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32

Capítulo 6
Cinética enzimática

Visión general

• El efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de una reacción

catalizada por enzimas puede describirse matemáticamente mediante la ecuación
de Michaelis-Menten.
• La constante de Michaelis-Menten (Km) es la concentración de sustrato a la que la velocidad
de reacción es la mitad de su valor máximo (1/2 Vmax).
• Los gráficos recíprocos dobles de concentración de sustrato/velocidad de reacción (es
decir, gráficos de Lineweaver- Burk) arrojarán datos lineales.
• Los inhibidores enzimáticos competitivos pueden superarse aumentando la
concentración de sustrato; los inhibidores no competitivos, no.
• La inhibición no competitiva no altera la Km, pero reduce la Vmax.
• La inhibición competitiva no altera la Vmax, pero aumenta la Km.
• Una enzima con una Km elevada tiene una baja afinidad por su sustrato.
• Los inhibidores irreversibles actúan cinéticamente como los inhibidores no competitivos.
• Las isozimas son específicas de un órgano, por lo que resultan útiles como agentes de
diagnóstico.
• Los niveles en sangre de la isoenzima cardiaca de la troponina-I (cTn-I) se utilizan
habitualmente como marcadores
de daño y necrosis de las células miocárdicas (véase el estudio de caso nº 3).
• Los niveles en sangre del péptido natriurético cerebral N-terminal-pro (NT-proBNP) se
utilizan como
marcadores de hipertrofia o dilatación cardiaca en animales con insuficiencia cardiaca
congestiva.

Un buen sustrato puede escindirse 10.000
Maud Menten demostraron por primera
vez que estas reacciones se producen en
dos etapas (Fig. 6-1). En primer lugar, el
sustrato (S) se une a su enzima (E),
formando una enzima-subenzima.

veces más rápido que un sustrato deficiente Figura 6 - 1

debido a la especificidad de la enzima. Los
cinéticos de enzimas estudian los factores que
influyen en la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas. Leonor Michaelis y
(ES). Esta unión se produce rápidamente, pero de
forma reversible (k1 y k2 son las constantes de
velocidad para estos procesos). A continuación, el
sustrato unido a la enzima se transforma en un
producto (P) que se disocia de la enzima, un
proceso que también es reversible (constantes de
velocidad k3 y k4). El poder catalítico de una enzima
Derechos de autor © 2015 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
sobre un sustrato determinado implica dos
variables básicas: Km, que es una medida de la
afinidad de la enzima por su sustrato, y Vmax,
que es una medida de la velocidad máxima de
la catálisis enzimática. Aunque los términos
velocidad de reacción y velocidad de reacción
se utilizan indistintamente-

Por lo general, la velocidad se expresa en
términos de un cambio en la concentración de
sustrato o producto por unidad de tiempo,
mientras que la tasa se refiere a un cambio en
la cantidad total (moles, gramos) por unidad
de tiempo.
Curvas de saturación del sustrato
El efecto de la concentración de sustrato
sobre la velocidad de reacción, como se
muestra en la Fig. 6-2, puede describirse
matemáticamente mediante la ecuación de
Michaelis- Menten:
V = Vmax[S]/(Km + [S])
Dónde:
V = Velocidad de reacción
[S] = Concentración de sustrato
Vmax = Velocidad máxima de
reacción Km = [S] a 1/2 Vmax
La derivación de esta ecuación se basa en
cuatro
suposiciones:
1) Que [S] es grande en relación con la
concentración de enzima ([E]), por lo que la
formación del complejo ES no altera
significativamente la [S];
2) Que [P] al principio de la reacción es
insignificante, por lo tanto la velocidad de
reacción descrita por k4 arriba puede ser
ignorada;
1⏵ 33
Capítulo 6
3) Que la velocidad a la que ES se transforma
en E + P es limitante (es decir, el paso más
lento de la secuencia de reacción); y
4) Que la formación del complejo ES es rápida
y reversible, y la velocidad a la que se
forma es igual a la velocidad a la que
desaparece.
A bajas concentraciones de [S], las
velocidades de reacción de la Fig. 6-2 son
bajas y aumentan con el incremento de [S]
hasta que se alcanzan puntos en los que las
concentraciones más altas sólo muestran
incrementos marginales en la velocidad de
reacción. Teóricamente, sin importar qué tan
alto se eleve el [S], la velocidad de reacción se
aproximará asintóticamente, pero no alcanzará
del todo, la meseta. Este punto se conoce
como velocidad de reacción máxima (Vmax), en
el que la enzima se satura con su sustrato y no
puede funcionar más rápido. Valores de Vmax
son unidades de tasa habituales (por ejemplo,
μmol/min).
La constante de Michaelis-Menten (Km) es la
concentración de sustrato (por ejemplo, mM)
a la que la velocidad de reacción es la mitad
de su valor máximo (1/2 Vmax) y, como ya se ha
dicho, es una medida de la afinidad de la
enzima por su sustrato. Una enzima con poca
afinidad por su sustrato tendrá una Km alta, y
una con mucha afinidad tendrá una Km baja.
Tanto Vmax como
34 Cinética Figura 6 - 2
enzimática

Los son sensibles a los cambios de pH,
Km
temperatura, fuerza iónica y a la presencia o
ausencia de inhibidores enzimáticos.
Parcelas recíprocas dobles
Las estimaciones de Vmáx y Km pueden
obtenerse a partir de curvas no lineales de
saturación de sustrato (como en la Fig. 6-2);
sin embargo, cuando se desean datos lineales,
generalmente se emplean gráficos recíprocos
dobles (Lineweaver-Burk) (Fig. 6-3). La
ecuación para estas construcciones lineales se
obtiene tomando el recíproco de la ecuación
de Michaelis-Menten:
1/V = (Km/Vmax) (1/[S]) + (1/Vmax)
La pendiente de esta ecuación es Km/Vmax, el
punto en el que la línea de regresión lineal se
cruza con el eje y es numéricamente
equivalente a 1/Vmax, y el punto en el que se
cruza con el eje x es -1/Km. Así pues, un gráfico
de Lineweaver-Burk proporciona
intersecciones x e y fácilmente identificables
que, a su vez, definen las dos variables cinéticas,
Km y Vmax.
Inhibidores enzimáticos
Las enzimas pueden ser envenenadas o
inhibidas ter- apeúticamente por diversas
sustancias químicas. Irreversible
1⏵ 35
Capítulo 6
Los inhibidores se unen a las enzimas y se
disocian lentamente, si es que lo hacen. Un
ejemplo es el gas nervioso diiso-propil-
fosfofluoridato (DIPF), que se une a la
acetilcolinesterasa (AChE), prolongando así la
acción del neurotransmisor acetilcolina (ACh).
La toxicidad del gas nervioso puede provocar
la muerte por espasmo laríngeo. Los
anticolinesterásicos reversibles menos
potentes se utilizan clínicamente para tratar
enfermedades como la miastenia grave. Los
inhibidores reversibles suelen clasificarse en
competitivos y no competitivos.
Inhibidores reversibles y competitivos
Los inhibidores competitivos pueden
considerarse análogos estructurales del
sustrato y, por lo tanto, compiten por los
mismos sitios de unión activos en la enzima
(Fig. 6-4). Debido a esta competencia, si se
proporciona suficiente sustrato, el efecto del
inhibidor competitivo puede ser superado (es
decir, el sustrato finalmente ocupará todos los
sitios de unión). Esto se demuestra en la Fig.
6-2 y en la Fig. 6-3. La Vmáx de la reacción
catalizada por la enzima en presencia de un
inhibidor competitivo no varía con respecto a
la normal; sin embargo, la Km aparente (Km') para
el sustrato aumenta, ya que una mayor
concentración de inhibidor competitivo en el
sustrato es mayor que la Vmáx de la reacción
catalizada por la enzima.
36 Cinética
enzimática

Figura 6 - 3
 1⏵ 37

para superar los efectos inhibidores del
competidor.
Inhibidores reversibles no competitivos
Los inhibidores no competitivos no suelen
estar estructuralmente relacionados con el
sustrato y se unen a un sitio alostérico de la
enzima (es decir, uno distinto del sitio activo)
(Fig. 6-4). Así, tanto el sustrato como el
inhibidor pueden unirse teóricamente a la
enzima al mismo tiempo. Sin embargo, el
inhibidor suele distorsionar los sitios activos,
alterando así la conformación de sus residuos
catalíticos (lo que reduce aún más la eficacia
del complejo ES). Dado que el efecto de un
inhibidor no competitivo no puede revertirse
aumentando las concentraciones de sustrato, la
Km permanece inalterada; sin embargo, se
produce una reducción de la Vmax aparente (Vmax')
(Figs 6-2, 6-3).
Inhibidores no competitivos
Un tercer tipo de inhibición es no
competitiva, y tanto la Km como la Vmax se
modifican (Km'' y Vmax''), pero la pendiente
permanece constante (Fig. 6- 3). Aunque
estos inhibidores no reaccionan con la enzima
libre, pueden combinarse con el complejo ES
para ralentizar o impedir la formación de
producto. Este tipo de inhibición puede
observarse en reacciones en las que
intervienen dos sustratos.
Capítulo 6
nentemente inactivados. Algunos se unen a
los sitios activos y se conocen como "sustratos
suicidas basados en el mecanismo". Los
efectos cinéticos de los inhibidores
irreversibles son similares a los de los
inhibidores no com- petitivos anteriores (es
decir, la Vmax disminuye, mientras que la Km no se
ve afectada).
Inhibidores terapéuticos
La mayoría de los inhibidores terapéuticos
son sustratos suicidas basados en mecanismos
o inhibidores competitivos. En la Tabla 6-1 se
ofrecen algunos ejemplos.
Isozimas
Las isozimas (o isoenzimas) catalizan
reacciones similares, pero difieren
ligeramente entre sí en su estructura química
y, por tanto, en sus propiedades cinéticas.
Suelen ser específicas de un órgano, por lo
que se aprovechan con fines diagnósticos. La
mayoría de las enzimas presentes en el
plasma se liberan durante el recambio celular
normal. Sin embargo, las cantidades elevadas
de determinadas isozimas que aparecen en el
plasma suelen revelar traumatismos o
procesos patológicos. En el laboratorio de
diagnóstico suelen separarse unas de otras
mediante electroforesis.
La creatina fosfoquinasa (CPK) y la lactato
deshidrogenasa (LDH) son dos isozimas

Inhibidores irreversibles
Los inhibidores irreversibles reaccionan
generalmente de forma cova- lente con una
cadena lateral de aminoácidos de la enzima
para formar un complejo estable que es
perma- nente.
38 Cinética
enzimática

Figura 6 - 4 Figura 6-
5
 1⏵ 39

Capítulo 6
Tabla 6-1
Ejemplos de inhibidores terapéuticos
Medicamento Tipo Uso terapéutico Enzima diana
Alopurinol Competitivo Gota Xantina oxidasa
y Suicidio
Aspirina Suicidio Antiinflamatorio Ciclooxigenasa
(COX 1,2)
Captopril Competitivo Hipertensión Angiotensina convertidora
Enzima (ACE)
Coumadin Competitivo Anticoagulante γ Glutamilcarboxilasa
Edrofonio Competitivo Miastenia grave Acetilcolinesterasa
5-Fluorouracilo Suicidio Cáncer Timidilato sintasa
Metotrexato Competitivo Cáncer Dihidrofolato
Reductase
Mevastatina Competitivo Hipercolesterolemia HMG-CoA Reductasa
HMG = 3-Hidroxi-3-Metilglutarilo; CoA = Coenzima A

Tabla 6-2
Ejemplos de enzimas séricas utilizadas con fines
diagnósticos
Enzima Propósito
Alanina aminotransferasa Necrosis hepática en perros y gatos.
Fosfatasa alcalina Obstrucción de la vía biliar y enfermedad ósea.
Amilasa Pancreatitis aguda.
Aspartato aminotransferasa Enfermedades hepáticas en grandes animales;
miopatías,
hemólisis y enfermedad intestinal.
Creatina fosfoquinasa Miopatías (e infarto de miocardio).
Lactato deshidrogenasa Infarto de miocardio; cerebro, riñón, páncreas,
trastornos pulmonares, esplénicos, hepáticos y
eritrocitarios.
Lipasa Pancreatitis aguda.
Sorbitol deshidrogenasa Enfermedades hepáticas en grandes animales.

comúnmente utilizadas con fines diagnósticos subunidades M y cardiaca (H), con 5 isozimas
(Tabla 6-2). La enzima CPK (véase el Capítulo diferentes
77) contiene dos dímeros ensamblados a
partir de los subtipos muscular (M) y cerebral
(B). La CPK del músculo esquelético es casi en
su totalidad la isoenzima MM, la del cerebro
BB, y la del músculo cardíaco 15% MB y 85%
MM (Fig. 6-5). Sólo el músculo cardiaco tiene
el dímero MB. La lactato deshidrogenasa es un
tetrámero, ensamblado a partir de las
40 Cinética
que aparece
enzimática por electroforesis. Tras un episodio
de isquemia miocárdica, la liberación de LDH en
plasma suele producirse después de la de CPK y
troponina-I. Las troponinas (Tn-I, Tn-T y Tn-C)
constituyen un complejo regulador de proteínas
musculares globulares de la banda I que
normalmente inhiben la contracción bloqueando
la interacción de la actina y la miosina. Otro
polipéptido de los miocitos ventriculares, el N-
terminal-pro-Brain

Péptido Natriurético (NT-proBNP), suele
elevarse en la hipertrofia (o dilatación)
cardiaca en animales con insuficiencia
cardiaca congestiva.
Cofactores y coenzimas
Las enzimas son proteínas globulares, cada
una de las cuales tiene una función específica
debido a su estructura única. Sin embargo, la
actividad enzimática óptima suele depender
de la cooperación de sustancias no proteicas
conocidas como cofactores. La relación
molecular entre una enzima y su cofactor se
denomina propiamente holoenzima, mientras
que el componente proteico desprovisto de su
cofactor es una apoenzima (que suele mostrar
una actividad baja, o nula). Sin embargo, no
todas las enzimas tienen cofactores.
Existen cofactores inorgánicos, que incluyen
varios cationes como Zn++, Mg++, Mn++, Fe++, Cu++, K+ o
Na+
, y cofactores orgánicos (es decir,
coenzimas), que consisten en una docena de
sustancias de estructura diversa. La
participación como cofactores de los cationes
inorgánicos representa una de las razones por
las que estos minerales son esenciales para la
vida.
Los cofactores de iones metálicos se unen
de forma transitoria y disociable a la
apoenzima o a un cosustrato (como el ATP) y,
como ya se ha dicho, deben estar presentes
en el medio que rodea a la enzima para que se
produzca correctamente la catálisis. Las
enzimas que requieren un cofactor inorgánico
se denominan enzimas activadas por metales
para distinguirlas de las metaloenzimas (en
las que los iones metálicos actúan como
grupos prostéticos).
La función de un cofactor es 1) alterar la
estructura tridimensional de la proteína y/o del
sustrato unido para maximizar la interacción,
o bien
2) participar realmente en la reacción global
como
Los otro sustrato
cofactores (es decir, un co-sustrato).
función nº 2 orgánicos actúan según la
La química de esta participación se describe
1⏵ 41
Capítulo 6
en relación con el otro u otros sustratos. La
agrupación puede ser CO2, un grupo metilo (-CH3),
un grupo amino (-NH2) o electrones, por
nombrar algunos. En consecuencia, las
coenzimas se denominan a veces agentes de
transferencia de grupos, y los que se alteran
serían co-substratos. Las vitaminas B
hidrosolubles son componentes importantes
de numerosas coenzimas (véanse los
Capítulos 40-43). Varias de estas coenzimas
contienen, además, las moléculas de adenina,
ribosa y fosforilo del AMP o ADP. La
nicotinamida es un componente de las
coenzimas redox NAD+ y NADP+, mientras que la
riboflavina es un componente de las
coenzimas redox FMN y FAD. El ácido
pantoténico es un componente de la
coenzima A transportadora de grupos acilo,
así como de la 4-fosfopantetina (un
importante grupo prostético en la proteína
transportadora de acilo (ACP)). Como
pirofosfato, la tiamina participa en las
reacciones de descarboxilación oxidativa, y el
ácido fólico, la biotina y la cobalamina son
coenzimas que intervienen en la transferencia
de un carbono. A lo largo de los capítulos
siguientes se describirá y analizará la actividad
de cada cofactor inorgánico/orgánico según
sea necesario.
OBJETIVOS
• Defina la Km (o Km') y la Vmax de una reacción
catálisis enzimática y discuta los factores que
alteran estas variables cinéticas.
• Explique la relación entre la Km y la afinidad
de una enzima por su sustrato.
• Reconocer por qué la Vmax de una reacción
catalizada por una enzima permanece
inalterada por un inhibidor competitivo, sin
embargo la Km' aumenta.
• Discutir las similitudes y diferencias entre los
gráficos no lineales estándar de Michaelis-
Menten y los gráficos recíprocos dobles
(Lineweaver-Burk).
• Identifique los cambios (si los hay) durante
max
en Km' y V
mejor en términos de la coenzima que
actúa como donante o aceptor de un
42 producto
Cinética químico particular. inhibición enzimática competitiva, no competitiva
enzimática y no competitiva.
• Dé un ejemplo de subestrato terapéutico
suicida y discuta su mecanismo de acción.
 1⏵ 43

Capítulo 6
• Explique por qué se han utilizado las isozimas 5. ¿Cuál de los siguientes inhibidores
con fines diagnósticos y proporcione algunos terapéuticos se considera un "sustrato
ejemplos. suicida"?
a. Aspirina
• Saber por qué los inhibidores no competitivos no
b. Captopril
tienen
c. Coumadin
afectan a la Km, mientras que los inhibidores
d. Edrofonio
competitivos sí lo hacen.
e. Mevastatina
• Reconocer por qué se utilizan las troponinas 6. La intersección y en un gráfico de Lineweaver-
cardiacas para evaluar el daño miocárdico tras Burk es:
un episodio isquémico y comprender la relación a. 1/2 Vmáx
entre el BNP, el volumen sanguíneo, los miocitos
b. 1/2 Km
cardiacos y la natriuresis (véase el estudio de
caso nº 3). c. 1/Vmáx
d. 1/Km
• Discutir cómo influyen los cofactores y e. -1/Km
coenzimas en las reacciones enzimáticas. 7. ¿Cuál de las siguientes es una
representación exacta de la ecuación de
Michaelis-Menten?
PREGUNTAS a. V = Vmax + [S] / (Km - [S])
1. La variable que mide la afinidad de una b. V = Vmax [S] / Km [S]
enzima por su sustrato es: c. V = Vmax [S] / (Km + [S])
a. k1
b. K
m

c. V d. V = Vmax + [S] / Km [S]

d. Vmax e. V = (Vmax/[S])(Km/[S])
e. [S]
8. Todas las siguientes son VERDADERAS de
los inhibidores competitivos, EXCEPTO:
2. Se sabe que la temperatura y el pH
a. Suelen ser análogos estructurales del
afectan: sustrato.
a. [S]
b. [E]
b. Reducen la Km aparente (Km') de las
c. Km pero no max reacciones que inhiben.
V
d. Vmax pero no Km c. Corazón
e. Km y Vmax d. Riñón
e. Hígado
3. La velocidad máxima de una reacción
catalizada por enzimas es:
a. Disminuye en presencia de un inhibidor
competitivo.
b. Se encuentra en el eje x de un Lineweaver-
Burk
parcela.
c. Conocida como la constante de Michaelis-
Menten.
d. Aumento en presencia de un
inhibidor no competitivo.
e. Disminuye en presencia de un inhibidor
irreversible.

4. ¿Qué tipo de tejido tiene la mayor

concentración de dímero MB para la
creatina fosfoquinasa?
a. Músculo esquelético
b. Cerebro
44 c. Cinética
La Vmax de la reacción catalizada por la
enzimática
enzima en presencia de un inhibidor
competitivo no suele variar con respecto a
la normal.
d. A veces se utilizan con fines terapéuticos para
controlar la actividad de enzimas diana.
e. Por lo general, sus efectos pueden
invertirse aumentando la concentración
de sustrato.

9. ¿Qué tipo de inhibidor enzimático

de los que aparecen a continuación
se sabe que afecta tanto a la Vmax
como a la Km?
a. Irreversible
b. No competitivo
c. No competitivo, reversible
d. Competitivo, reversible
e. Terapéutica