CINÉTICA ENZIMÁTICA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL

FACULTAD DE BIOQUÍMICA Y CIENCIAS BIOLÓGICAS
Santa Fe, Argentina
 Cinética enzimática
• Estudia los factores que afectan la velocidad de las
reacciones químicas catalizadas por enzimas.
• Factores más importantes:
– [E]
– [S], [P], [A], [I]
– pH, fuerza iónica, temperatura
• Estos estudios son útiles para revelar:
– El mecanismo catalítico de una enzima
– El rol de una enzima en una determinada ruta metabólica
– El efecto de ciertas moléculas (activadores o inhibidores)
sobre la actividad de la enzima bajo estudio

https://www.youtube.com/watch?v=6cGdWi_DSGk
Primeras observaciones - Henri
 La ecuación de Henri
• La derivación de la ecuación de Henri (1903) se basa en:
– La enzima es un catalizador (Berzelius entre 1835 y 1837).
– E y S reaccionan rápidamente para dar el complejo ES, el cual da lugar
a E y P (Brown en 1902).
– Sólo se encuentran involucrados un S y un complejo ES para dar E + P.
– La E, el S y el complejo ES se encuentran en equilibrio, es decir, la
velocidad a la que ES se descompone en E + S es mucho más rápida
que la velocidad de formación de E + P. Esto se conoce como cuasi-
equilibrio o equilibrio rápido.
– La [S] es mucho más grande que la [E], con lo cual la formación de ES
no altera el equilibrio.
– El paso limitante de la reacción es la ruptura de ES para dar E + P.
– La velocidad se mide en los estados iniciales de la reacción, con lo cual
la reacción reversa es despreciable.
 La ecuación de Henri

𝐾 [S]
𝑣=
[S]
1 +
𝐾s

[S] = concentración de sustrato

v = velocidad inicial a una dada [S] (velocidad instantánea: d[P]/dt o -d[S]/dt)
k2 = constante cinética de ruptura de ES en E + P = kcat
Ks = constante de disociación del complejo ES = k-1 / k1 = [E] [S] / [ES]
K = una constante, característica de cada preparación enzimática = k2 [E]t / Ks
[E]t = concentración total de E = [E] + [ES]
La ecuación de Michaelis-Menten
 La ecuación de Michaelis-Menten
• Confirmaron el trabajo experimental de Henri en 1913 y
presentaron una ecuación de velocidad ligeramente diferente:

𝑘2 [E]t [S]
𝑣=
𝐾s + [S]

• Cuando toda la enzima se encuentra formando el complejo

ES, v = k2 [ES] = k2 [E]t = Vmax = velocidad máxima. Entonces:

𝑉max [S]
𝑣=
𝐾s + [S]
Derivación de la ecuación de M-M
 Limitaciones de la ecuación de M-M
• Cuando k2 es del mismo orden de magnitud que k-1 (lo cual se cumple para
muchas enzimas), la [ES] no depende solamente de [E], [S] y Ks.
• En este caso, la ecuación de velocidad se deriva a partir de un tratamiento
más exacto (estado estacionario).
• Sin embargo, el equilibrio rápido se usa por muchas razones:
– Es la técnica más simple para derivar ecuaciones de velocidad en ausencia de
datos previos sobre las constantes cinéticas.
– Es útil para sistemas multi-ligando luego de una simple inspección de los
equilibrios entre las diferentes especies enzimáticas.
– Si los datos se ajustan a la ecuación, entonces tendremos el mecanismo más
simple para el sistema. Si esto no ocurre, se pueden buscar alternativas más
complejas.
– Para muchas situaciones, los tratamientos de equilibrio rápido y estado
estacionario dan lugar a ecuaciones similares, aunque las constantes tienen
significados diferentes.
– La mayoría de las teorías sobre enzimas alostéricas se basan en supuestos de
equilibrio rápido. El análisis mediante estado estacionario arroja ecuaciones
demasiado complejas.
 La ecuación de Briggs-Haldane
• Desarrollada en 1925. Se basa en la observación de que el
complejo ES no necesita estar en equilibrio con E y S.
• Luego de un tiempo corto de reacción, la [ES] se acerca a
un valor cuasi-constante o de estado estacionario
(Bodenstein en 1913).
• Luego del período pre-estado estacionario, la formación y
descomposición de ES ocurrirán a la misma velocidad.
• Cuando k2 <<< k-1, entonces el nivel de ES en el estado
estacionario será similar al del equilibrio.
• Si k2  k-1 o k2 > k-1, entonces la [ES] será menor que en el
equilibrio.
• La velocidad de formación de P es proporcional a [ES] en el
estado estacionario.
 Supuestos en la ecuación de B-H

• A medida que la relación [S]0 / [E]t aumenta, el

supuesto de estado estacionario se torna más válido.
• Es decir, el intervalo de tiempo previo a d[ES] / dt  0
disminuye y el tiempo de reacción durante el cual la
d[ES] / dt  0 aumenta.
• Como la mayoría de los estudios enzimáticos in vitro se
realizan con concentraciones catalíticas de E (es decir,
muy bajas) y la v se calcula al utilizar sólo una pequeña
fracción de [S]0, entonces el supuesto del estado
estacionario es bastante válido.
 La ecuación de Briggs-Haldane

𝑉max [S]
𝑣=
𝐾m + [S]

[S] = concentración de sustrato

v = velocidad inicial a una dada [S] (velocidad instantánea: d[P]/dt o -d[S]/dt)
k2 = constante cinética de ruptura de ES en E + P
Km = k-1 + k2 / k1 = [E] [S] / [ES] = constante dinámica o de pseudo-equilibrio
que representa una relación entre las concentraciones en el estado
estacionario, no en el equilibrio
Vmax = k2 [E]t
[E]t = concentración total de E = [E] + [ES]
Derivación de la ecuación de B-H
 Relaciones entre M-M y B-H
• La ecuación de B-H es similar a la de M-M, pero las constantes
tienen otro significado.

𝑉max [S] 𝑉max [S]

𝑣= 𝑣=
𝐾s + [S] 𝐾m + [S]

• Las restricciones de M-M son un caso especial de B-H. Cuando k2

<<< k-1, entonces Km  k-1 / k1  Ks. En este caso Km es la constante
de disociación del complejo ES.

• Cuando k-1 <<< k2, entonces Km  k2 / k1. En este caso Km es una

constante cinética.
¿Qué medidas se realizan?
 Orden de reacción
V max
v [S] (orden uno)
Km

V max[S]
v (orden intermedio)
Km  [S]

v  V max (orden cero)

 Parámetros cinéticos

Constante Michaeliana
𝑘−1 + 𝑘2 𝑘−1 E [S]
(relacionada con la etapa 𝐾m = 𝑘1 ≅ 𝐾s = =
de unión del sustrato) 𝑘1 [ES]

Constante catalítica o
Vmax
número de recambio
kcat 
(relacionada con la
etapa catalítica)
Et

Eficiencia catalítica
(relacionada con ambas
etapas)
 Significado de Km

• La Km no depende del grado de pureza de la enzima.

• Km guarda relación con Ks, la constante de disociación del

complejo ES. Es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato; pero es la recíproca de tal afinidad: Km  Ks = 1 / Ka

• En el caso en que k1 y k-1 >>> k2, resulta que Km = Ks

• Km es la concentración de sustrato que se requiere para

alcanzar la mitad de la velocidad máxima (Vmax/2). Que Km sea
pequeña significa que el sustrato satura a la enzima a
concentraciones menores.
 Significado de Vmax
• Vmax es la velocidad cuando toda la enzima está como ES.

• Matemáticamente es una asíntota, de modo que

experimentalmente sólo se puede estimar Vmax (no se puede medir
con precisión).

• Se expresa en U/mg (µmol/min mg). Es un parámetro que debe

determinarse sobre la enzima pura.

• Depende de la [E]t (activa, ver kcat).

• Al igual que Km, la Vmax es una constante que depende de la

temperatura, del pH, de la fuerza iónica y demás condiciones del
medio.
 Significado de kcat
• Vmax = kcat [E]t > kcat = Vmax / [E]t

• kcat = k2, es la constante de velocidad de primer orden de la etapa

catalítica. Tiene unidades de recíproca de tiempo (s-1).

• kcat es el número de recambio o turnover number, que indica la

velocidad a la cual la enzima recambia sustrato.

• Es el número de moléculas de sustrato que son convertidas por sitio

catalítico por unidad de tiempo.

• También es un parámetro que depende de la temperatura, el pH, la

fuerza iónica y demás condiciones del medio.
 Significado de kcat/Km
• kcat/Km es la eficiencia catalítica. Sirve para establecer cuán buen
catalizador es una enzima. Si kcat/Km es elevada significa que la
enzima tiene relativamente alta afinidad para unir sustrato y que la
reacción de formación de producto a partir del complejo ES es
rápida.

• kcat/Km es una constante aparente de velocidad de segundo orden.

Tiene unidades de recíprocas de tiempo por concentración (s-1 M-1).

• kcat/Km es una constante de especificidad que puede utilizarse para

distinguir con qué grado de eficiencia una enzima puede utilizar
distintos sustratos o para comparar la eficiencia de varias enzimas
con el mismo sustrato.
Derivaciones lineales de la ecuación de M-M (B-H)

• Representaciones gráficas:
– Lineweaver–Burk o de los dobles recíprocos (1934).
Fue propuesta inicialmente en 1932 por Haldane y
Stern, por sugerencia de Woolf. Las [S] deben ser
cercanas al valor de Km. Inconveniente: la recta es
altamente dependiente de los valores de velocidad a
bajas concentraciones de sustrato, donde hay mayor
error experimental.
– Eadie-Hofstee
– Hanes-Woolf
– Eisenthal-Cornish-Bowden
Representación de Lineweaver–Burk
Representación de Eadie-Hofstee
Representación de Hanes-Woolf
Representación de Eisenthal-Cornish-Bowden
Comparación de los diferentes métodos
Valores de Km y kcat para algunas enzimas
 Enzimas alostéricas - Unión cooperativa
• Muchas enzimas son oligoméricas. Si las subunidades son
idénticas, cada una contiene un sitio catalítico.
• Si los sitios son idénticos y completamente independientes
del resto, entonces la presencia del sustrato en un sitio no
afectará la unión del sustrato a los otros sitios.
• En este caso, la curva de v vs. [S] será una hipérbola.
• En otras palabras, n moléculas en una E con un sitio dan el
mismo resultado que una molécula con una E con n sitios.
• Aunque no haya interacciones obvias entre los sitios, las
subunidades aisladas generalmente son inactivas.
• La formación del oligómero puede mejorar la geometría del
sitio activo y/o contribuir a la estabilidad de la enzima.
 Enzimas alostéricas - Unión cooperativa
• Si la presencia de un sustrato en un sitio influye en la unión de sustrato en
los sitios vacantes o sobre la velocidad de formación de producto en otros
sitios activos, entonces el sustrato actúa como modificador o efector,
dando lugar a procesos de activación o inhibición.
• En dicho caso, las curvas de v vs. [S] ya no serán hiperbólicas y la enzima
se clasifica como “alostérica”.
• Generalmente, las enzimas alostéricas dan curvas de v vs. [S] sigmoideas.
Es decir, la unión de una molécula de sustrato facilita la unión de la
siguiente molécula de S.
• Este fenómeno se llama unión cooperativa positiva o respuesta
homotrópica positiva.
• Las interacciones entre ligandos distintos (por ejemplo, sustrato e
inhibidor o sustrato y activador) se llaman respuestas heterotrópicas y
pueden ser positivas (activador) o negativas (inhibidor).
• En cualquiera de estos casos, la cinética ya no será michaeliana y la
expresión de la velocidad se torna más compleja.
Modelo simplificado para la velocidad de una enzima
alostérica con efecto cooperativo homotrópico
• Si se asume que la unión de S a un sitio modifica sólo la unión de S a los otros
sitios (pero no la constante catalítica), se puede demostrar que la velocidad
(expresada por moles de E) resulta igual a la función de unión multiplicada por
la constante catalítica:

v
 kcat
Et
• Si se adopta la ecuación de Hill para la función de unión:

nL
nH
  nH
k d  L
nH
• Al reemplazar [S] por [L] y Ks por kd, entonces la ecuación de velocidad queda:

kcat nS
nH
v
 nH
Et K s  S nH

• Si reagrupamos [E]t, kcat y n como Vmax, entonces:

𝑉max [S]𝑛H
𝑣=
𝐾s 𝑛H + [S]𝑛H

• De modo que las curvas de saturación de la función de unión y la de la

velocidad son proporcionales. Si lo que se analiza es la unión del sustrato:
– Si nH = 1, el comportamiento es michaeliano, y aunque existan múltiples sitios
de unión, no hay efectos cooperativos en la unión de S.
– Si nH > 1, la curva será de tipo sigmoidal y se asume que hay efectos
cooperativos positivos en la unión de S.
– Si nH < 1, la curva será una hipérbola no rectangular y se asume la existencia de
efectos cooperativos negativos en la unión de S.
 Consideraciones
v
• El supuesto de que  kcat
Et
es válido sólo si:

– La enzima presenta un equilibrio rápido de unión con el sustrato

– La unión del sustrato NO modifica la kcat
– Para una enzima monosustrato (o cuando los otros sustratos no influyen en la
unión, y por ende en el nivel de saturación, del sustrato en estudio)

• Fuera de estas condiciones, la utilización de la ecuación de Hill para

cinética enzimática es dudosa.
Forma lineal de la ecuación de Hill

𝑉max [S]𝑛H
1) 𝑣 =
𝐾s 𝑛H +[S]𝑛H

2) 𝑉max [S]𝑛H = 𝑣 𝐾s 𝑛H + 𝑣 [S]𝑛H

[S]𝑛H (𝑉max −𝑣)

3) = 𝐾s 𝑛H
𝑣

(𝑉max −𝑣)
4) 𝑛H log S + 𝑙𝑜𝑔 = 𝑛H 𝑙𝑜𝑔𝐾S
𝑣

𝑣
5) 𝑙𝑜𝑔 = 𝑛H log S − 𝑛H 𝑙𝑜𝑔𝐾S
(𝑉max −𝑣)
Gráfico de Hill para cinética enzimática

log Ks
log v/(Vmax-v)

log Ks

log [S]
 Diferentes usos del símbolo n
• n - Se refiere al número real de sitios de unión de ligando
(S) en una molécula (E). Se puede determinar mediante
estudios de equilibrio de unión. Para esto se usan los
gráficos de Scatchard: [S]unido / [S]libre [E]t. n se obtiene de la
intercepción con el eje de las abscisas. Esto es, moles de S
unido por mol de E a concentraciones saturantes de S.

• nH - Es la pendiente del gráfico de Hill. NO es el número real

de sitios. Suele ser menor que n.

• napp - Se calcula por métodos matemáticos o gráficos

distintos al gráfico de Hill. Generalmente es similar o
idéntico a nH.
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL
FACULTAD DE BIOQUÍMICA Y CIENCIAS BIOLÓGICAS
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