Expresión, purificación y cuantificación del

citocromo c
Inmaculada Sánchez Ruiz1
1
Estudiante de segundo de bioquímica por la Universidad de Sevilla

Palabras claves: citocromo c, Escherichia Coli BL21 (DE3), cromatografía por intercambio catiónico,
cuantificación por Bradford
Resumen
1
El citocromo c es una proteína que ejerce distintas funciones según su localización celular y las
condiciones en las que opera. En este estudio, se tratan los procesos de expresión, purificación y
cuantificación del citocromo c. Para ello se utilizan técnicas como la electroforesis, la
cuantificación por el método de Bradford y la cromatografía de intercambio catiónico. Una vez
obtenido el citocromo c purificado se usará para investigar sobre sus funciones.

Introducción molde. Se colocaron las muestras de reacción en

El citocromo c es una proteína que interviene
como 3transferente de electrones en la
fosforilación oxidativa, en el espacio mitocondrial
intermembrana, y 1actúa como agente
desintoxicante para eliminar ROS. 3Además, en
condiciones proapoptóticas, gana actividad de
peroxidasa de cardiolipina, se transloca al citosol
para participar en la vía apoptótica intrínseca y
entra al núcleo donde impide el ensamblaje del
cromosoma. Otras funciones detectadas son la
detección redox citosólica y la participación en la
maquinaria de plegamiento oxidativo
mitocondrial.
2
El citocromo c tiene un grupo hemo unido que se
une al citocromo por la formación de enlaces
tioéter entre el hemo y dos cisteínas en el
citocromo. Se une covalentemente en el motivo
CXXCH característico.
Materiales y métodos
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Se realizó la PCR para amplificar el gen de un
plásmido dado.
Se preparó la muestra de reacción para realizar la
PCR. Para ello se mezclan 46 µL de Master Mix,
compuesto por 86,9% de agua miliQ, 10,9% de
buffer de polimerasa y 2,2% de mezcla de dNTPs,
con 2 µL de Oligo Mix, compuesto por 75% de agua
miliQ, 12,5% de primer forward y 12,5% de primer
reverse, con 1 µL de ADN polimerasa y 1 µL de ADN
un termociclador, donde se repitió el siguiente
ciclo 35 veces: durante 30 s a 95ºC para
desnaturalizar el ADN, durante 30 s a 55ºC para la
hibridación del ADN molde con los primers y
durante 1 min y 30 s a 72ºC para elongar las
nuevas hebras. A continuación, durante 5 min se
mantuvo a 72ºC para completar el proceso de
polimerización. Tras esto se mantuvieron las
muestras a 4ºC.
Electroforesis en gel de agarosa 1%
El producto de la PCR es separado por carga y
tamaño para identificar el plásmido obtenido.
Para la preparación del gel de agarosa se preparó
10 mg/mL de agarosa en de tampón TBE 1×,
realizado a partir de tampón TBE 5×, compuesto
por 54 g/L de Tris base, 27,5 g/L de ácido bórico y
EDTA 0,5 M a pH 8,0. Se hirvió la disolución y se
atemperó la mezcla hasta 60ºC. Se añadió 5 µL de
agente intercalante SYBR-SafeTM para la tinción de
los resultados. Se vertió la preparación de gel en
un molde, se introdujo el peine para la formación
de pocillos y se dejó solidificar. Tras solidificar se
colocó en la cubeta de electroforesis que fue
llenada con tampón TBE 1×.
Las muestras se prepararon a 33,3% del ADN
obtenido con la PCR, 16,7% de tampón de carga 6×
y 50% de agua miliQ. Junto con las muestras se
cargó un marcador de tamaño de ADN
GeneRulerTM. Se dejó correr a 80 V durante 40 min
y se vieron los resultados con la aplicación de luz
UV en transiluminador.
Transformación y cultivo bacteriano
Se transformó el plásmido de citocromo c en E.
Coli BL21 (DE3) mediante choque térmico.
Tras descongelar en hielo las células competentes,
se añadió 1 µL de plásmido de citocromo c y se
incubó durante 15 min en hielo. A continuación, se
realizó un choque térmico durante 45 s a 42ºC y se
incubó en hielo durante 5 min. Luego, se añadió 1
mL de medio LB, preparado con 10 g/L de triptona,
5 g/L de extracto de levadura y 10 g/L de NaCl. Se
dejó incubar a 37ºC en agitación. Por último, se
sembró 150 µL de cultivo en la placa de Petri de
LB-agar con ampicilina, el medio LB-agar estaba
compuesto por 10 g/L de triptona, 5 g/L de
extracto de levadura, 10 g/L de NaCl y 15 g/L de
Bacto-agar y se añadió 100 µg/mL de ampicilina y
1% de glucosa para obtener un mayor
crecimiento. Se incubó a 37ºC durante 1 día.
Además, se inoculó en 20 mL de medio LB 0,75%
de cultivo, 1% de glucosa y 100 µg/mL de
ampicilina. Se incubó a 37ºC en agitación.
Expresión de proteínas recombinantes
Se inoculó nuestras bacterias para obtener el
citocromo c.
Se inoculó en 100 mL de medio LB 0.15% de
bacterias crecidas en medio LB suplementado con
ampicilina, 100 µL/mg de ampicilina y 50 µM de
FeCl3. Se incubó a 30º durante un día.
Extracción del citocromo c
Se centrifugó el cultivo con el citocromo c
expresado a 4000×g durante 10 min. Se descartó
el sobrenadante y se resuspendió el pellet con 15
mL de tampón de lisis de intercambio catiónico
preparado con tricina-NaOH 10 mM a pH 8,5. Se
volvió a centrifugar de la misma manera y se
despreció sobrenadante y se dejó el pellet a 4ºC.
Se añadió 5 mL de tampón de lisis de intercambio
catiónico y se resuspendió. Para producir la lisis se
añadió 1% de inhibidor de proteasas cOmpleteTM,
0,01% de PMSF, 0,02 mg/mL de ADNasa y 0,2
mg/mL de lisozima. Se sonicó durante 5 min en
intervalos de 30 s intercalados por 30 s de pausa a
una amplitud del 20%, esto es realizado en hielo
para no sobrecalentar las células. Se centrifugó a
20000×g durante 5 min a 4ºC y se separó el
sobrenadante del pellet y ambos fueron
guardados a 4ºC.
Purificación de la proteína
El citocromo c es purificado por cromatografía de
intercambio iónico.
Se añadió a la columna una matriz de carboximetil
celulosa, formada por 0,5 g/mL de matriz CM-52
en Tricina-NaOH 10 mM a pH 8,5. Y se lavó con 50
mL de agua miliQ y con 30 mL de tampón de lisis
de intercambio catiónico. Se vertió el
sobrenadante de la extracción de citocromo en la
columna. Se realizaron lavados con 10 mL de
Tricina Na-OH 10 mM pH 8.5 con concentraciones
crecientes de NaCl de 10, 20, 50 100, 200 y 300
mM. Se recogieron fracciones de 2 mL, excepto la
primera que se recogió en tubo Falcon de 15 mL.
Electroforesis en gel de acrilamida
Esta técnica es realizada para ver cómo de puras
son las fracciones recogidas por la cromatografía.
Se preparó el gel donde se realizó la electroforesis,
compuesto por el gel de separación 15% de
acrilamida y el gel de apilamiento. El gel de
separación se preparó a partir de 25% de tampón
Lower (Tris-HCl 1,5M pH 8,8), 35,8% de diH2O,
37,1% de Bis/Acrilamida 40%, 1% de SDS 10%,
0,1% de TEMED y 1% de APS 10%. Se vertió la
mezcla en los cristales donde se realiza la
electroforesis. Sobre ella se echó agua para que
solidificara. Tras la solidificación se eliminó el agua
de los cristales. A continuación, se echó el gel de
apilamiento. El gel de apilamiento se preparó a
partir de 37,7% de tampón upper (Tris-HCl 0,5M
pH 6,8), 44,2% de diH2O, 14,9% de Bis/Acrilamida
40%, 1,5% de SDS 10%, 0,2% de TEMED y 1,5% de
APS 10%. Cuando se echó se puso un peine para
formar los pocillos y se esperó hasta que solidificó.
Una vez se solidificó se colocó el gel en el
dispositivo de electroforesis y se llenó la cubeta
con running buffer 1×, preparado a partir de
running buffer 10× (30,25 g/L de Tris base, 144,1
g/L de glicina y 10 g/L de SDS). Las muestras fueron
preparadas a partir de 75% de las fracciones
obtenidas por cromatografía y 25% de tampón de
carga 4×. Se incubó a 100ºC durante 5 min, se hizo
un pulso en microcentrífuga y se dejó en hielo. Por
último, se cargaron las distintas muestras junto
con un marcador de peso molecular, el pellet
resuspendido y el sobrenadante. Se aplicó un
voltaje de 80V durante 5 min y tras esto se pasó a
voltaje de 200V. Se dejó correr hasta que las
muestras llegaron al final.
Tras esto se tiñó el gel con azul de Coomassie
durante 20 min en agitación. Se retiró el tinte, se
echó agua miliQ y se volvió a dejar 15 min en
agitación. Se retiró el agua y se volvió a echar agua
miliQ, se dejó 1 día. Pasado ese tiempo se
fotografió.
plásmido de citocromo c tiene 312 pb. Además,
podemos observar que el plásmido 1 sale en torno
a 700 que es el plásmido GFP, pues este tiene 720
pb, y el plásmido 3 sale en torno a 500 que es el
plásmido p53, pues tiene 500 pb.

Cuantificación del citocromo c

Esto se realizó para ver cuánta proteína se había
conseguido purificar. Se realizaron dos métodos:

- Método de Bradford
Para poder realizar este método se realizó una
recta de calibrado a partir de una disolución de 1
mg/mL de BSA. Se prepararon distintas muestras
con distintas concentraciones de disolución de
BSA. Cada muestra tenía un 20% de reactivo
Bradford y sucesivamente 0, 2, 5, 7,5, 10, 15, 20,
30, 35 y 40 mg/mL de disolución de BSA. Para
realizar las muestras se añadió primero agua, FIG 1. Electroforesis en gel de agarosa 1%. 4: marcador
luego BSA y por último reactivo de Bradford. Se de ADN. 1: GFP. 2: citocromo c. 3: p53.
midió la absorbancia a 595 nm tras 5 min, se El plásmido 2 tiene el gen AmpR, es decir, otorga a
realizaron varias replicas y se trazó la recta. la bacteria resistencia contra ampicilina. Por tanto,
Para cuantificar las fracciones, se preparó las al transformar nuestro plásmido en E. Coli se
muestras con un 20% de reactivo Bradford y utilizó ampicilina, para asegurarnos que solo
nuestras fracciones a una concentración que crecen bacterias que tienen el plásmido con el gen
quede dentro de la recta de calibrado. Se midió la de citocromo c.
absorbancia a 595 nm. Por último, se calculó la
concentración mediante la recta de calibrado.

- Espectrofotometría UV-visible
Se midió la absorbancia de las fracciones a 550 nm.
Para ello se redujo el citocromo c echando un 0,5%
de ascorbato sódico sobre la fracción que se iba
midiendo. Se obtuvo la concentración con la ley de
Lambert-Beer, sabiendo que el coeficiente de
extinción es 28.92 Lmmol-1cm-1.

Resultados y discusión
Identificación del plásmido
El experimento se inició con tres plásmidos
distintos que poseían genes de GFP, citocromo c y FIG 2. Estructura del plásmido citocromo c.
p53. Para identificar el citocromo c, que era con el
que se quería trabajar, se realizó la PCR para Purificación del citocromo c
amplificar el gen y realizar de esto una
Como el citocromo c tiene un punto isoeléctrico de
electroforesis al 1% de agarosa. (FIG 1) Se pudo
9,59 se realizó una cromatografía por intercambio
observar que el plásmido 2 era el citocromo c,
catiónico, pues el citocromo c posee carga
pues la banda estaba un poco por encima de la de
positiva, pues el pH de la matriz es de 8,5, y se
300 del marcador de tamaño de ADN, pues el
unirá a la matriz que es negativa. Los lavados a
concentraciones crecientes de sal nos permitieron
recoger la proteína pura, pues la sal a determinada
concentración apantalla las cargas y eluye al
citocromo c de la matriz. Las proteínas
inespecíficas que tenía nuestra muestra saldrán
primero pues se unen débilmente a la matriz o no
se unen, y por tanto necesitan menos
concentración de sal para liberarse.

Electroforesis en gel de acrilamida

Esta técnica se realizó después de la cromatografía FIG 3. Electroforesis en gel de acrilamida. P: pellet. M:
marcador. S: sobrenadante. E: eluato. 2: NaCl 10mM.
por intercambio catiónico. Permitió observar en
4.3: tercera fracción recogida a NaCl 20mM. 5.1:
que fracciones se tenía la proteína pura. primera fracción recogida a NaCl 50mM. 5.4: cuarta
(FIG 3 y 4) Con la ayuda del marcador de peso fracción recogida a NaCl 50mM. 6.3: tercera fracción
molecular se pudieron obtener las siguientes recogida a NaCl 100mM. 6.5: quinta fracción recogida a
conclusiones de la electroforesis: la banda que NaCl 100mM.
sale un poco más para abajo del marcador 15KDa
es el citocromo c, pues este tiene un peso
molecular de 12KDa. En el pellet se observa tanto
citocromo c como otras proteínas inespecíficas de
la bacteria. El citocromo c que se observa es
debido a que al sonicar no se terminó de obtener
todo el citocromo c y hubo parte que se quedó
dentro de cuerpos de inclusión y en células que no
se rompieron. En el sobrenadante se observa
citocromo c y muchas proteínas inespecíficas de la
bacteria. En el eluato, que son las proteínas que no
FIG 4. Electroforesis en gel de acrilamida. M: marcador.
se han quedado unidas a matriz, se observa
7.3: tercera fracción recogida a NaCl 200mM. 7.4:
proteínas inespecíficas que no tienen carga y cuarta fracción recogida a NaCl 200mM. 7.5: quinta
citocromo c. En la fracción 2 se observa proteína fracción recogida a NaCl 200mM. 7.6: sexta fracción
que es liberada de la matriz con una concentración recogida a NaCl 200mM. 8.1: primera fracción recogida
de NaCl baja, debido a que se unen débilmente a a NaCl 300mM. 8.2: segunda fracción recogida a NaCl
matriz, y citocromo c. En las fracciones 4.3, 5.1, 300mM. 8.3: tercera fracción recogida a NaCl 300mM.
6.3, 6.5, 7.3 y 7.3 no se observa ninguna banda, 8.4: cuarta fracción recogida a NaCl 300mM. 8.5: quinta
esto es debido a que no hay casi proteína en ellas. fracción recogida a NaCl 300mM.
En la fracción 5.4 se observa una banda a 37KDa,
Cuantificación del citocromo c
que se deberá a una proteína que a pH 8,6 (matriz)
tiene carga positiva, pero se une más débilmente - Método Bradford
a la matriz, pues al añadir una concentración
media de sal debido al apantallamiento de cargas
se libera de la matriz. En las fracciones 7.5, 7.6, 8.1,
8.2, 8.3 y 8.4 podemos observar el citocromo c
puro.

Podemos sacar como conclusión que el protocolo

seguido para obtener la proteína pura es bueno
porque al tener muchos pasos e ir aumentando
poco a poco la concentración de sal permite FIG 5. Ecuación de la recta de calibrado obtenida
obtener la proteína bastante pura. mediante el método Bradford.
(FIG 5) La recta de calibrado trazada a partir de las concentración de fracción que tiene la muestra
distintas absorbancias a distintas concentraciones medida). Se obtuvo 1.5mg de citocromo c puro.
de BSA permitió calcular la concentración de
- Espectrofotometría UV-visible
proteína que se había obtenido a partir de las
absorbancias obtenidas para nuestra proteína. Se llevó a cabo una segunda cuantificación de
citocromo c. Se midió la absorbancia de citocromo
c reducido a 550 nm. (TABLA 1) Con la ley de
Lambert-Beer: A=ε*c*l, siendo A la absorbancia, ε
= 28,92 Lmmol-1cm-1 (coeficiente de extinción
molar) y l=1 cm (longitud de la celda); se obtuvo la
concentración de proteína. A partir de esta se
obtuvo la cantidad teniendo en cuenta que el peso
molecular del citocromo c es 11748.72 Da y el
factor de dilución (multiplicar por 2 mL).
TABLA 1. Cuantificación del citocromo c mediante la
medida de la absorbancia a 550nm. La fracción 7.5 es
FIG 6. Cromatograma que muestra la cantidad de obtenida con 200mM de NaCl. Las fracciones 8.1, 8.2,
proteína obtenida por el método Bradford frente a las 8.3, 8.4 y 8.5 son las obtenidas con 300mM de NaCl.
fracciones. Las fracciones vienen dadas por números Fracción Abs550 [Cyt [Cyt c] Cantidad
enteros donde: 1=4.1, 2=4.3, 3=4.4, 4=5.1, 5=5.2, 6=5.4, c] (µg/mL) (µg)
7=5.5, 8=6.2, 9=6.3, 10=6.5, 11=7.1, 12=7.3, 13=7.4, (10-3
14=7.5, 16=7.6, 17=8.3, 18=8.3, 19=8.4 y 20=8.5. En la mM)
fracción el primer número indica la concentración de 7.5 0,097 3,35 39,40 78,8
NaCl (4=20mM, 5=50mM, 6=100mM, 7= 200mM y 8.1 0,3405 11,8 138,28 276,56
8=300mM) y el segundo número el número de fracción 8.2 0,379 13,1 153,91 307,82
recogida de esa concentración.
8.3 0,2325 8,03 94,45 188,9
En el cromatograma (FIG 6), no se representó ni 8.4 0,1145 3,96 46,513 93,026
pellet ni sobrenadante ni eluato ni la fracción 8.5 0,0685 2,37 27,821 55,64
obtenida a 10mM de NaCl, pues tienen mucha
En total se obtuvo según este método 1g de
cantidad de proteína. Esto se debe a que tienen
citocromo c puro. Nos fiamos más de esta
muchas proteínas inespecíficas de la bacteria,
cantidad pues la absorbancia a 550 nm es solo
como se ha podido observar en la electroforesis de
característica del citocromo c, por tanto, nos
acrilamida (FIG 3). Se observa también que en la
aseguramos de no estar midiendo impurezas de la
fracción 5.4 y 5.5 obtenemos cierta cantidad de
muestra. Además, es más preciso que el método
proteína. Esto corresponde a la banda que se
de Bradford porque se mide directamente. De
observa en la electroforesis de acrilamida (FIG 3)
todas formas, los resultados salen muy parecidos.
que corresponde a una proteína que tiene carga
positiva a pH=8,6 pero se une más débilmente a la Referencias
matriz que el citocromo c. Por último, se observa
1. Santucci, Roberto et al. “Cytochrome c: An
el pico alto de proteína en la fracción 8.3 y como
extreme multifunctional protein with a key role
crece y decrece la concentración de proteína, que
in cell fate.” International journal of biological
se corresponde al citocromo c. Por tanto, los
macromolecules vol. 136 (2019): 1237-1246
resultados concuerdan con los obtenidos en la
doi:10.1016/j.ijbiomac.2019.06.180
electroforesis de acrilamida (FIG 4).
2. Mavridou, Despoina A I et al. “Cytochrome c
Para el cálculo de cantidad de citocromo puro assembly.” IUBMB life vol. 65,3 (2013): 209-
obtenido se tuvo en cuenta desde la fracción 7.5 216. doi:10.1002/iub.1123
hasta la 8.4. El cálculo se hizo de la siguiente 3. Alvarez-Paggi, Damián et al. “Multifunctional
manera: a partir de la absorbancia se obtuvo la Cytochrome c: Learning New Tricks from an Old
concentración mediante la recta de calibrado de Dog.” Chemical reviews vol. 117,21 (2017):
Bradford y para obtener la cantidad de proteína se 13382-13460.
hizo el factor de dilución (que depende de la doi:10.1021/acs.chemrev.7b00257