FACULTAD DE VETERINARIA

Departamento de Bioquímica y Biología

Molecular

PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA

Curso 2023-24

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1
PRÁCTICAS 3 y 4.
ENZIMOLOGÍA: INTRODUCCIÓN TEÓRICA

1. CONCEPTO DE ENZIMA

Los enzimas son las biomoléculas responsables de la catálisis de las reacciones

bioquímicas (reacciones químicas que tienen lugar en los organismos vivos), siendo en su
mayoría de naturaleza proteica, con la excepción de un grupo de moléculas de ARN que
presentan actividad catalítica.

catalizador
inorgánico enzima
REACTANTE PRODUCTO SUSTRATO PRODUCTO

Reacción Química Reacción Bioquímica

Los enzimas presentan una serie de propiedades que los diferencian de los catalizadores
inorgánicos (Paladio, Platino, Sodio...):

 Eficiencia: a muy pequeñas concentraciones, incrementan notablemente la velocidad de la

reacción que catalizan.

 Especificidad: cada enzima actúa sobre un determinado sustrato o grupo de sustratos de

similares características, catalizando un único tipo de reacción bioquímica.

 Regulabilidad: su actividad biológica está modulada por factores como la concentración de

sustratos, el pH, la temperatura ...

 Los enzimas trabajan en condiciones de presión, temperatura y pH muy suaves.

2. CINÉTICA ENZIMÁTICA

La cinética estudia la velocidad a la que transcurren las reacciones químicas y los

factores que la modifican. Dada una reacción química del tipo: A P, la velocidad de
reacción se define como la cantidad de producto generado o la cantidad de sustrato que
desaparece por unidad de tiempo:

dA dP
Velocidad = - =
dt dt

2
Según su cinética las reacciones químicas se clasifican en:

 Reacciones de orden cero: la velocidad es

constante e independiente de la concentración -dA/dt
de reaccionantes.

dA dP
- = = cte (k)
dt dt
[A]

 Reacciones de orden uno: la velocidad es

-dA/dt
directamente proporcional a la concentración de
reaccionante.

dA dP
- = = k [A]
dt dt
[A]

 Reacciones de orden dos: La velocidad es proporcional al producto de las concentraciones de

dos reaccionantes o al cuadrado de la concentración de un reaccionante.

dA dP dA dP
- = = k [A][B] - = = k [A]2
dt dt dt dt

Aunque las reacciones enzimáticas, dado que son reacciones químicas, se rigen por los
principios generales de la cinética química, presentan una característica especial que las
diferencia de éstas, y que es la saturación por sustrato. Para una reacción enzimática
monosustrato del tipo:

A B

al representar la velocidad de reacción frente a la concentración de sustrato se obtiene una curva

hiperbólica, como la que se muestra a continuación:

-dA/dt
3
2

[A ]

3
 En 1913, Leonor Michaelis y Maude Menten, propusieron una ecuación para explicar
este comportamiento cinético:

Vm S
V ax Ecuación de Michaelis-Menten
o Km S

Vo es la velocidad de reacción a una determinada concentración de sustrato S; Vmax es la

velocidad máxima y Km es la denominada constante de Michaelis-Menten. Según esta ecuación:

 Cuando la concentración de sustrato es muy baja (zona 1 de la curva)

Vm S
[S] << Km Km + [S]  Km  V ax  Vo = k [S]  reacción de orden 1
o Km
cte (k)

 Cuando la concentración de sustrato es elevada (zona 3 de la curva)

Vm S
[S] >> Km  Km + [S]  [S]  V ax
 Vo = Vmax  reacción de orden 0
o S cte
Por tanto, la velocidad máxima (Vmax) se puede definir como velocidad de reacción que se
alcanza a elevadas concentraciones de sustrato. Su valor es independiente de la
concentración de sustrato y depende exclusivamente de la cantidad de enzima.

 A concentraciones intermedias de sustrato (zona 2 de la curva)

Vm S Vm S Vmax
[S] = Km  V ax = ax Vo =
o Km S 2 S 2

Cuando la concentración de sustrato coincide con el valor de Km , se alcanza una velocidad

de reacción mitad de la velocidad máxima. Por tanto, se puede definir la Km (constante de
Michaelis-Menten) como la concentración de sustrato que da lugar a una velocidad de
reacción igual a la mitad de la velocidad máxima (Vmax).

Vo
Vmax

½ Vmax

Km [S]

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Los parámetros Vmax y Km son característicos para cada enzima y su sustrato, siendo el cociente
entre ambos una medida directa de la eficiencia catalítica de la enzima. Por esta razón es muy
importante, a la hora de caracterizar una enzima, determinar los valores de estas dos constantes.
Para realizar este cálculo, se utiliza habitualmente la denominada representación de dobles-
recíprocos o de Lineweaver-Burk, que se obtiene a partir de una transformación algebraica de
la ecuación de Michaelis-Menten:
Vm S Realizando los inversos de los dos miembros
V ax
o Km S de la ecuación:

1 Km S
Reordenando:
V Vm S
o ax

1 Km 1 1
+ Ecuación de Lineweaver-Burk
V Vm S Vmax
o ax
y = a x + b

Al representar 1/Vo frente a 1/[S], se obtiene una recta :

1/Vo

Km/
A partir de los puntos de corte de la recta
Vmax
obtenida con el eje x y con el eje y se
1/
Vmax pueden calcular los valores de Km y Vmax
respectivamente.

1/[S]

- 1/Km

3. INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

Se denomina inhibidor a toda sustancia que se une a una enzima y reduce la velocidad de
la reacción que cataliza. La inhibición de algunas enzimas por inhibidores específicos
constituye un sistema importante de regulación de las reacciones que ocurren en las células y en
ciertos casos tiene aplicaciones clínicas. Podemos clasificar los inhibidores en dos tipos:
1. Inhibidores irreversibles. El inhibidor se une a la enzima mediante un enlace covalente, es
decir la unión enzima-inhibidor es permanente. En este tipo de inhibición no se puede aplicar la

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cinética de Michaeleis-Menten ya que ésta supone la formación reversible de un complejo
enzima-inhibidor y en este caso, la unión enzima-inhibidor es irreversible.
Un ejemplo de inhibición irreversible lo constituyen los llamados agentes alquilantes, como la
iodoacetamida que se une mediante un enlace covalente a un grupo SH y por tanto inactiva
irreversiblemente enzimas que contengan alguna cisteína implicada en la catálisis. Otro ejemplo
lo constituyen los organofosforados, utilizados como gases de guerra, que se unen de forma
covalente a grupos OH y por tanto inactivan enzimas que contengan Ser, Thr o Tyr implicadas
en la catálisis. Un ejemplo de estas enzimas sería la acetil-colinesterasa, que degrada la acetil
colina.

2. Inhibidores reversibles. La unión del inhibidor al enzima se produce mediante enlaces

débiles, no covalentes, por tanto se trata de una unión reversible, similar a la que ocurre entre la
enzima y el sustrato. A su vez, podemos dividir los inhibidores reversibles en dos grandes
grupos:
 Inhibidores competitivos: El inhibidor compite con el sustrato por unirse al enzima ya que
ambos se unen a través del centro activo. Lógicamente, este tipo de inhibidores suelen tener
una similitud estructural con el sustrato. Tendríamos el esquema siguiente:

E ES E+E
+
E
+ E EI
Este tipo de inhibición se reconoce experimentalmente porque, en presencia de una
concentración fija de inhibidor, el porcentaje de inhibición disminuye al aumentar la
concentración de sustrato, de tal forma que a saturación de sustrato (V máx), la inhibición
desaparece. Dado que S e I compiten por unirse al centro activo, cuanto mayor sea la
concentración de S mayor será la probabilidad de que sea éste y no el inhibidor el que se una
a la enzima. Por tanto, al medir la velocidad de reacción a diferentes concentraciones de
sustrato en presencia de una concentración fija de inhibidor, se obtendrán las siguientes
representaciones v -[S] y 1/v - 1/[S]:

V
oVma 1/ +I
x Vo

+I
½ 1/
Vmax Vmax

Km K’m 1/[S]
[S]
- - 1/K’m
1/Km

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 La constante de inhibición (Ki), viene dada por la siguiente expresión:

Km · [I]
Ki =
K’m - Km
La Ki es una medida indirecta de la potencia del inhibidor, lo mismo que la K m lo es de la
afinidad de la enzima por su sustrato. A mayor K i menor será la potencia del inhibidor y
viceversa.

 Inhibición no competitiva. En este caso el inhibidor se une al enzima a través de un sitio

distinto al centro activo, por tanto sustrato e inhibidor podrán unirse de forma simultánea a
la enzima, en otras palabras se podrá formar un complejo ternario ESI.

E + E ES E +E
+ +
E E

EI + E ESI
Experimentalmente la inhibición no competitiva se distingue porque el porcentaje de
inhibición no se modifica al aumentar la concentración de sustrato, porque la presencia de
éste no afecta a la unión del inhibidor. En este caso, el prametro cinético afectado por la
presencia de inhibidor será la Vmáx, pero no la Km ya que el inhibidor no afecta a la unión
enzima-sustrato. Por tanto, si medimos experimentalmente la velocidad de reacción a
diferentes concentraciones de sustrato, en presencia de una concentración fija de inhibidor,
obtendríamos las gráficas siguientes:
V
o 1/
Vm Vo +I
ax
V’m
ax +I
1/
½
Vmax V’max
½ 1/
V’max Vmax

K 1/[S]
[S] -
m 1/Km

La constante de inhibición vendrá dada en este caso por la siguiente expresión:

V’max · [I]
Ki =
Vmax – V’max

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PRÁCTICA 3.
CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA FOSFATASA ÁCIDA EN
EL EXTRACTO CRUDO/ESTUDIO DEL EFECTO DEL pH.

1. INTRODUCCIÓN

Para medir o cuantificar la actividad de una enzima en una muestra biológica

necesitamos conocer:

 Estequiometria de la reacción catalizada

 Requerimiento de coenzimas u otros cofactores
 Km para sustrato(s)
 pH y temperatura óptimos para la reacción
 Método analítico que nos permita cuantificar la aparición de un producto o la desaparición
de un sustrato, es decir que nos permita determinar la velocidad de la reacción (Vo). Las
técnicas analíticas más usadas para medir Vo son las técnicas espectrofotométricas. El
espectrofotómetro nos permite determinar la absorbancia de una muestra y ésta se puede
relacionar, según la ley de Lambert-Beer, con la concentración de una sustancia en una
disolución.

Para expresar la actividad de una enzima en una muestra se utiliza alguna de las
siguientes unidades:

 Unidad Internacional de actividad enzimática (U.I.). Se define como la cantidad de

enzima que transforma un mol de sustrato por minuto en condiciones óptimas de medida.

 Catal. Se define como la cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato por segundo
en condiciones óptimas de medida. 1 catal equivale a 6·107 UI.

En esta práctica se pretende cuantificar la actividad de una fosfatasa ácida en un

extracto hepático. Las fosfatasas son enzimas bastante inespecíficas que catalizan la reacción de
hidrólisis de un enlace fosfoéster presente en cualquier molécula, dando como productos un
alcohol y el grupo fosfato libre.

fosfatasa
X-O-P + H2O X-OH + Pi

enlace fosfoéster

Existe un tipo de fosfatasas que solamente son activas a pH ácido y por eso se denominan
fosfatasas ácidas.

8
 En esta práctica utilizaremos como sustrato el denominada p-nitrofenilfosfato, molécula
que presenta en su estructura un enlace fosfoéster que puede ser hidrolizado por la enzima,
como se observa en la siguiente reacción:

O fosfatasa O
O2 O P O- + H2O O2 OH + HO P OH
N N
OHO- OH

p-nitrofenilfosfato (p-NFP) + H2O p-nitrofenol (p-NF) + fosfato (Pi)

La velocidad de la reacción la mediremos valorando la cantidad de sustrato que se consume,

equivalente a la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo. Esta medida se puede
realizar de dos formas:

 Medida a punto final: Se deja transcurrir la reacción durante un tiempo determinado, al cabo
del cual se valora la cantidad de sustrato consumido o de producto generado y se divide entre
el tiempo transcurrido.

 Medida cinética: La desaparición de sustrato o la aparición de producto se valora de forma

continuada en el tiempo.

En esta práctica, para medir la velocidad de la reacción catalizada por la fosfatasa

ácida se utiliza un método a punto final, cuantificando la cantidad de p-nitrofenol (producto)
generado durante un tiempo de transcurso de la reacción. Para ello, se incuba durante un tiempo
determinado, un volumen de extracto hepático (que contiene la fosfatasa ácida), con el sustrato
(p-NFP), en unas condiciones óptimas de temperatura y pH. Transcurrido el tiempo fijado, se
alcaliniza el medio por la adición de NaOH, lo cual por una parte inactiva la enzima y por otra
parte hace que el p-NF formado durante el transcurso de la reacción adquiera un color amarillo,
fácilmente cuantificable espectrofotométricamente midiendo la absorbancia a 420 nm.

extracto (fosfatasa) p-NFP (sustrato) NaOH

tiempo (t)
color amarillo,
producido
por el p-nitrofenol en
medio alcalino

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Para poder relacionar la intensidad de color amarillo con la cantidad de p-nitrofenol formado, es
necesario realizar previamente una recta de calibrado o recta patrón con cantidades conocidas
y crecientes de p-nitrofenol (de forma similar a lo descrito en la práctica 1).

2. MATERIAL Y REACTIVOS

- Gradillas y tubos de ensayo.

- Juego de pipetas de 5, 1 y 0,2 ml.
- Baño termostatizado.
- Espectrofotómetro.

- p-nitrofenol 0,5 mM en tampón citrato (pH 3).

- NaOH 0,2 N.
- p- nitrofenilfosfato sódico 1 mM disuelto en tampón citrato 50 mM (soluciones de: pH 2; pH
3; pH 4 y pH 5).
- Extacto crudo

3. MÉTODO

1. Construcción de la recta de calibrado

En una batería de tubos se adicionan los siguientes reactivos en el orden indicado:

p-nitrofenol H2O NaOH Absorbancia

Tubo (ml) (µmoles) (ml) (ml) (unidades)
s

B --- --- 1,0 5

1 0,1 (0,05) 0,9 5

2 0,2 (0,10) 0,8 5

3 0,3 (0,15) 0,7 5

4 0,4 (0,20) 0,6 5

5 0,5 (0,25) 0,5 5

Mezclar bien los tubos y leer las absorbancias a 420 nm en el espectrofotómetro,

ajustando a cero la absorbancia con el blanco (Tubo B). Representar en papel milimetrado los
datos de absorbancia obtenidos (eje de ordenadas) frente a las correspondientes cantidades
(moles de pNF ; eje de abscisas). Determinar la ecuación de la recta.

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11
2. Cuantificación de la actividad fosfatasa ácida en un extracto crudo. Debemos medir la
velocidad de reacción a saturación de sustrato y en condiciones de pH y temperatura óptimas.
Para ello se dispone de dos tubos en los que se añaden los componentes de la mezcla de
reacción en el orden que se indica:
Tubos
B 1 2 3

1º p-NFP (sustrato) (ml) --- 0,8 0,8 0,8

(pH 2) (pH 3) (pH 5)

2º H2O (ml) 0,8 --- --- ---

3º Extracto crudo (enzima) (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2

Se agitan suavemente los tubos y se incuban las mezclas de reacción durante 20 minutos a 30ºC
en un baño termostatizado (nota: se toma como inicio de la reacción el momento en que se
añade la enzima: extracto de hígado). Transcurrido ese tiempo, se para la reacción enzimática
mediante la adición de 5 ml de NaOH 0,2 N y se lee la absorbancia de cada tubo a 420 nm,
ajustando el espectrofotómetro a cero con el blanco (tubo B).

Con la ayuda de la ecuación correspondiente a la recta patrón obtenida anteriormente se

calculan los micromoles de p-NF que se han formado en cada tubo. A partir de estos valores se
determina la velocidad de reacción, y una vez obtenida ésta se calcula la actividad enzimática
fosfatasa ácida presente en el extracto crudo.

4. RESULTADOS

 Calcula la actividad enzimática de la fosfatasa ácida presente en el extracto crudo

expresada en UI/ml de extracto. Determina el pH óptimo para el enzima.

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PRÁCTICA 4.
ESTUDIO CINÉTICO DE LA FOSFATASA ÁCIDA: DETERMINACIÓN DE K m Y
Vmax. INHIBICIÓN POR FOSFATO: DETERMINACIÓN DE Ki.

1. INTRODUCCIÓN

Para realizar un estudio cinético de una enzima, es decir para determinar los valores de
Km y Vmax, es necesario medir experimentalmente la velocidad de reacción (Vo) a diferentes
concentraciones de sustrato. Si además pretendemos ver el efecto de un inhibidor y determinar
la constante de inhibición (Ki), debemos determinar la velocidad de reacción a diferentes
concentraciones de sustrato en presencia y ausencia de una concentración fija de inhibidor. En
esta práctica se pretende: a) realizar un estudio cinético de la fosfatasa ácida, determinando los
valores de Km y Vmax utilizando como sustrato el pNFP; b) estudiar el efecto inhibidor del
fosfato inorgánico (Pi) sobre esta enzima.

2. MATERIAL Y REACTIVOS

- Gradillas y tubos de ensayo.

- Juego de pipetas de 5, 1 y 0,2 ml.
- Baño termostatizado.
- Espectrofotómetro.

- p-nitrofenol 0,5 mM en tampón citrato (pH 3).

- NaOH 0,2 N.
- Fosfato inorgánico (PO4H2Na) 0.1 M
- p- nitrofenilfosfato sódico 1 mM disuelto en tampón citrato (pH 3).
- Extracto crudo.

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3. MÉTODO

Se dispone una serie de tubos en una gradilla, y se adicionan los componentes de la mezcla de
reacción según las cantidades y en el orden indicado en la siguiente tabla:

Sin inhibidor + Inhibidor

TUBO nº  B 1a 2a 3a 4a 5a 6a 1b 2b 3b 4b 5b 6b

1º p-NFP (sustrato) (ml) – 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

2º H2O (ml) 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 –

3º Fosfato (Pi) (ml) – – – – – – – 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

3º Extracto crudo – enzima (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Se agitan los tubos y se incuban las mezclas de reacción durante 20 minutos a 30ºC en un
baño termostatizado. Transcurrido ese tiempo, se para la reacción enzimática mediante la
adición de 5 ml de NaOH 0,2 N y se lee la absorbancia de cada tubo a 420 nm, ajustando el
espectrofotómetro a cero con el blanco (tubo B).

Con la ayuda de la ecuación correspondiente a la recta patrón realizada en la práctica

anterior se calculan los micromoles de p-NF que se han formado en cada tubo. A partir de estos
valores se determina la velocidad de reacción correspondiente a cada concentración de sustrato
en presencia y ausencia de inhibidor.

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4. RESULTADOS

 Calcula la velocidad de reacción (expresada en µmoles p-NF/minuto) obtenidas para cada

concentración de sustrato (p-NFP), tanto en ausencia como en presencia de inhibidor
(Pi) . A partir de los datos obtenidos, calcula los inversos de velocidad (1/V o) y
concentración de sustrato (1/[S]). Utiliza las siguientes tablas:

Ausencia de inhibidor:

[P-NFP] Absorbancia cant. p-NF Vo 1/[p-NFP] 1/Vo

Tubo
 (mM) (unidades) (µmoles) (µmoles p-NF/min) (mM-1) (min/µmoles p-NF)

1a

2a

3a

4a

5a

6a

Presencia de inhibidor

[P-NFP] Absorbancia cant. p-NF Vo 1/[p-NFP] 1/Vo

Tubo
 (mM) (unidades) (µmoles) (µmoles p-NF/min) (mM-1) (min/µmoles p-NF)

1b

2b

3b

4b

5b

6b

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 Representa en papel milimetrado los valores del inverso de velocidad (1/V o) en el eje de
ordenadas frente a los valores del inverso de concentración de sustrato (1/[p-NFP] ) en el
eje de abscisas ( representación de los dobles recíprocos o de Lineweaver-Burk).

 Calcula los valores de Km y Vmax., tanto en presencia como en ausencia de inhibidor.

 Deduce razonadamente el tipo de inhibición ejercida por el fosfato.

 Calcular el valor de Ki para el fosfato.

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