Universidad Andrés Bello

Facultad de Ciencias Exactas

Departamento de Ciencias Químicas
Laboratorio de Química Analítica e Instrumental

Determinación de parámetros cromatográficos por

HPLC. Ecuación de Van Deemter.
Separación de Aminoácidos por Cromatografía en
Capa Fina.

Objetivos

 Calcular los valores de Rf de varias Integrantes: Carla Arenas

sustancias.
Fecha de entrega: 12/Junio/2019
 Deducir, mediante los valores de Rf, la
relación que existe entre la polaridad de
las sustancias que se analizan y la de los Docentes: Jorge Rivas Pérez
eluyentes utilizados. Mauricio Droguett Briones
 Determinar la composición cualitativa de una muestra problema.
 Resultados y Discusión

La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar

análisis cualitativos ya que pese a no ser una técnica potente no requiere de ningún tipo de
equipamiento. La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de
filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la disolución y
evaporando el disolvente. Luego el disolvente empleado como fase móvil se hace ascender
por capilaridad. La separación se realiza en función de la afinidad de los solutos con las dos
fases, las más solubles en agua se quedarán cerca del punto donde se aplicó la muestra, y
las menos solubles en agua y más solubles en el disolvente llegarán más lejos.
Como medida en cromatografía sobre papel se emplea el Rf (Retention factor), el cual se
define como el cociente de dividir el recorrido de la sustancia por el disolvente, esto es, la
distancia media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por la distancia
que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S).
𝑅𝑓 = 𝑋 /𝑆 (1)
La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar
que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor
velocidad serán los menos polares [1].
Se llevó a cabo una separación de aminoácidos utilizando la técnica de cromatografía de
capa fina (TLC) para la cual se utilizaron estándares de glicina, arginina, histidina, alanina,
fenilalanina y acido glutámico, además de los reactivos n-propanol:NH4OH 34% (7:3)
utilizado como fase móvil 1 y n-butanol: Ácido acético glacial: Agua (6:2:2) como fases
móviles 2. Finalmente fue utilizada ninhidrina como revelador de las placas
cromatográficas.
Tabla 1. Componentes de la siembra de la placa cromatográfica
Posición Posición Posición Posición Posición Posición
Placa Posición 1
2 3 4 5 6 7
Fenilalanin
1 Ac. Glu Glicina MP 11 Alanina Histidina Arginina
a
Fenilalanin
2 Ac. Glu Glicina MP 11 Alanina Histidina Arginina
a
Polar Polar Polar
Polaridad Apolar Apolar X Apolar
ionizable ionizable ionizable
Forma
Acepta y Acepta y Acepta y
puentes de No No X No
dona dona dona
H
En la presente práctica se utilizará un reactivo específico para nebulizar las placas, la
ninhidrina, que reacciona con aminoácidos dando un producto de color violeta.

Figura 1. Placa cromatográfica en capa fina con muestras de aminoácidos sembradas.

En la placa A se utilizó como fase móvil la mezcla de n-Propanol: NH4OH 34% (7:3) como
disolvente y en la placa de la parte B de la figura, se utilizó como fase móvil a n-Butanol:
Ácido acético glacial: Agua (6:2:2). El orden de sembrado de ambas placas fue el siguiente:
Fenilalanina, Ac. Glutámico, Glicina, Muestra problema, Alanina, Histidina, Arginina de
izquierda a derecha. Los aminoácidos se revelaron asperjando la placa cromatográfica con
una solución de ninhidrina y posterior se secaron las placas en una estufa a 105°C por 5
minutos.
Para poder discutir de forma correcta los resultados, primero se debe mencionar la
naturaleza química de los solutos utilizados en el práctico, los cuales fueron distintos
aminoácidos. En la figura 2. Se muestra una tabla resumen con los valores de los pKa
respectivos, ya que el pKa es una magnitud que cuantifica la tendencia que tienen las
moléculas a disociarse en solución acuosa.

La protonación o desprotonación de los grupos amino y carboxilo depende del pH. Para la
glicina, por ejemplo, el pKa para el grupo carboxilo y amino es respectivamente 2,34 y 9,6.
esto significa que a pH inferiores a 2,34 los grupos carboxilo y amino estarán protonados,
la carga neta de la molécula será positiva. A pH entre 2,3 y 9,6 el grupo carboxilo esta
desprotonado y el grupo amino protonado, siendo la carga neta del aminoácido cero. A pH
superiores a 9,6 ambos grupos estarán desprotonados, siendo la carga neta negativa [2].
Entonces estudiando las características de las manchas obtenidas luego del desarrollo de la
cromatografía podemos observar en la Figura 1A., que en la fase móvil 1 que corresponde a
n-Propanol: NH4OH 34% (7:3), las manchas son homogéneas y sin arrastre del marcador.
Las muestras 2 y 5 quedaron mas cerca del lugar de donde se aplicó la muestra lo que
quiere decir que son mas solubles en agua y menos solubles en el solvente, teniendo así
menos afinidad con la fase móvil y por esta razón no
eluyeron más. En cambio, la muestra 1 que Figura 2. Tabla resumen de
corresponde al aminoácido fenilalanina, fue la que Propiedades y convenciones
tuvo mas afinidad con el solvente ya que eluyó asociadas con los aminoácidos
mucho más en comparación a las otras muestras. estándar encontrados en proteínas.
Esto se debe a su característica hidrofóbica al tener Los aminoácidos utilizados en la
una cadena aromática y, por tanto, tiene una cromatografía como estándares se
solubilidad limitada en agua. encerraron en un rectángulo para
diferenciarlos de los demás.
El solvente arrastra con mayor facilidad a los
aminoácidos hidrofóbicos que se desplazarán más
lejos, mientras que los aminoácidos polares y los cargados permanecerán más cerca del
origen. Con este solvente y estas condiciones cromatográficas el orden de aparición de las
manchas correspondientes a los aminoácidos desde el frente hasta el origen es el siguiente:
Fenilalanina- Histidina- Alanina- Glicina- Ac. Glutámico- Arginina
En cambio, los aminoácidos polares y por lo tanto hidrófilos son más solubles en agua y
pueden estar cargados, por lo tanto, no se arrastran con la misma facilidad que los
hidrofóbicos y quedarán cerca del origen donde se sembró la muestra.
El mismo comportamiento se repite en la Figura 1B, observando el desplazamiento de cada
muestra, pero el orden de elución resultó ser el siguiente:
Fenilalanina – Alanina – Ac. Glutámico - Arginina - Histidina
Cabe mencionar que las distancias recorridas de las muestras fueron más cortas, esto se
puede deber a la composición de la fase móvil, la cual contenía un porcentaje de agua y por
lo tanto los aminoácidos hidrofóbicos tienen menos afinidad con dicha fase. Esto es muy
importante ya que uno de los factores más críticos en este tipo de cromatografías es la
elección de la fase móvil, que, básicamente, suele estar formada por una mezcla de un
solvente orgánico con agua y algunas sustancias adicionales tales cómo ácidos, bases,
agentes acomplejantes, etc., cuya finalidad es aumentar o disminuir la solubilidad de
algunos compuestos. La separación implica que los aminoácidos cuya cadena lateral (R)
tenga un carácter más apolar, tendrán tendencia a desplazarse con la fase móvil, mientras
que los aminoácidos que sean polares ya sean con carga o sin carga, serán retenidos por la
fase estacionaria. Ello es así, porque la fase móvil está formada por solventes que son más
apolares que el agua, que es el solvente de la fase estacionaria [2].

En este práctico se realizó una de las técnicas más sencillas para identificación de
aminoácidos que fue la combinación de la cromatografía en capa fina con la reacción de la
ninhidrina con la cual se pueden identificar los aminoácidos por la tinción color morado o
magenta que se presenta en ellos, excepto con la prolina la cual, da un tono amarillo al
reaccionar con la ninhidrina debido a que no produce amonio al reaccionar con ella, lo que
indica que los demás aminoácidos si presentan esta reacción.
Se presentaron coloraciones oscuras que oscilaban desde violetas hasta rojizas y de
coloración café a anaranjadas.  Al observar en el papel cromatográfico se visualizaron
manchas redondas amarillas a las que su coloración se debe a que estas no presentan
reacción ya que probablemente no tienen el grupo amino libre. O que probablemente la
muestra sea Prolina y no Glicina, pero esto no se pudo determinar.
Los métodos colorimétricos de determinación de aminoácidos se basan en la reacción
específica de éstos con determinados compuestos, dando derivados coloreados. La
formación de color se toma como resultado positivo e indica su presencia, mientras que el
no desarrollo de color es indicativo de que no está presente. La ninhidrina (hidrato de
tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar
a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina)
a hidrindantina (Figura 1). La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra
molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una
coloración azul-púrpura, con la excepción de la prolina que da una coloración amarillenta
[3].
(1) Ninhidrina reacciona con el Aminoácido
(2) Se forma un primer intermedio
(3) El Intermedio decarboxila y dehidrata para dar un ión dipolar
(4) El ión dipolar hidroliza dando la amina
(5) La amina condensa con otra molécula de ninhidrina para dar el Púrpura de Ruhemann

Cuando un aminoácido reacciona con un exceso de ninhidrina, se forman los siguientes

productos: por cada mol de aminoácido que reacciona con ninhidrina se forman como
intermediarios sendas moléculas de amoníaco, aldehído, CO2 e hidrindantína. El amoníaco
liberado reacciona subsiguientemente con un mol de ninhidrina y un mol de hídrindantina,
formando un producto de color violeta, conocido como púrpura de Ruhemann, que tiene un
máximo de absorbancia en 570 nm. Este complejo colorido (llamado púrpura de
Ruhemann) se estabiliza por resonancia, el cual es independiente de la coloración original
del aminoácido y/o proteína [4].
En un rango de pH de 4-8, todos los a-aminoácidos reaccionan, al calentar, con un poderoso
agente oxidante, la ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) dando un color púrpura, que
corresponde a la formación de ninhidrina-dicetohidrindeno, (púrpura de Ruhemann). Todas
las aminas primarias y amoniaco reaccionan también de forma similar, pero sin la
liberación de CO. Además de aminoácidos, otras estructuras más complejas con grupos
amino y acido carboxílico libres reaccionan dando coloración púrpura. El cambio de color
se debe al confinamiento de electrones en la formación del anión, es decir, que al acomodar
electrones en espacios más pequeños, hace que la luz absorbida se torne más azulada [5].
La sensibilidad de un sistema con ninhidrina depende de varios factores. Los aminoácidos
producen rendimientos de color ligeramente diferentes y estos valores pueden variar de una
preparación de reactivos a otra. La ninhidrina también es sensible a la luz, al oxígeno
atmosférico y a cambios de pH y temperatura. Cundo la ninhidrina empieza a oxidarse, su
color no se desarrolla bien a 570nm, mientras que la adsorción a 440nm se mantiene
bastante constante [6].
 Para el procedimiento se sembró la muestra problema (M.P) en una placa cromatográfica de
gel de sílice, junto con los estándares antes mencionados y se eluyeron utilizando las fases
móviles antes mencionadas, resultando lo siguiente:
Posición Posición Posició Posición Posición Posición Posición Posición
Placa
1 2 n3 4 4 5 6 7
Distancia
1 recorrida por el
soluto (cm) 6 3 3,5 4 1,5 4 4,5 1,5
Distancia
1 recorrida por el
solvente (cm) 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5
Distancia
2 recorrida por el
soluto (cm) 6 3 2,5 3,5 1.5 3,5 1,5 2
Distancia
2 recorrida por el
solvente(cm) 8 8 8 8 8 8 8 8

Rf placa 1 0,8 0,4 0,47 0,53 0,2 0,53 0,6 0,2

Rf placa 2 0,75 0,37 0,31 0,44 0,19 0,44 0,19 0,25

Tabla 2. Datos y cálculo de Rf para cada muestra en la placa cromatográfica con distintas
fases móviles

La relación de frentes Rf se calcula para cada componente midiendo las distancias desde el
centro de la mancha y desde la línea del frente del solvente hasta el punto donde se sembró
la muestra. El Rf depende de la sustancia y del sistema de solventes utilizado en la
cromatografía. No obstante, dos sustancias pueden tener el mismo Rf en un sistema de
solventes dado. Teóricamente, es posible encontrar un sistema de solventes que permita
separar dos sustancias que corran igual en otros sistemas. Entonces, el hecho de encontrar
dos manchas que posean el mismo Rf no nos permite afirmar que se trate de la misma
sustancia. Sin embargo, cuando sus Rf son diferentes, podemos afirmar que no son la
misma sustancia. Además del Rf debe tenerse en cuanta la forma de la mancha y el color
producido por el revelador y siempre que sea posible comparar con un estándar. Los Rf son
siempre menores que la unidad, un Rf muy cercano a cero nos está indicando que la
muestra es muy retenida por la fase estacionaria y por el contrario un Rf muy cercano a uno
se corresponde con una muestra no retenida por la fase estacionaria [7].
La retención se puede explicar en base a la competencia que se establece entre el soluto a
separar y la fase móvil por adsorberse a los centros activos polares de la fase estacionaria.
Así, las moléculas de soluto se encuentran adsorbidas en la fase estacionaria y a medida que
se produce la elución van siendo desplazadas por la fase móvil. La retención y la
selectividad en la separación dependen de los valores respectivos de las constantes de los
diferentes equilibrios químicos que tienen lugar, que están en función de:
‐ la polaridad del compuesto, determinada por el número y naturaleza de los grupos
funcionales presentes. Los solutos más polares quedarán más retenidos puesto que se
adsorben más firmemente a los centros activos de la fase estacionaria, mientras que los no
polares se eluirán con mayor facilidad.
‐ naturaleza del disolvente. Así, para un mismo compuesto, un aumento en la polaridad del
disolvente facilita su desplazamiento en la placa. [8].

El gel de sílice se utiliza para separar sustancias más polares (alcoholes, aminas, ácidos
carboxílicos). El proceso de adsorción se debe a interacciones intermoleculares de tipo
dipolo‐dipolo o enlaces de hidrógeno entre el soluto y el adsorbente. El adsorbente debe ser
inerte con las sustancias a analizar y no actuar como catalizador en reacciones de
descomposición. El adsorbente interacciona con las sustancias mediante interacción dipolo‐
dipolo o mediante enlace de hidrógeno si lo presentan. El orden de elución de un
compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase móvil o eluyente. Este puede
ser un disolvente único o dos miscibles de distinta polaridad [9]
Ahora teniendo toda la información necesaria se puede deducir que la muestra problema n°
11 contenía una mezcla de dos aminoácidos, los cuales probablemente sean Alanina +
Histidina según los Rf calculados presentes en la Tabla 2., pero evaluando los Rf de la
placa 2 se puede observar que la muestra problema contiene los mismos Rf que la muestra
5 y 6 que corresponden a Alanina + Arginina. Pero observando la Figura 1B, no coincide la
mancha circular de color café que corresponde a la muestra 6, si no que coincide la muestra
problema con la mancha de la muestra 7 que corresponde a Arginina. Entonces, se puede
deducir que este leve cambio en los valores de Rf de 0.2 (placa 1) y 0.19 (placa 2) se debe a
la fase móvil, ya que la segunda fase posee otro pH y otra composición ya que al tener un
porcentaje de agua la solubilidad cambia y por lo tanto, la afinidad de los solutos con dicha
fase también cambia, resultando una distancia distinta de separación en la placa con
respecto al punto de origen.
Como se menciona anteriormente, aunque dos manchas posean el mismo Rf no afirma que
se trate de la misma sustancia, pero observando las manchas resultantes de la Fig.1, se
puede visualizar el mismo patrón de desplazamiento, forma y color. Por lo que se piensa
que son una mezcla de ambos aminoácidos (Alanina + Arginina) al observar dichas
características en ambas placas cromatográficas con distintas fases móviles.

Conclusiones

Se lograron calcular los valores de Rf de cada muestra de aminoácidos sembradas en la

placa cromatográfica, para luego comparar dichos valores con los de la muestra
problema, que era la numero 11. Resultando valores de Rf distintos para ambas placas,
por lo que se confirma que existe relación entre la polaridad de las sustancias al eluirlas
en fases móviles de distinta composición y por ende, de distinta solubilidad.
Luego de obtener los valores y comparar visualmente las manchas obtenidas de cada
muestra en ambas placas, se concluye que la composición cualitativa de la muestra
problema corresponde a una mezcla de aminoácidos. Se determinó que dicha mezcla
correspondía a Alanina + Arginina.
 Bibliografía

[1] Heftmann, E. Chromatography: Fundamentals and Applications of chromatography and

related differential migration methods, Elsevier Science Publishers B.V,5a. edición, EUA,
1992, pp. 2-14.
[2] David L. Neison & Michael M. Cox (2009). LEHNINGER PRINCIPIES OF
BIOCHEMISTRY, (5ª ed.). New York, Estados Unidos: OMEGA. p 73.
[3] Luisot P (1982). “Bioquímica Estructural”, 2ª Ed. Editorial AC.
[4] Gennaro AR (DRT). Remington: Farmacia. Ed. Médica Panamericana; 2003. Pp 1410.
[5] Mathews, C, Van Holde, K.E., Ahern, K. 2002. Bioquimica. 3° Edición. Pearson
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[7] Harris, D.C. “Analisis Químico cuantitativo”, Iberoamericana, 1992, pp. 30-33
[8] Rubinson, J.; Rubinson,K.: Química Analítica Contemporánea, Prentice-Hall
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[9] Moore, S. (1968). Amino acid analysis: aqueous dimethyl sulfoxide as solvent for the
ninhydrin reaction. J. Biol. Chem. 243(23), 6281-6283.