Laboratorio Biología Molecular

Nombres:
Sergio Camargo, Sandra Díaz, Juan Ibarra, Ana Padilla

PCR y Electroforesis

Preguntas teóricas

1. Complete el siguiente cuadro. Resuma cada función en una sola frase

(0.2).

REACTIVO FUNCIÓN

Buffer
Solución reguladora del pH para que funcione la polimerasa.

MgCl2 Cofactores de la polimerasa que ayudan a la visualización de los

primers.

dNTPs
Nucleótidos que actúan como sustratos para polimerizar nuevo ADN.

Primers Se unen a las cadenas sencillas del ADN para elongar el resto de la
secuencia objetivo.

Taq polimerasa Ayuda a los primers a unirse a las cadenas sencillas del ADN.

ADN
Cadena en forma de hélice que contiene el material genético.

2. Teniendo en cuenta las concentraciones iniciales (stock) y los volúmenes en la reacción de PCR,
calcule la concentración final de todos los reactivos. (No olvide poner las unidades, Volumen
final= 25µL). (0.2)
 Concentración Volumen Concentración
Reactivo
inicial Inicial (µL) final

Buffer 10X 2,5 1X

MgCl2 50mM 1,5 3mM

dNTPs 100mM 0,5 2mM

Primers 10uM 0,5 0,2uM

Taq 6U/µl 0.072U/µl

0,3
polimerasa

3. ¿Cuántas copias del fragmento hay al final del tercer (3) ciclo de una reacción de PCR?
¿Cuántas de esas copias de cadena sencilla corresponden al tamaño esperado? Dibuje el
proceso para poder responder a estas preguntas. (0,4)

R// Al final del tercer ciclo de una reacción de PCR se obtienen 2 moléculas del fragmento
deseado de la misma longitud, claramente, cada una tiene 2 copias de cadena sencilla, es
decir, tendremos 4 copias de cadena sencilla al final (suponiendo que en un inicio solo
tenemos 1 copia del templado)

Figura 1. G.Orellano, E., 2020.

Reacción En Cadena De La Polimerasa (PCR). [online] Fbioyf.unr.edu.ar. Available at:
<https://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/184300/mod_resource/content/1
/PCR%20EO%20Biotec%20LB%202019.pdf> [Accessed 2 April 2020].

4. Complete la tabla del perfil térmico de una PCR en general. Básese en protocolos
 encontrados en la literatura (0.2):

Temperatura
No. Ciclos Proceso Duración
(°C)
Denaturación del
1 ADN 90-95 5 min
Alineamiento o
unión del
cebador. 40-68 20-40 min
Depende de la Tm de los
Anillaje primers 1 min
Síntesis de nuevo
30 ADN 75-80 1 min

1 Elongación 70-74 10 min

5. ¿En qué consiste el qPCR y cuáles son las ventajas de este tipo de PCR? (0,5)

La qPCR consiste en el monitoreo del progreso de la PCR en tiempo real, es decir,

mientras se va realizando la PCR el ADN amplificado es cuantificado. Esto se da por la
adición de una molécula fluorescente que se asocia al ADN amplificado, así pues, a
medida que se amplifican más moléculas de ADN, también aumenta la fluorescencia.
La ventaja de esta técnica frente a otros tipos de PCR es la flexibilidad con la que
cuenta en su diseño operativo permitiendo de tal manera la identificación cualitativa
o cuantitativa del ácido nucleico en cuestión, de acuerdo con el propósito del estudio
o prueba.

Bibliografía:
investigación, S., (USAII), U. and real, P.
investigación, S., (USAII), U., & real, P. (2020). PCR en tiempo real - Facultad de
Química. Retrieved 2 April 2020, from
https://quimica.unam.mx/investigacion/servicios-para-la-investigacion/usaii/pcr-en-
tiempo-real/

6. Diga las ventajas y desventajas de usar el gen 16sRNA para la identificación de

bacterias (0,5).
Ventajas:
- El gen 16sRNA contiene nueve regiones menos conservadas o hipervariables.
Estas son las responsables de aportar la mayor información de utilidad para estudiar
la filogenética y taxonomía. Además, permiten diseñar primers universales los cuales
permiten la amplificación de variadas regiones hipervariables.

- Posee cierta variabilidad tal que permite reconocer no solo los organismos
más alejados, sino también los más próximos, permitiendo así su
diferenciación.
- Su estructura secundaria es provechosa en cuanto al alineamiento adecuado
durante la comparación de secuencias de muestras, en este caso bacterianas.

Desventajas:
 - Presenta deficiencia para detectar un número considerable de organismos
bacterianos que no hayan sido cultivados y provengan de muestras del medio
ambiente
- Ciertas regiones del gen no son muy eficientes para el reconocimiento y
diferenciación de algunas muestras bacterianas.
- -Son muy promiscuos por lo que pueden generar arboles filogenéticos
erróneos.

Bibliografía:
Valenzuela-Gonzalez, F. (2015). The 16S rRNA gene in the study of marine microbial
communities. Ciencias Marinas, 41(4), 297-313. doi: 10.7773/cm.v41i4.2492

7. ¿Qué haría usted para asegurar que la banda encontrada en el gel

corresponde al gen 16sRNA? (0,5)

Usar un control positivo con el cual comparar la sección amplificada de la muestra

estudiada.

Preguntas Prácticas

1. Describa resultados de PCR. (0,75)

a. ¿Cómo es un buen control negativo? Describa que tiene dentro de la reacción como
se vería en el gel y por qué.
Un buen control negativo sería un tubo en que se coloquen los reactivos
usados para PCR, es decir, Buffer, Taq polimerasa, entre otras cosas. En caso
de que se produzca amplificación en este tubo, podremos determinar que hay
algún agente contaminante en la solución, es decir, ADN restante que no es
de nuestro interés. En el gel esta muestra se vería como fragmentos de menor
peso, suponiendo que la proporción de contaminante no es muy alta. Esto
último ocurre debido a que, aunque la acción entre los primer y el templado
sea específica, también se comenten errores que pueden llevar a la
amplificación de ADN no deseado.
b. Para la amplificación del 16s ¿Cuántas bandas se deben ver en cada pozo? ¿Qué
características tiene una banda de alta calidad?
Idealmente se debería ver al final de una PCR exitosa, en este caso 1 banda de
un peso bien definido, pues el objetivo de la PCR consiste en la amplificación
de una secuencia específica de ADN, por lo que la presencia de más de una
banda o degradación indicaría posibles errores de especificidad en el
reconocimiento de la secuencia por parte de los primers – lo cual puede
deberse a ciclos de temperatura errónea o mal diseño-.
c. ¿Qué es un control positivo? ¿Cuál es su importancia? En el caso de la amplificación
del 16s, ¿que muestra tomaría para un control positivo?
Un control positivo es aquel en donde el grupo de control dé un resultado
positivo, en este caso utilizar una PCR realizada con anterioridad y de una
muestra purificada para poder ejercer una referencia de lo que se espera
obtener al final de la PCR, es decir, una sola banda de un peso específico
y predecible. Es importante porque es un indicador de si hay problemas
en nuestro experimento. En el caso puntual de la amplificación del 16s
tocaría tomar una región amplificada de la 16s del mismo organismo, a
 menos que queramos contrastar ahí se buscaría una cepa de la cual ya se
tuviese los datos conservados a ver si es el mismo o diferente.
2. Calcule el peso molecular de la banda señalada en el gel según lo explicado en
los videos. Grafique la regresión lineal y dé la ecuación de la recta junto con el
R2. (revisar gel anexo) (0,75)
y = -0,0049x + 4,8861
R² = 0,9973

Distacia en pixeles Log MP

252 3,6989
280 3,4771
321 3,3010
346 3,1760
385 3,0000
417 2,8750
452 2,6989
513 2,3970
586 2,0000

Log MP
4.0000
y = -0.0049x + 4.8861
3.0000 R² = 0.9973

2.0000

1.0000

0.0000
0 100 200 300 400 500 600 700

El peso calculado de 2080.18kb

3. Teniendo en cuenta la situación actual diseñe un experimento en el que pueda

ayudar al diagnóstico molecular del retrovirus (COVID-19) Coronavirus (1).
a Que información del virus necesita para el diagnóstico del virus.
Uno de los datos que hay que saber es el tipo de material genético que
tiene el virus, por ejemplo, SARS-CoV-2 es de la familia
Orthocoronavirinae que significa que es virus ARN monocatenario
positivo1. Por esto, se necesita hacer un PCR-RT (reacción en cadena de la
polimerasa con transcriptasa reversa). Por otro lado, también es
importante cómo obtendremos la muestra porque de acuerdo con la
procedencia de la muestra, suponiendo que es de una persona infectada,
obtendremos concentraciones diferentes. Particularmente, con el
coronavirus se ha encontrado que se obtienen muestras con
concentraciones altas en las vías respiratorias inferiores de los infectados,
así como en el suero2. Finalmente, considero que hay que tener
conocimiento sobre la composición del material genético del virus ya que
con esto sabremos cual es el fragmento de gen que queremos amplificar
para comprobar la presencia de este virus.

No obstante, se tiene que mencionar el proceso de extracción de la

muestra, el cual puede variar un poco al saber que es un virus RNA.
Primero, el RNA es bastante más delicado que el DNA, por lo que se debe
 ser precavido al momento de tratar la muestra –evitar contaminación,
degradación, etc-. Ahora bien, se ha tomado como referencia un proceso
de extracción e identificación recomendado por la OMS (3), el cual no se
diferencia mucho del DNA, pues también hace uso de centrifugación en
columna y purificación utilizando reactivos como el Tiocianato de
Guanidina, el cual elimina DNA y RNAasas. Para terminar, la muestra no
puede ser extraido de cualquier tejido, pues el kit NucleoSpin Dx Virus
indica debe ser suero sanguíneo.

NOTA: El PCR en tiempo real utiliza un intercalante de fluorescencia para

la detección de patógenos de forma cuantitativa.

1. Woo, Patrick C. Y.; Huang, Yi; Lau, Susanna K. P.; Yuen, Kwok-
Yung (2010-08-24). «Coronavirus Genomics and Bioinformatics
Analysis». Viruses 2 (8): 1804-1820. ISSN 1999-4915.
2. Apps.who.int. 2020. Pruebas De Laboratorio Para El
Coronavirus Causante Del Síndrome Respiratorio De Oriente
Medio (MERS-Cov). [online] Available at:
https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/188247/W
HO_MERS_LAB_15.1_spa.pdf;jsessionid=BFD77740F07881FC2
F94FB0DA3F3EB48?sequence=1> [Accessed 2 April 2020]

3. Corman VM, Landt O, Kaiser M, et al. Detection of

2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-
PCR. Euro Surveill 2020;25. OMS:
https://www.who.int/docs/default-
source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-
detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-
paris.pdf?sfvrsn=3662fcb6_2&fbclid=IwAR088Jtzpsv
EegbrrVesMwKF2y3XHilKjyKsiUjLPOqlppD2AO5aGO
wpjcY

b Cuales serían sus controles positivos y negativos.

El control negativo sería una muestra de la solución master mix junto a
agua estéril, lo cual indica la ausencia de replicación 1. En cambio, el control
positivo debe contener el DNA a replicar con la solución master mix, la cual
permitirá la correcta amplificacción de esta. Además, se tiene que
garantizar la integridad de la muestra que se usará para el control –estos
detalles fueron discutidos anteriormente-
1. Hipertextos del área de biología. Amplificación por la PCR.
(1998-2007). Universidad del Nordeste. Retrieved 2 April
2020, from
http://www.biologia.edu.ar/bacterias/identificacion/2.htm

c) Como se vería un paciente positivo y uno negativo.

En la prueba IgG e IgM realizada a un paciente negativo no aparecería
ninguna línea o banda marcada-
En la prueba IgG e IgM realizada a un paciente positivo aparecerían líneas
marcadas, no importa la intensidad del color ya que esta varía
dependiendo de la concentración de anticuerpos contra el SARS-COV-2
en la muestra. Por lo tanto, cualquier intensidad se debe entender como
positivo.

(2020). Retrieved 2 April 2020, from https://www.praxisdienst.es/out/media/Test-

Coronavirus-COVID-19-RightSign_ES.pdf