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2. Extracción de la banda amplificada.

Una vez obtenido el amplificado, cortar banda con bisturí, fue pesado un eppendorf 1,5ml.

Para obtener el amplificado sin el gel se utilizó el kit “EZNA Gel Extraction Kit”

-Proveedor: Omega bio-tek

-Modelo: DS2500-01

3. Clonamiento del producto de PCR.

Una vez obtenido el purificado, se procede a clonarlo utilizando el kit “pGEM®-T easy

Vector Systems”

-Proveedor: Promega

-Número de catálogo: A1360.

Este kit permite la obtención de clones por medio del vector pGEM-T Easy Vector, que

consta de los siguientes pasos:

A) Ligación: En esta fase del proceso se busca que nuestro fragmento de estudio se

incorpore dentro del plásmido, para controlar esta fase es necesario utilizar un

control de ligación y un background de la siguiente manera:

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Reacción de Ligación de producto de PCR en vector pGEMt easy

Componentes de Control positivo de Control Positivo Control de fondo


reacción reacción
2X Buffer ligación, 5µL 5µL 5µL
T4 DNA
pGEM-T Easy 1µL 1µL 1µL
Vector (50ng)
Producto PCR 2µL 2µL --
Ligasa T4 DNA 1µL 1µL 1µL
Agua libre de 1µL 2µL 3µL
nucleasas

Volumen final 10µL

Terminado el protocolo de reacción, mantener muestra a -4°C durante 16 horas.

B) Transformación: Esta fase es crítica debido al uso de células competentes,

Echerichia coli JM109, bacteria cuya pared celular y membrada se encuentra con

poros, para facilitar la entrada del plásmido hacia la bacteria.

C) Cultivo de colonias: El medio cultivo utilizado es agar LB más ampicilina, para el

desarrollo de la bacteria JM109 durante 18 horas a 37°C.

Para controlar esta fase se agregan dos controles (placa 5-6) y se siembran de la

siguiente las placas:

Placas Contenido y volumen a sembrar.

1 50uL de Célula competente + Muestra (PV o VHA)


2 100uL de Célula competente + Muestra (PV o VHA)
3 100uL de Célula competente + Control ligación (inserto control)
4 100uL de Célula competente + Control Background
5 100uL de Célula competente + Control positivo (plásmido)
6 100uL de Solo células competentes

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Preparación de medios cultivo para clonación

Medio SOC

Reactivo Volumen
Lacto tryptone 2 gr
Lacto 0,5gr
NaCl 1M 1 mL
KCl 1M 0,25mL
Mg2+ 2M 1mL
Glucosa 2M 1mL

Para 100 ml de medio

Medio LB

Para un litro de medio de cultivo (1000mL)

Reactivo Volumen
Lacto tryptone 10 gr
Bacto yeast extract 5gr
NaCl 5gr
Medio agar a agar 15gr

Ajustar el pH a 7,0 con NaOH y una vez tibio el medio agregar 1mL de ampicilina

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4. Screening de células transformadas.

Se seleccionaron 10 colonias de la placa uno, se tocó la colonia con un asa y, se depositó

en 20 uL agua destilada, para someterla a calor a 95°C por 10 minutos. Después se realizó

PCR de colonia, según corresponda (Virus Hepatitis A/ Pan-enterovirus). Una vez

obtenido el producto PCR Convencional en termociclador 2720 de Applied Biosystems,

se corrieron las muestras en un gel agarosa. Las muestras positivas con el fragmento de

estudio se tomaron con un asa estéril y se inocularon en medio LB caldo con ampicilina y

se incubó durante 12 horas en agitación constante a 37°C.

5. Extracción de ADN plasmidial (miniprep).

Al día siguiente se utilizó el kit “E.Z.N.A plasmid DNA minikit II”, para obtener el

plásmido purificado de acuerdo al protocolo descrito por el fabricante.

E.Z.N.A plasmid DNA minikit II, Omega.

REF: D6945-01

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6. Digestión enzimática con enzima EcoRI

Para confirmar la presencia del inserto en el plásmido purificado se utilizó protocolo de

digestión con la enzima EcoRI Esta enzima nos permite cortar el plásmido justo en la zona

de inserción de nuestro fragmento de DNA, resultando así un fragmento de 3015pb

correspondiente al plásmido lineal, y además un fragmento de un peso molecular

correspondientes a los insertos.

- EcoRI Promega

- Número de catálogo: R008A

Tabla: Protocolo de digestión enzimática con EcoRI

Reactivo Volumen
Agua libre de nucleasas 16.3 uL
Buffer enzima restricción 10x 2 uL
Acetato BSA 0,2 uL
Enzima restricción Eco RΙ 0,5 uL
ADN( muestra) 1 uL

Volumen total = 20 uL

Se Incuba a 37°C por 1 Hora.

Se observa en un gel de agarosa al 1%.