Ana Laura Padilla Camacho

Laboratorio de biología molecular

Fecha de entrega: Lunes 08 de marzo, 2021

PRACTICA No. 4

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

INTRODUCCIÓN

"La reacción de PCR ha transformado la Biología Molecular al extender

tremendamente la capacidad de identificar, manipular y reproducir DNA.
Hace abundante lo que fuera escaso—el material genético requerido para
la experimentación.”
Paul Rabinow

El método llamado reacción en cadena de la polimerasa (“Polymerase Chain Reaction",

PCR) es una técnica para la síntesis "in vitro" de secuencias específicas de DNA. Se
utiliza para amplificar o copiar regiones del DNA, lo que permite obtener perfiles a partir
de cantidades mínimas de material genético.

El inventor de esta interesante técnica fue Kary Mullis por la cual obtuvo el Premio Nobel
de Química en 1993. Utilizó la PCR para la amplificación del gen de la -globina humana
(Mullis y cols., 1986; Mullis y Faloona., 1987) y el diagnóstico prenatal de la anemia
falciforme (Saiki y cols., 1985; Saiki y cols., 1986; Embury y cols., 1987), desde entonces
la PCR ha revolucionado todos los campos que estudian y manipula los ácidos nucleicos.

Mullis se basó en la replicación del DNA en los organismos eucariotas realizada por la
DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de
DNA en el sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región
de doble cadena. Para crear esta región doble cadena se usan los denominados
iniciadores (primers). Son una pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que
sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de DNA que se
desea amplificar.

Partiendo de este principio, la reacción en Cadena de la Polimerasa se basa en la

repetición de un ciclo formado por tres etapas:

 1ª Desnaturalización del DNA doble cadena

 2ª Hibridación de los iniciadores a la zona 3´específica de cada una de las hebras
 3ª Extensión de los iniciadores por actuación de la DNA polimerasa

En la primera etapa (desnaturalización) la doble hélice de DNA se separa en dos hebras.

Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97ºC). La
renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.

En el segundo paso (hibridación) los iniciadores se unen a las zonas 3´ complementarias

que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la disminución
de la temperatura (50-65ºC).
 Manual de prácticas de Biología Molecular (BIO-30621)

En la tercera etapa (elongación) se produce la síntesis de una cadena sencilla

(produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección
5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los deoxinucleótidos fosfato
presentes en el medio siguiendo la cadena molde. En la siguiente figura podemos
observar gráficamente los pasos que implican la técnica (Fig 1).

Figura 1. Pasos básicos de la PCR (de Andy Vierstracte 1999)

El proceso se lleva a cabo en un “Thermo Cycler” termociclador (fig.2). Es una maquina

que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta.

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 Manual de prácticas de Biología Molecular (BIO-30621)

Figura 2. Termociclador

Las características de los reactivos necesarios para la PCR son los siguientes:

 Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura

ambiente) y 1.5 mM MgCl2.
 MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor
para la función de la polimerasa-
 dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP. (La
concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño del fragmento que se desea
amplificar).
 Iniciadores “primers”: Son secuencias cortas de nucleótidos 20-24 nucleótidos de
longitud, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar (Se usa a
concentración de 1mM).
 DNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de
longitud.El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng.
 Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por reacción.
 Adyuvantes: Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la
PCR. Se usa DMSO, glicerol o BSA.

OBJETIVO: Que el estudiante se familiarice con una de las técnicas con mayor
aplicación en la Biología Molecular Moderna, ya que el propósito de esta técnica es hacer
muchas copias de un fragmento de DNA.

MATERIALES Y REACTIVOS:

-Amortiguador 10x -Reactivos para electroforesis (practica 3)

-MgCl2 20X
-dNTPs 10X
-DNA experimental
-Iniciadores 10X
-H2O desionizada
-Taq DNA polimerasa
-Termociclador “Thermo cycler”
-Microcentrífuga
-Micropipetas de 2, 20 y 200 ul
-Microtubos para “PCR”, estériles

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PROTOCOLO

1. Para una reacción de amplificación, en un tubo para PCR coloque los reactivos según
se indica en la siguiente tabla.

Condiciones típicas de una reacción de amplificación:

Volumen para una reacción de: 20 L*

Amortiguador 10x 2.0 L
MgCl2 20X (1.5 mM final) 0.74 l
dNTPs 10X (2mM c/u) 0.4 l
DNA experimental (50ng/L) 2.0 L
*Iniciadores 10X 2.0L
H2O desionizada c.b.p. 20 L
Taq DNA polimerasa (1 Unidad/reacción) 0.3 L

2. Coloque el tubo en un termociclador programado con las siguientes

Condiciones de amplificación:

1 ciclo 95ºC----- 3 min

30 ciclos 95ºC----- 1 min
50ºC------ 40 seg
72ºC------ 2 min
1 ciclo 72ºC------ 10 min

*Secuencias de los iniciadores empleados (estos varían de practica

en practica)

OPC-05 5’ GATGACCGCC 3’
OPI- 07 5’ CAGCGACAAG 3’

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 Manual de prácticas de Biología Molecular (BIO-30621)

RESULTADOS

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Estos tres pasos, desnaturalización (figura 1), emparejamiento (figura 2) y extensión

(figura 3) constituyen un ciclo de PCR.

Figura 1. Desnaturalización

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 Manual de prácticas de Biología Molecular (BIO-30621)

Figura 2. Emparejamiento

Figura 3. Extensión

En la figura 4 observamos como la polimerasa empieza a tomar los dNTPs en medio y los
va emparejando, dependiendo de la hebra que esté funcionando como molde (figura 5).
En este paso se generan los amplicones.

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 Manual de prácticas de Biología Molecular (BIO-30621)

Figura 4. Figura 5.

Este proceso se repite durante 20-40 ciclos amplificando la secuencia objeto

exponencialmente como se puede observar en las siguientes imágenes en las que se
compararon las cadenas de DNA en el ciclo 2 (figura 6) con las del ciclo 3 (figura 7), y las
del ciclo 4 (figura 8) con las del ciclo 5 (figura 9).

Figura 6. Ciclo 2 Figura 7. Ciclo 3

Figura 8. Ciclo 4 Figura 9. Ciclo 5

CONCLUSIÓN

La PCR es un proceso simple, exacto y altamente reproducible que proporciona la ventaja

de empezar con una pequeña cantidad de ADN y ser capaz de amplificarlo de forma que
se tenga suficiente para realizar experimentos.

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 Manual de prácticas de Biología Molecular (BIO-30621)

CUESTIONARIO

1.- ¿Cual es la finalidad de la técnica de PCR?

Amplificar masivamente una región blanco (target) presente en alguna muestra de DNA.
Esta amplificación resultará en millones de copias, las cuales son llamadas amplicones.

2.- ¿Para que se calienta a 94°C la mezcla de reacción?

Para desnaturalizar (romper los puentes de hidrógeno que unen la doble hélice y dejar
hebras simples) el DNA.

3.- ¿Porque en la practica la temperatura de alineamiento es de 50°C?

La muestra se enfría a una temperatura entre 40-65ºC que permita la hibridación de los 2
cebadores, cada uno a una hebra del ADN molde.

4.- ¿Por qué en la técnica se usan dos iniciadores?

Para delimitar la región de interés. Presentan una secuencia diferente que coincide con el
inicio y final del gen o secuencia a amplificar (ADN molde).

5.- ¿Por que al final hay un ciclo de 72°C por 10 min?

La polimerasa empieza a tomar los dNTPs en medio y los va emparejando dependiendo
de la hebra que esté funcionando como molde. En este paso se generan los amplicones.
La temperatura es elevada a 72ºC y la Taq polimerasa añade nucleótidos a los cebadores
para completar la síntesis de una nueva cadena complementaria.

6.- ¿Que característica observa en los iniciadores utilizados?

Se unen específicamente a sus secuencias complementarias de ADN.
Deben ser secuencias cortas de pb.

7.- ¿Mencione métodos basados en la técnica de PCR, reportados en la literatura?

PCR convencional y anidada, el ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) y el
polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción por PCR (RFLP) 

8.- ¿Qué aplicaciones podría tener esta técnica en un laboratorio de análisis

clínico?
La PCR se utiliza para amplificar genes asociados con trastornos genéticos a partir del
ADN de los pacientes (o de ADN fetal, en el caso de pruebas prenatales). La PCR
también puede utilizarse para detectar el ADN de una bacteria o un virus en el cuerpo de
un paciente: si el patógeno está presente, es posible amplificar regiones de su ADN de
una muestra de sangre o tejido.

9.- Investigue sobre los principios básicos (funcionamiento) del Nanodrop.

Este equipo permite realizar medidas de espectrofotometría en un amplio rango de
longitudes de onda (220-750 nm) con gran exactitud y reproducibilidad, sin necesidad de
emplear cubetas. Tan sólo requiere un volumen de muestra de 1-2 μl y gracias a su
pequeño tamaño y fácil manejo permite medir un gran número de muestras en poco
tiempo. Su funcionamiento se basa en el empleo de un sistema de retención de muestra
que aprovecha la tensión superficial para formar un puente de líquido entre el pedestal
inferior y un pedestal superior. En los espectrofotómetros NanoDrop el pedestal superior

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 Manual de prácticas de Biología Molecular (BIO-30621)

es el extremo de una fibra óptica conectada a una fuente de emisión de Xenon. Ambos
pedestales definen un preciso y estrecho paso óptico cuya longitud varía
automáticamente con la concentración de la muestra, permitiendo hacer mediciones en un
rango muy amplio de concentraciones sin hacer diluciones. Esta característica lo hace
idóneo para determinar la concentración y pureza de los ácidos nucleicos.

BIBLIOGRAFIA
1. Paul Rabinow , 1996, Making PCR, A Story of Biotechnology , University of Chicago
Press.
2. Sambrook, J., and Russell, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Third Edition.
Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001.
3. https://www.youtube.com/watch?v=mslMRgxbdOA

4. DNA Learning Center. (s. f.). Polymerase Chain Reaction (Interactive). Recuperado 8
de marzo de 2021, de https://dnalc.cshl.edu/resources/animations/pcr.htm

5.BIOTED. (s. f.). PCR Simulada. Recuperado 8 de marzo de 2021, de

https://www.bioted.es/protocolos/PCR-SIMULADA.pdf

6. Khan Academy. (s. f.). Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Recuperado 8 de

marzo de 2021, de https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-
expression-and-regulation/biotechnology/a/polymerase-chain-reaction-
pcr#:~:text=La%20PCR%20tiene%20muchas%20aplicaciones,el%20an
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7. IdiPAZ. (s. f.). NANODROP ND 1000. Recuperado 8 de marzo de 2021, de

https://www.idipaz.es/ficheros/files/Que%20es/2015/NANODROP(2).pdf

8. Ali, M., Bamorovat, M., Fasihi, M., Karimi, T., Sharifi, I., & Reza, M. (2017). Comparison
of Three PCR-based Methods for Simplicity and Cost Effectiveness Identification of
Cutaneous Leishmaniasis Due to Leishmania tropica. Irinian Journal of
Parasitology, 215-223. Recuperado de
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5527031/