Evaluación de Integridad y Productos de PCR a

partir de Extractos de DNA Eucariota y Procariota

mediante Electroforesis en Gel de Agarosa.

Moncada M1 Ortiz D2 & Ramírez J3

1. Estudiante curso Biología molecular, Facultad Ciencias de la Salud. Institución

Universitaria Colegio Mayor de Antioquia, Carrera 78 # 65 – 46,
smoncada@est.colmayor.edu.co Medellín – Colombia
2. Estudiante curso Biología molecular, Facultad Ciencias de la Salud. Institución
Universitaria Colegio Mayor de Antioquia, Carrera 78 # 65 – 46,
dortiz@est.colmayor.edu.co Medellín – Colombia
3. Estudiante curso Biología molecular, Facultad Ciencias de la Salud. Institución
Universitaria Colegio Mayor de Antioquia, Carrera 78 # 65 – 46,
joanar@est.colmayor.edu.co Medellín – Colombia

Resumen. Se pretende evaluar la integridad de las muestras de DNA previamente

extraída por el método Fenol-Cloroformo, y la presencia de los genes COX de
eucariotas y 16S procariota respectivamente. Para esto, se realizaron las respectivas
electroforesis en gel de agarosa tanto del extracto obtenido en cada caso como de los
productos de PCR obtenidos para cada tipo celular durante esta experimentación.

Palabras clave: DNA Eucariota, DNA Procariota, Electroforesis, PCR, COX, 16S DNA

1. INTRODUCCIÓN un tampón de PH aproximadamente en 8, de esta

Electroforesis de Ácidos Nucleicos.
Dado que muchas moléculas biológicas contienen
grupos ionizables y existen como cationes o aniones
(Ambas siendo especies cargadas). Se usa la
electroforesis para describir el fenómeno de migración
de partículas bajo la influencia de campos
electromagnéticos, por lo cual las especies cargadas se
van a en función de su carga cuando se aplica voltaje
a través de los electrodos[1].
La electroforesis en gel es una técnica utilizada para
separar moléculas o fragmentos de moléculas, en este
caso, de ácidos nucleicos, donde aquellos fragmentos
mas pequeños presentaran mayor migración en el gel
desde el cátodo hacia el ánodo. Se usan polímeros
como la poliacrilamida o la agarosa. Los geles se
ponen en una cubeta de electroforesis, sumergidos en
forma las moléculas de DNA o RNA sometidas a
electroforesis se desplazarán al polo positivo, ya que,
a PH superior a 5, tienen carga negativa, dada por los
grupos fosfato [1] [2].
En los geles de agarosa se les añade bromuro de etidio,
el cual es una sustancia que intercala en las bases del
DNA y es fluorescente cuando se examina con luz
UV. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una
lampara de luz UV, donde se verán las bandas
correspondientes a las muestras de DNA aplicado y
los marcadores de peso molecular [1][2][3]
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La PCR es una reacción enzimática in vitro que
amplifica millones de veces una secuencia especifica
de DNA durante varios ciclos repetidos en donde la

1
secuencia blanco es copiada fielmente. La reacción
aprovecha la capacidad natural de la polimerasa para
sintetizar DNA en las células [2]. Al usar DNA
genómico típicamente hablamos de PCR, pero si
usamos cDNA (DNA complementario) proveniente
del RNAm se le conoce como RT-PCR (Reverse
transcriptión-PCR) la cual es mediada por la enzima
de Transcriptasa reversa [3][4][5]
Para la reacción, es necesario el templado o el molde
(DNA o cDNA), la enzima, los primers, los dNTPs
(Adenina, Timina, Citocina y Guanina) los iones de
magnesio (MG+) un buffer y H2O. Estos compuestos
interactúan en las tres etapas principales de las que se
compone la PCR: Desnaturalización, hibridación y
extensión. [3][4] El equipo donde se da la reacción se
conoce como termociclador, donde se establecen los
límites de temperatura y tiempo necesario en cada
etapa de cada ciclo, que se repetirá un numero definido
de veces para garantizar la interacción adecuada entre
el DNA, los primers y la polimerasa, de modo que al
final de cada ciclo se duplique el número de copias de
DNA de interés. Posterior a esto, los amplicones se
someten a Electroforesis en gel para confirmar que
hubo amplificación exitosa [5].
En la PCR el templado son las cadenas de DNA que
se separan durante la etapa de desnaturalización y
sirven como molde para que las enzimas sinteticen las
nuevas secuencias que llevan la secuencia blanco de
interés [2]. Por su parte, la DNA polimerasa lleva la
catálisis de la reacción, sintetizando las nuevas
cadenas de DNA, siendo la polimerasa comercial más
usada la TAQ DNA Polimerasa, que proviene de la
bacteria termófila Thermus Aquaticus y se caracteriza
por su capacidad para sintetizar DNA a altas
temperaturas [4]. Para que la enzima funcione
eficientemente se necesita de los dNTPs, los primers,
los iones de MG+, el buffer y H20 [4][5].
Los primers son secuencias que flanquean y delimitan
la secuencia blanco que se desea amplificar y son
complementarios a esta. Estos primers oscilan entre
15-25 pares de bases, su contenido de C-G no debe ser
mayor al 55% en la secuencia. Se usa un primer
Forward -o sentido- y un primer Reverse -o
antisentido-, los cuales deben estar diseñados para que
hibriden con el templado y las cadenas de DNA
puedan ser extendidas por la TAQ Polimerasa en
dirección 5’-3’. Por su parte, los dNTPs son las bases
nitrogenadas con los cuales la TAQ Polimerasa
construye las nuevas cadenas de DNA. Se debe usar
en una concentración de 0.2-1.0 mM para que no
afecten el funcionamiento de la TAQ Polimerasa. El
buffer es la solución amortiguadora que se usa y
2
generalmente está compuesto de Tris-HCl (PH=8)
cuya concentración final debe ser 1X. El Magnesio
debe estar en concentraciones de o.5-2.5 mM para que
no afecte la función de la TAQ Polimerasa [5].
Etapas de la PCR [3][4][5].
Desnaturalización: Inicialmente las cadenas de DNA
son calentadas y separadas a 95 °C por 20-30
segundos, el tiempo depende de la secuencia del
templado, es decir, si la cantidad de C-G es alta (ya
que los enlaces de C-G contienen más puentes de
hidrógeno que los enlaces de A-T), se necesitará más
tiempo para romper. Al final de este paso, tendremos
las cadenas separadas que servirán de templado para
el siguiente paso.
Hibridación: En esta etapa, los primers se alinean en
el extremo 3´del templado previamente separado e
hibridan con su secuencia complementaria. Para que
se forme el complejo templado-primers, la TM
(Temperatura melting) sea la óptima y oscile entre 50-
60°C.
Extensión: En esta etapa, la TAQ Polimerasa actúa
sobre el complejo templado-primers y empieza su
función catalítica a gran velocidad. Agrega los dNTPs
para crear las cadenas complementarias del DNA. La
extensión de las cadenas es en el sentido 5´-3. La
temperatura óptima para este proceso es de 72°C. Al
final del ciclo se habrán formado los amplicones con
un tamaño dictado por el número total de pares de
bases (pb) que deberá ser conocido por el investigador.
[2]
2. METODOLOGÍA
Durante la práctica se realizaron varios procesos,
como la preparación del gel de electroforesis, la
verificación de la integridad del DNA genómico
previamente extraído de las muestras bovina
(Eucariota) y bacteriana (Procariota), y la preparación
de las muestras para la PCR
El gel para la electroforesis se preparó en una
concentración del 1%, por lo que se agregó en un
beaker 1 gr de agarosa, 100 ml de TBE (Tris Borato
EDTA), y fue llevado al microondas para disolver la
agarosa, después de haberse disuelto la agarosa por
completo, la disolución fue llevada a la cámara de
electroforesis, y se le adicionaron 10 ml de bromuro
de etidio. Cuando la disolución en la cámara se
gelificó, se procedió a medir la integridad del DNA
extraído anteriormente de las muestras eucariota y
procariota, tomando una alícuota de cada una de la
muestra (10ul) y mezclandola con buffer de carga,
luego cada muestra fue llevada a un pozo del gel. La
migración en la cámara de electroforesis se dio desde
Componente Volumen Concentración
el cátodo (polo negativo) hacia el ánodo (polo solución inicial tomado en Master Mix
positivo) (ver fig. 1).
Buffer 10X 10 uL 1X
Para la PCR se procesaron las muestras obteniendo 6
minipreps así: 1 control negativo de cada extracción MgCl2 50 mM 5 uL 2.5 mM
(procariota y eucariota), y 4 muestras para amplificar:
Primer F 10 uM 3 uL 0,3 uM
2 de DNA eucariota y 2 de témplate de DNA
procariota. Para llevar a cabo esto se prepararon para Primer R 10 uM 3 uL 0,3 uM
cada una de las muestras (procariota y eucariota) 92
ul de cada master mix esperando fuese suficiente para Taq Pol 5U/uL 4 uL 4 U (1U/25 uL)
preparar 4 reacciones de 25 ul cada una; con 3 ul de
H2O 65 uL -
primer forward y 3 ul de primer reverse (primers
flanqueantes de DNA16S para extracción procariota, dNTPs 10uM 2uL 0,2 uM
y flanqueantes de COX para extracción eucariota), 10
ul de buffer TBE, 5 ul de solución MgCl2 mm, 1 U de Tabla 1. Preparación de las soluciones Máster Mix.. Se
taq polimerasa, 2 ul de dNTPs y se aforó con preparó 92ul en total. Cada reacción incluyó 23 ul de master
mix y 2ul de muestra, que fueron mezclados directamente en
agua hasta obtener un volumen de 100 ul. Posterior a
vial para PCR.
esto se procedió a agregar en la miniprep las
.
muestras para la PCR con su respectivo máster mix,
adicionando 23 ul de master mix y 2 ul de DNA. En el
caso de los controles, no se adicionó DNA, en vez, se
completó el volumen con agua. A pesar de haber sido
medidas cantidades para obtener 4 minipreps de cada
master mix, a la hora de mezclar con el DNA no fue
suficiente, obteniendo en cada caso una repetición de
PCR con menor volumen de Master Mix (una de las
muestras 3 y la muestra T2P, ver fig. 2.) Las minipreps
fueron amplificadas por PCR directa, y evaluadas en
un nuevo gel (ver Fig 2). La tabla 1 relaciona las
concentraciones finales en cada master mix con
respecto a las soluciones a partir de las cuales se
obtuvo.
3. RESULTADOS Fig.2 Producto de PCR. Muestras Propias: T1P y T3P: PCR
Muestras procariota, gen DNA 16S. P: Control negativo Procariota.
Las figuras 1 y 2 corresponden a las electroforesis 3: PCR Muestras Eucariota (2 muestras), gen COX. É: Control
obtenidas para la evaluación de integridad (Fig 1) y negativo eucariota.
verificación de la amplificación por PCR (Fig 2).
Evaluación de productos de PCR.
Integridad de la extracción de DNA La figura 2 corresponde al gel de electroforesis que
La figura 1 evidencia presencia de ácidos nucleicos en evaluó la presencia de amplicones de los genes COX
las muestras evaluadas. La extracción de DNA a partir para los extractos eucariotas y 16S para los extractos
de células procariotas muestra una banda sólida procariotas. El primer carril de cada fila corresponde
correspondiente a DNA de elevado peso molecular, al marcador de peso molecular. Los carriles “T1P” y
proveniente del genoma bacteriano. Esta banda está “T2P” corresponden a PCRs propias del gen COX,
seguida de un smear o barrido, correspondiente a cuyo control negativo corresponde al carril “P”. Los
fragmentos más pequeños de ácidos nucleicos. carriles “3” corresponden a PCRs propias para el gen
En cuanto al extracto de DNA eucariota se encuentra 16S, cuyo control negativo corresponde al carril “É”.
un smear, pero no hay evidencia de gran cantidad de Se encuentran bandas tenues en los pozos T2P y uno
segmentos de elevado peso molecular, de modo que el de los carriles “3”, pero no hubo migración a través
extracto obtenido de las células eucariotas presenta del gel, quedando el producto de la PCR atrapado en
alto grado de degradación. los pozos. El pozo T1P y el segundo carril “3” no
evidencia presencia de DNA no en el pozo no en el
carril.
Los carriles no descritos corresponden a otras

3
experimentaciones que siguieron similar
procedimiento al descrito en esta experimentación,
evaluando los mismos genes y de los mismos genomas
extraídos. Algunos carriles muestran un fragmento de
DNA cuyo tamaño coincide en todos los carriles que
se presentó excepto en el segundo carril de la fila
superior, que muestra una banda de bajo peso
molecular.
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS
Integridad del DNA extraído.
Basados en el patrón de las bandas del gel de
electroforesis (fig 1.), es evidente la banda sólida
cercana al pozo (costado izquierdo) correspondiente al
DNA de alto peso molecular proveniente del genoma
procariota, seguido de un smear o barrido de DNA,
correspondiente a segmentos más pequeños como
RNA o productos de la degradación del genoma, dado
que los tratamientos con solventes pueden interferir en
la integridad de las extracciones fragmentando las
cadenas de ácidos nucleicos, por lo que parte del
extracto al ser degradado pudo migrar mayor distancia
en el gel. En cuanto a la muestra bovina se puede
evidenciar el mismo smear o barrido sobre todo el
carril, pero la banda sólida es ausente, lo que indica
que en la muestra no se encuentra DNA de alto peso
molecular y que el extracto de DNA eucariota fue
degradado durante el proceso de extracción o
manipulaciones posteriores. En cuanto a la muestra de
DNA eucariota (bovino), debe hacerse observar que
durante el proceso de extracción se presentó pérdida
de solución y mezcla indeseada de fases después de
una de las centrifugaciones, viéndose afectado
directamente el producto esperado de la extracción.
Evaluación de Productos de la PCR
Basados en los resultados observados de las PCR con
respecto a los controles negativos propios, se
encuentra que las soluciones precursoras del master
mix se encontraban libres de DNA, ya que los
controles negativos no mostraron amplificación,
mientras que al menos una de las muestras (3
muestras) propias presentaron leve amplificación
cuando se adicionó DNA.
Al analizar los resultados obtenidos entre
experimentaciones propias y otras experimentaciones
en simultáneo realizadas por otros operarios, se
encuentra que, indiferente del gen amplificado (COX
o 16S) el tamaño de el DNA obtenido es similar
excepto por el primer carril marcado como “-“. Es
interesante analizar ese carril dado que hubo
amplificación, pero la banda obtenida no muestra la
misma intensidad que otras bandas, y esto se presta
para varias inferencias y cuestionamientos:
4
*El DNA extraído del cual se obtuvo esa PCR
presentaba el gen de interés fragmentado, obteniendo
una banda de menor peso molecular.
*Si lo anterior es correcto, entonces uno de los primer
(o los dos) presentó afinidad parcial al interior del gen,
ya que pudo anidar en ausencia de un flanco (o los dos)
y amplificar exponencialmente hasta hacer visible la
banda. Pero si esto fuera cierto, la banda se hubiese
presentado al menos con una mínima intensidad en
otros carriles también
*Entre el final de la PCR y la siembra en el gel para
electroforesis, el producto de la PCR fue degradado
por factores externos como actividad nucleasa de
origen biológico o cualquier otro tipo de
contaminación (la punta para micropipetear, por
ejemplo).
5. CONCLUSIONES
● El conocimiento de la fundamentación
teórica de cada procedimiento realizado en el
laboratorio es determinante para mejorar los
resultados de una metodología propuesta, o adaptar
dicha metodología a los recursos a los cuales se tiene
acceso.
● Se concluye la importancia de la
electroforesis como una técnica que permite analizar
cualitativa y cuantitativamente, ya que permite
evidenciar la presencia de una secuencia además de
estimar el tamaño de un determinado material
genético.
● El tamaño de los fragmentos obtenidos de la
PCR resultó ser muy similar para todas las muestras
que presentaron amplificación, indiferente de su
origen eucariota o procariota. Dado que
6. REFERENCIAS
1.Padilla, C. Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de
agarosa. Aislamiento y caracterización electroforética de
DNA plasmídico. Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular - Campus Universitario de Rabanales. España.
Recuperado de: https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS%20NUCL
EICOS%20GELES%20AGAROSA.pdf
2. Watson, J. D. (2014). Molecular Biology of the Gene. 7ª
ed. PEARSON.
3. Karp, G. (2009) Biología celular y molecular. Conceptos
y experimentos. 5a edición. México D.F. Mc GRAW-HILL
INTERAMERICANA EDITORES.
4. Sánchez, A. M. B., (2014). PCR y PCR-Múltiple:
parámetros críticos y protocolo de estandarización.
Avances en Biomedicina, 3(1), 25-33. Recuperado de:
https://dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/4796903.pdf

5. Tamay de Dios L ( 2013) Fundamentos de la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.
Recuperado de:
https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-
2013/ir132d.pdf