CUANTIFICACIN DE ADN

HUMANO

Objetivos
Cuantificar el ADN de una muestra problema, por el mtodo
espectrofotomtrico, utilizando un biofotmetro.
Determinar la pureza del ADN extrado de la prctica anterior.

Antecedentes acadmicos
Caractersticas fisicoqumicas del ADN.

Funcionamiento del equipo BioPhotometer.

Introduccin
La concentracin del ADN se puede estimar utilizando un espectrofotmetro
de luz ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 260nm, debido a que las
bases pricas y pirimdicas del ADN tienen propiedad de absorber la luz UV a
esta longitud de onda. Es importante tener en cuenta que, dado el
emparejamiento de sus bases (puentes de hidrgeno), el ADN bicatenario
absorbe menos que el monocatenario. Es as como una unidad (u) de
densidad ptica (DO) a 260nm equivale a 50g/mL de ADN de doble cadena,
a 40g/mL de ARN y ADN de cadena simple.

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Bioqumica Celular y de los Tejidos I

La concentracin del DNA en una muestra puede ser calculada por la

siguiente ecuacin:
Concentracin de DNA (g /mL) = absorbancia de la muestra a 260nm x
factor de dilucin x 50g/mL
El anlisis espectrofomtrico tambin nos permite valorar el grado de pureza
de los cidos nucleicos, empleando un anlisis de la absorcin a otras
longitudes de onda en las cuales se sabe que las protenas y polisacridos
tienen su mxima absorcin. Las protenas absorben fuertemente en 280nm
y los polisacridos se identifican por su mxima absorbancia a 230nm. Por lo
tanto la proporcin de mediciones de estas tres longitudes de onda 230, 260
y 280 indica el grado de pureza de la muestra del cido nucleico. En muchos
casos, la pureza y la concentracin son ms difciles de llevar a cabo por la
presencia de reactivos utilizados en el proceso de extraccin.
La determinacin de la pureza del ADN se establece mediante la relacin de
las lecturas de las absorbancias a 260 y 280nm.
Pureza ADN = absorbancia 260nm / absorbancia 280nm
Se consideran cifras ptimas de pureza aquellas que presentan un cociente
de 1.7 a 2, cocientes menores indican la presencia de protenas en el medio y
cocientes mayores indican la presencia de otras sustancias contaminantes
como etanol.

Efecto hipercrmico
Cuando una solucin de ADN de doble hebra se calienta por encima de una
temperatura determinada, su estructura nativa colapsa y sus dos hebras
complementarias se separan y asumen conformaciones al azar. Este proceso
de desnaturalizacin est acompaado de un cambio cualitativo de las
propiedades fsicas del ADN, por ejemplo, la alta viscosidad caracterstica del
ADN nativo en solucin, debida a la resistencia a la deformacin de sus
molculas dobles rgidas y con forma de rodillo, disminuye de manera
drstica cuando el ADN se descompone en las hebras simples de
conformacin flexible. De modo similar, la absorbancia del ADN a la luz
ultravioleta que se debe casi por completo a sus bases aromticas, aumenta
en un 40% al desnaturalizarse como consecuencia de la desnaturalizacin de

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 Cuantificacin de ADN humano

las interacciones electrnicas entre las bases vecinas. El aumento de la

absorbancia se conoce como efecto hipercrmico.
Al monitoriar los cambios en la absorbancia a 260nm de una muestra de
ADN, se observa que a medida que la temperatura aumenta se revela un
incremento en la absorbancia, esto tiene lugar en un rango estrecho de
temperatura, lo que indica la desnaturalizacin del ADN como un fenmeno
cooperativo en el que el colapso de una parte de la estructura desestabiliza al
resto.
En la forma anloga a la fusin de un
slido, hace referencia a la curva de
fusin (Fig. 1) y la temperatura de su
punto medio se define como su
temperatura de fusin Tm.
La estabilidad del ADN y por
consiguiente su Tm, dependen de varios
factores por ejemplo, la naturaleza del
solvente, las identidades y las
concentraciones de los iones en solucin
y el pH.

Fig.1 Ejemplo de una curva de

fusin

Material y Equipo
Equipo BioPhotometer
Celdas
Micropipetas p200, p1000 y p5000 L
Puntas nuevas para micropipetas
Agua destilada
Guantes de ltex
Gradilla
Vasos de precipitados de 50 mL

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Bioqumica Celular y de los Tejidos I

Material Biolgico
-Muestras de ADN humano

Mtodo
1. Mezclar la muestra de ADN (Fig. 2) y realizar una dilucin 1:20 de la
muestra en un volumen de 200L (Fig. 3) (si la lectura es muy alta diluir
1:40 utilizando agua destilada).

Fig. 2 Mezcla de la muestra de Fig. 3 Preparacin de la

ADN dilucin

2. Encender el equipo (Fig. 4) del botn que se

encuentra en la parte posterior del equipo y
seleccionar la funcin No. 7 que permite medir la
concentracin de ADN y de su pureza.

Fig. 4 Equipo biofotmetro

3. Calibrar el Biofotmetro ajustando el equipo a cero de absorbancia,

utilizando 100L de agua destilada que se colocan en una celda del
Biofotmetro. Colocar la celda en el portacelda, presionar el botn blank
y observar en la pantalla los ceros (Fig. 5).

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 Cuantificacin de ADN humano

Fig. 5 Ajuste del equipo a cero de absorbancia

4. Mezclar la muestra y colocar 100L en la celda (Fig. 6), insertar la celda en

el portacelda y oprimir el botn Sample. Anotar los datos que se
obtienen en la pantalla: concentracin, absorbancia a 230, 260, 280 y el
cociente de la relacin de las dos absorbancias (260/230, 260/280).

Fig. 6 Pasos a seguir para medir la concentracin de una muestra.

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Bioqumica Celular y de los Tejidos I

Resultados
- Registrar las lecturas de las absorbancias de las muestras y de las
relaciones 260/230 y 260/280.
- Determinar la concentracin utilizando la frmula escrita en la teora y
teniendo en cuenta la dilucin del ADN. Por ejemplo, para un ADN diluido
1/100 en un volumen final de 1mL y una lectura de 0.050 a 260nm se
tienen que 0.050(DO) x 50g/mL x100 (factor de dilucin) = 250 g/mL =
0.25 g/L = 250ng/L.
- Verificar la pureza del ADN obtenido comparando los cocientes obtenidos
de absorbancias a 260/230 y 260/280 con los tericos.

Cuestionario
1. Por qu otro mtodo se puede cuantificar la concentracin del ADN?
2. Cul es la importancia de obtener ADN con cociente 260/230 y
260/280 entre 1.7 y 2?
3. Por qu se recomienda medir la absorbancia a 280 nm?

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 Cuantificacin de ADN humano

Referencias
1. Concepcin J, Puerta B. Prcticas de Biologa Molecular. Bogot:
Editorial Pontificia Universidad Javeriana; 2005.
2. Escrig A. Manual de Neurogentica. Madrid: Ediciones Daz de Santos
S.A.; 2003.
3. Fonseca D, Mateus H. Prcticas de Laboratorio de Biologa Molecular:
su aplicacin en gentica bsica. Bogot: Universidad del Rosario; 2010.
4. Gonzlez-Morn MG. Tcnicas de Laboratorio en biologa celular y
molecular. Mxico: Facultad de ciencias, UNAM, AGT Editor S.A.; 2008.
5. Karp G. Biologa celular y molecular. Conceptos y experimentos. 6 ed.
Mxico: Mc Graw-Hill Interamericana; 2011.
6. Mendoza-Rincn JF, Garca del Valle A, Aguilar-Santelises L. Protocolos
en Biologa molecular. Mxico: FES Zaragoza, UNAM; 2004.

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