Blga Elena Arbaiza