Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y electroforesis de

productos de PCR

Introducción

La amplificación (aumento del número de copias) de un fragmento determinado de ADN

puede llevarse a cabo mediante métodos como la inserción de la secuencia en una célula
bacteriana, que al multiplicarse repetidamente dará como resultado millones de copias de
ese fragmento. Kary Mullis desarrolló en 1983 una técnica mucho más eficiente
denominada PCR (Polymerase Chain Reaction), capaz de generar en pocas horas billones
de copias de una secuencia a partir de una pequeña cantidad de ADN.

La PCR es una reacción bioquímica in vitro en la que un par de primers (también conocidos
como iniciadores o cebadores) flanqueantes a la región a amplificar, se unen a las cadenas
sencillas del ADN para elongar, con la ayuda de la Taq polimerasa, el resto de la secuencia
objetivo. Cada ciclo de la reacción involucra tres pasos principales: denaturación de dobles
cadenas de ADN, anillaje de primers y elongación. En el primer paso, la temperatura es
elevada a aproximadamente 96°C para permitir la separación completa de la doble hebra de
ADN. En el segundo paso, se disminuye la temperatura a 60°C donde las hebras de ADN se
asocian con los primers específicos de la región de interés. Cada primer anilla específica y
separadamente en el extremo 3’ de la secuencia deseada, un solo primer anilla por cadena
sencilla de ADN. Durante el tercer paso, la Taq polimerasa (extraída de la bacteria
termofílica Thermus aquaticus) se vale del primer para sintetizar la cadena complementaria
a la secuencia deseada, dando como resultado dos moléculas que contienen una copia del
fragmento de interés y una secuencia flanqueante a esta región.

A medida que el número de ciclos aumenta, la cantidad de copias que contienen únicamente
el fragmento esperado se eleva exponencialmente permitiendo obtener un alto número de
copias de la secuencia deseada a partir de una mezcla de ADNs.

Esta técnica se ha empleado en métodos que buscan identificar la presencia de una

secuencia específica, como una mutación determinada en el genoma de un paciente o la
 presencia de un agente patógeno en una muestra de cualquier origen, esto gracias a la
capacidad de la PCR para aislar una secuencia de una mezcla compleja de moléculas.

En esta práctica, trabajaremos con el ADN extraído previamente y realizaremos la

amplificación de la región terminal del gen que codifica para del gen ERG11 de Candida
albicans, un patógeno oportunista que es el agente causal de la Candidiasis. Este gen es de
importancia médica y algunas mutaciones puntuales en esta región han sido asociadas a la
resistencia a azoles, que son los antifúngicos de primera elección, para el tratamiento de la
enfermedad.

Objetivos.

1. Comprender el fundamento de la Reacción en Cadena de la Polimerasa.

2. Amplificar un fragmento de ADN del gen ERG11 de Candida albicans y visualizar el
producto de amplificación en un gel de agarosa.
3. Entender y adquirir habilidad en la programación y uso del termociclador.

Materiales y Métodos.
1. Realizar la mezcla “Master Mix” de los reactivos en un tubo eppendorf (como lo indica la
Tabla 1).

Reactivo Concentración Concentración Volumen por Master mix x4

inicial final reacción (µl) (µl)

Agua ultrapura - - 16,875 67,5

Buffer de 10X 1X 2,5 10

reacción

MgCl 2 25 mM 2 mM 2 8

dNTPs 10 mM 0.2 mM 0,5 2

Primer Forwad 10 µM 0.2 µM 0,5 2

Primer 10 µM 0.2 µM 0,5 2

Reverse

Taq 2.5 U / 100 uL 0.375 U / 15 uL 0,125 0,5

polimerasa

Volumen final - - 23 92
 2. Mezclar la reacción de PCR por pipeteo, muy suavemente y sin generar burbujas

3. Agregar 23µl de la mezcla “Master Mix” a 3 tubos eppendorf. Agregar a 2 de los tubos, 2µl
del ADN extraído de Candida albicans.

4. Realizar un control negativo de la reacción, agregando 2μl de agua ultrapura al tubo

restante (en lugar de ADN).

5. Llevar al termociclador para correr la reacción bajo el perfil térmico elegido.

 Ciclo elegido:

N. Ciclos Temperatura Tiempo

1X 94°C 3 min

94°C 30 segundos
35X
50°C 30 segundos

72°C 30 segundos

1X 72°C 10min

1X 4°C ∞

Montaje de electroforesis

1.1. Ajuste el polimerizador de tal forma que la cama quede perpendicular al marco. 

1.2. Ponga el “ojo” en el centro de la cama y calibre el montaje con los tornillos para que no
haya interferencia por inclinación del gel.   

1.3. Ubique los peines en el lado opuesto a la T del marco. 

 
1.4. Pese 0.75g de agarosa (1.5%) y mézclelos con 50mL de TBE 1X. Caliente en
microondas hasta que la mezcla sea homogénea y transparente 

1.5. Agregue inmediatamente 0,5μl de GelRed. Permitir que se enfríe un poco la agarosa

hasta que sea tolerable al tacto 

1.6. Mezcle y sirva en la cama de electroforesis.  

1.7. Espere 30 minutos para que el gel polimerice.   

 
Siembra y corrido de la muestra   
 2.1. Pase la cama con el gel a la cámara de electroforesis horizontal y llénela hasta el
máximo con buffer de corrido TBE 1x. Asegúrese que los pozos queden cubiertos.  

2.2. Tome 1μl de loading buffer y póngalos en el papel “parafilm” o aluminio.   

2.3. Tome 4μl del producto de PCR y póngalo sobre el loading buffer que está en el
“parafilm” o papel aluminio.    

2.4. Ponga la pipeta en 5μl y mezcle para sembrar en cada pozo. 

2.5. Siembre el marcador de peso 

2.6. Cierre la cámara y ponga a correr a 100V durante 50 minutos.   

 
Visualización en UV   

3.1. Tome el gel, abra la puerta del transiluminador (ChemiDoc™ MP System, Bio-Rad) y
póngalo en la bandeja sin la cama para evitar que esta se raye.   

3.2. Visualice en el documentador bajo luz UV, tome la fotografía, envíela a su correo y
analice sus resultados.