FACULTAD DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

CURSO DE BIOQUÍMICA
(CLAVE 1508)
Licenciaturas de QFB y QA

Prof. Laura Carmona Salazar

Este material es exclusivamente para uso educativo y no de lucro

CINÉTICA ENZIMÁTICA

Modelo Michaelis-Menten
Mecanismos de inhibición
Regulación enzimática
REACCIÓN QUÍMICA
EL EQUILIBRIO DEPENDE DEL G
S P
Y LA VELOCIDAD DE LA ENERGÍA LIBRE
DE ACTIVACIÓN

EN UNA REACCIÓN CATALIZADA POR UN ENZIMA,

ÉSTA MODIFICA LA VELOCIDAD
CINÉTICA ENZIMÁTICA.- Disciplina que se encarga de
estudiar el mecanismo de una reacción catalizada
enzimáticamente.

OBJETIVO.- Determinar la velocidad de la reacción y

evaluar como se ve modificada ésta en
respuesta a cambios en los parámetros
experimentales
VELOCIDAD= Cantidad de sustrato desaparecido o
producto formado por la enzima por unidad de tiempo

Por tanto sus unidades son

cantidad de compuesto sobre unidad de tiempo:
moles
mmoles hora
nmoles
gramos minuto
miligramos
mgramos segundo
S P E+S ES E+P

ESTADO
PRE-ESTACIONARIO
1) ESTADO PRE-ESTACIONARIO = HAY EXCESO DE SUSTRATO Y AUMENTA
LA CONCENTRACIÓN DE ES
(ES RÁPIDO, DURA MICROSEGUNDOS)

2) ESTADO ESTACIONARIO = LA CONCENTRACIÓN ENZIMA-SUSTRATO

PERMANECE APROX. CONSTANTE
VELOCIDAD DE LA REACCIÓN

Concentración del sustrato

MODELO DE Leonor MICHAELIS -Maud MENTEN

k1 k2
E + S [ES] E + P 1
K-1

Relaciona velocidad de la reacción con [S] y [E]

Vo = k2 [ES] 2

Queremos saber cuánto ES se forma

Velocidad de formación de ES = k1 [E][S] 3

Velocidad de desaparición de ES = (k-1 + k2) [ES] 4

 En el estado estacionario, las velocidades de formación y desaparición
de [ES] son iguales, donde [ES] es constante, mientras que [Reactivos] y
[Productos] cambian

k1 [E] [S] = (k2 + k3) [ES] 5

[ES] = [E] [S] 6

(k2 + k3)/k1
Definimos una nueva constante: (para el denominador)

Km = constante de Michaelis
Km = k2 + k3 7 Km es independiente de la concentración del enzima
k1 y la de sustrato

Sustituimos en 6

[ES] = [E] [S] 8

Km
Asumiendo que ponemos un gran exceso de S con respecto a E, entonces [S]
va a ser teóricamente la inicial o sea el total de [S].
Con respecto a [E], ésta se va a estar combinando con él. Va haber también E libre.

[E] = [Etotal] - [ES] 9

Sustituyendo para [E] en 8

[ES] = ([Etotal] - [ES] ) [S]

10
Km

[ES] = [Et] [S] / Km

11
1 + [S] / Km

[ES] = [Et] [S]______ 12 Vo = k2 [ES]

[S] + Km
 V = k2 [Et] [S]__
13
[S] + Km

Ya que la velocidad máxima (Vmax) se alcanza cuando los sitios de la enzima

están saturados con sustratos, o sea cuando [S] >> Km, y entonces

[S]____ Se aproxima a 1
[S] + Km

entonces
Km = [S] a la cual la velocidad de la reacción tiene
Vmax = k2 [Et] 14
la mitad de su valor máximo

sustituyendo 14 en 13

V = Vmax ___[S] ___

[S] + Km
VELOCIDAD DE LA REACCIÓN

V = Vmax ___[S] ___

[S] + Km

Concentración del sustrato

GRÁFICA DE DOBLES RECÍPROCOS O DE LINEWEAVER-BURK
(TRANSFORMACIÓN DE LA ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN)

Vo = Vmax ___[S] ___ INVERSO 1 = Km + [S]

[S] + Km Vo Vmax [S]

Pendiente
1 = Km + [S]
Vo Vmax [S] Vmax [S]

1 = Km + 1
Vo Vmax [S] Vmax
Ecuación de Lineweaver-Burk
GRÁFICA DE EADIE-HOFSTEE
(TRANSFORMACIÓN DE LA ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN)

1 1 Km 1 
     vV max
 v V max V max S  
Si multiplicamos ambos miembros de la ecuación de inversos por v * Vmax
obtenemos,
Vmax = v + (Km v)/[S]
y reordenando
v
v  V max  Km
S 
y = b - m x

Esta representación se conoce como representación de Eadie-

Hofstee
 v Vmax

m = -Km

a
Vmax/Km

v/[S]
La representación de v frente a v/[S] nos da una recta de:
- pendiente = -Km
- corte en el eje v = Vmax
- corte en el eje v/[S] = Vmax/Km
SIGNIFICADO DE LA KM Y VMAX

La KM es un valor de concentración que resulta muy útil

para asegurar una catálisis efectiva.
Puede ser considerada como una medida de la afinidad de
un enzima por su sustrato

La VMAX es la máxima velocidad que se alcanza cuando

en el medio de reacción todos los enzimas tienen los sitios
activos ocupados

Kcat
Es una constante de velocidad que describe la velocidad
limitante de cualquier reacción en condiciones de
saturación
Kcat = NÚMERO DE RECAMBIO

Equivale a expresar el número de moléculas de sustrato

convertidas en producto por unidad de tiempo en una sola
molécula de enzima cuando esta se encuentra saturada

Kcat= Vmax / [E]t= Número de recambio en el sitio catalítico por seg

Kcat/ Km= Medida de la eficiencia catalítica si [S]<<<Km

En esta condición, la velocidad de la enzima está sólo
controlada por la difusión de S al sitio catalítico
Algunos enzimas tienen una kcat/Km en el intervalo 108-109 M-1seg-1, es
decir transforman al sustrato apenas llega
 Actividad específica
La actividad de una enzima se puede expresar en términos
de la velocidad por la cantidad de la enzima

La actividad específica es la velocidad de una enzima

expresada en términos de la cantidad de enzima que
produce esa velocidad
Unidades de Unidades de
velocidad cantidad de enzima

Actividad específica = mmoles / min / mg

mmoles / min / mg
nmoles / min / mg
mg (de producto) / min / mg
mg (de producto) / min / mg
LOS ENZIMAS PUEDEN SER INHIBIDOS

Los inhibidores enzimáticos son agentes moleculares que

Interfieren en la catálisis, haciendo más lentas o
deteniendo las reacciones.

Pueden ser reversibles o irreversibles

INHIBIDORES COMPETITIVOS

INHIBIDORES ACOMPETITIVOS

INHIBIDORES MIXTOS
 Ki o constante de inhibición
La Ki es la constante de equilibrio de fijación de un inhibidor a una enzima
Es otra de las constantes cinéticas
Su cálculo depende del tipo de inhibición de que se trate y por tanto del
inhibidor y de la enzima

1/V

1/S
INHIBICIÓN ACOMPETITIVA

INHIBICIÓN COMPETITIVA

INHIBICIÓN MIXTA
 REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Mecanismos fisiológicos para aumentar o disminuir la actividad enzimática

* ALOSTERISMO

MODIFICACIONES
SOBRE LA ENZIMA
EXISTENTE a) FOSFORILACIÓN
*REGULACIÓN COVALENTE
b) PROTEÓLISIS

ISOENZIMAS

a) EXPRESIÓN DEL GENE

MODIFICACIONES
PARA CAMBIAR * SÍNTESIS b) SÍNTESIS DE LA PROTEÍNA
LA CANTIDAD DE EN EL RIBOSOMA
ENZIMA

* DEGRADACIÓN DIFERENTES MECANISMOS

ALOSTERISMO (CAMBIA DE FORMA)

UN ENZIMA ALOSTÉRICA SE DISTINGUE POR SU

RESPUESTA A LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO Y
POR SU SUSCEPTIBILIDAD
DE REGULACIÓN POR OTRAS MOLÉCULAS

SE CARACTERIZAN POR TENER MÚLTIPLES

CENTROS FUNCIONALES
(CENTROS ACTIVOS)
Y
CENTROS REGULADORES
(CENTROS ALOSTÉRICOS)
ENZIMA ALOSTÉRICA

SUSTRATO
SITIO CATALITICO

ENZIMA

SITIO REGULADOR
Ligando o efector o regulador
alostérico

LA UNIÓN DEL REGULADOR INDUCE

CAMBIOS CONFORMACIONALES
QUE SE TRANSMITEN AL SITIO ACTIVO
 REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
ALOSTERISMO

SUSTRATO
SITIO CATALITICO

ENZIMA

Sitio Regulador
Ligando o efector o regulador
alostérico + o -

+ Sitio alostérico
(es específico)
Actividad enzimática
Ligando o
Regulador o
Efector alostérico
(específico) - Sitio alostérico
(es específico)
Actividad enzimática
ENZIMA ALOSTÉRICA

SUSTRATO
SITIO CATALITICO

ENZIMA

SITIO REGULADOR
Ligando o efector o regulador
alostérico

LA ACTIVIDAD DE UN CENTRO
FUNCIONAL AFECTA A LOS DEMÁS
POR TANTO PRESENTAN
COOPERATIVIDAD
LOS ENZIMAS REGULADOS ALOSTÉRICAMENTE NO SIGUEN LA CINÉTICA
DE MICHAELIS-MENTEN
Conforme se le une su sustrato
VELOCIDAD está en estado “relajado”

LA TRANSICIÓN DE T a R
POR LA UNIÓN DE SU SUSTRATO,
TAMBIÉN AUMENTA LA ACTIVIDAD

Sin sustrato el enzima

esta en estado “tenso”

SUSTRATO
TRANSICIÓN DEL ESTADO T AL R EN LA HEMOGLOBINA
 REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
ALOSTERISMO

SUSTRATO
SITIO CATALITICO

ENZIMA

Sitio Regulador
Ligando o efector o regulador
alostérico + o -

+ Sitio alostérico
(es específico)
Actividad enzimática
Ligando o
Regulador o
Efector alostérico
(específico) - Sitio alostérico
(es específico)
Actividad enzimática
 Eventos en la transición alostérica
EFECTOR UNIÓN A LA ENZIMA INDUCCIÓN DE
ALOSTÉRICO (SITIO ALOSTÉRICO) CAMBIO
+ ó - CONFORMACIONAL

TRANSMISIÓN A TRAVÉS
DE LA ENZIMA HASTA
EL SITIO CATALÍTICO

EXPRESIÓN DE MODIFICACIÓN + ó - CAMBIO EN LA

LA ACTIVIDAD DE LA AFINIDAD POR ESTRUCTURA DEL
DE LA ENZIMA EL PRODUCTO, CAM- SITIO CATALÍTICO.
(CATÁLISIS) BIO REACTIVIDADES
DE RESIDUOS CRÍTICOS
EN LA CATÁLISIS.
 REGULACIÓN ENZIMÁTICA

INHIBIDOR INHIBIDOR INHIBIDOR

SUSTRATO COMPETITIVO NO COMPETITIVO ALOSTÉRICO
SITIO CATALITICO
SUSTRATO

ENZIMA ENZIMA ENZIMA ENZIMA

Sitio Regulador
-

ALOSTERISMO: forma de regulación de la actividad de una enzima

* Las enzimas alostéricas NO siguen el comportamiento Michaeliano
(hiperbólico). Su cinética de velocidad vs. [S] es sigmoidal.
* Estas enzimas tienen más de un sitio de unión para el sustrato o para otro
efector.
* Este segundo sitio no es catalítico, pero al ser ocupado, “transmite” su efecto
al sitio catalítico, el cual aumenta o disminuye su afinidad por el sustrato
(SITIO ALOSTÉRICO)
TIPOS DE REGULACIÓN ALOSTÉRICA

REGULACIÓN POR PRODUCTO

El producto de la catálisis, al alcanzar ciertas concentraciones,
se une a la enzima, inhibiéndola (interaccionando en el sitio alostérico,
no en el sitio activo)
-
E
A+B C
 REGULACIÓN POR FEEDBACK (RETROALIMENTACIÓN )

Es una inhibición alostérica que se presenta para regular vías metabólicas

Enz A Enz B Enz C Enz D

Sustrato A Sustrato B Sustrato C Sustrato D Sustrato E
REGULACIÓN POR MODIFICACION COVALENTE :

La actividad de la enzima se regula, ya sea + o – por la adición o

substracción de un grupo químico o de una parte de la molécula
de enzima.
a) Fosforilación (regulación reversible) :
Pi (FOSFORILASA O CINASA)
FORMA INACTIVA
ENZIMA FOSFOENZIMA O
DEFOSFORILADA ENZIMA FOSFORILADA
FORMA ACTIVA Pi (FOSFATASA)
ALGUNOS TIPOS DE MODIFICACIONES COVALENTES

MODIFICACIÓN EJEMPLO DE
PROTEÍNA
MODIFICADA
Fosforilación Piruvato cinasa
Acetilación Histonas
Miristilación Src
ADP-ribosilación RNA polimerasa
Farnesilación Ras
-Carboxilación Trombina
Sulfatación Fibrinógeno
Ubiquitinación Ciclina
 Las cinasas o fosforilasas toman el Pi del ATP, al que hidrolizan
en ADP+Pi y este Pi es transferido a la enzima que es sustrato de la cinasa

ATP ADP+ Pi
CINASA o Pi
FOSFORILASA Sitio de fosforilación
ENZIMA Pi
DEFOSFORILADA
ENZIMA FOSFORILADA
Pi
ACTIVA FOSFATASA INACTIVA

El Pi se esterifica a un grupo hidroxilo de la proteína, por lo que los

aminoácidos que se fosforilan en una proteína son la SERINA,
TREONINA y TIROSINA
El Pi queda unido de una manera covalente a la enzima, pero esta
fosforilación puede ser reversible gracias a una FOSFATASA
REGULACIÓN COVALENTE
b) PROTEÓLISIS (REGULACIÓN IRREVERSIBLE)
ZIMÓGENOS. Proteínas inactivas que tiene un tamaño mayor
al de la enzima madura y que son procesados hasta la forma
madura, que es más pequeña
proteasa
NH2
NH2
COOH
COO-
+ NH2
PROCESAMIENTO
COOH
PRECURSOR
(INACTIVO) FORMA MADURA
O (ACTIVA)
PROTEÍNA INMADURA
ZIMÓGENO
ISOFORMAS O ISOENZIMAS O ISOZIMAS

•Son variaciones estructurales de una misma enzima

•Las isoformas pueden ser de un 70-98 % idénticas entre sí

•Las isoformas de una misma enzima catalizan la misma reacción, pero

con ligeras variaciones en la velocidad, la Km, el pH óptimo,
sensibilidad a inhibidores, a reguladores alostéricos, etc.

• Esas pequeñas diferencias no son suficientes para que la reacción que

catalizan sea diferente

•Por eso, las isoenzimas son otras formas de expresar una actividad
enzimática regulada

•La isoforma que exista en un tejido o en un momento de

desarrollo particulares es justamente la que se necesita ahí por sus
características particulares de cinética o de regulación
Una isoforma puede ser específica de un tejido o de una
edad del tejido, porque despliega justamente la
actividad que demanda este tejido

Así, el organismo modula una misma actividad

enzimática en diferentes tejidos, expresando
diferentes formas de la enzima