TEMA 5: CINÉTICA ENZIMÁTICA I

DEFINICIÓN

La cinética estudia la velocidad o tasa de reacción de una enzima, lo que es útil para:

- Entender un mecanismo enzimático.

- Medir como de bien el sustrato forma producto.
- Medir como de bien el sustrato se una a la enzima.
- Comparar la actividad enzimática en distintas condiciones.
- Comparar la actividad enzimática con distintos sustratos.
- Medir la cantidad de enzima que hay en la mezcla.
- Descubrir inhibidores enzimáticos.

ORDEN DE REACCIÓN

Es un parámetro que permite ver como depende la velocidad de reacción química

en función de otro parámetro como puede ser la concentración de sustratos.

En cinéticas de orden cero la tasa de reacción es independiente de la concentración

de sustrato. En cinéticas de orden uno la tasa de reacción es dependiente de la
concentración de sustrato de manera lineal (reacciones monosustrato). En cinéticas de
orden dos la tasa de reacción depende del cuadrado de la concentración de sustrato
(reacciones bisustrato). En cinéticas de orden tres la tasa de reacción depende del cubo de
la concentración de sustrato (reacciones trisustrato).

REACCIONES MONOSUSTRATO

Son las reacciones enzimáticas más sencillas de analizar cinéticamente, ejemplo de

ellos son las isomerasas, muchas liasas, hidrolasas (H2O considerado cte). En ellas la
determinación de la velocidad se hace en los primeros minutos de reacción.

−𝛿[𝑆] 𝛿[𝑃]
S ------> P v= =
𝑡 𝑡

La tasa de reacción de enzimas monosustrato fue estudiada por Leonor Michaelis y

Maud Menten en 1913, los que le llevo al enunciado de dos postulados:

1. En la catálisis hay 2 eventos. (1) La asociación reversible de la enzima y el sustrato;

y (2) la transformación del sustrato del centro activo a producto.

(1) E + S ⇄ ES (2) ES ⇄ E + P Es el paso más lento (cuello de botella); k3=Kcat

(1) → 𝑘1 y ← 𝑘2 (2) → 𝑘3
 Si asumimos que se produce la formación del complejo ES, fácilmente podemos
explicar el comportamiento de la velocidad de reacción en función de [S].

2. Durante el proceso catalítico distinguimos dos períodos, el pre-estacionairo y el

estacionario. El estado pre-estacionario dura pocos microsegundos y el resto del
tiempo corresponde al estado estacionario.

- Estado pre-estacionario: La cantidad de enzima libre es muy elevada y los

complejos ES se forman de forma rápida.
- Estado estacionario: Es el que ocurre cuando todas las enzimas están ocupadas. El
complejo ES es constante en el tiempo y por ello consideramos que es el estado
más estable y relativamente largo, además de ser el período en que se miden los
valores cinéticos (cinética del estado estacionario).

[𝑆]
La ecuación de Michaelis-Menten: 𝑣 = 𝑣𝑚á𝑥 𝐾 Deducción de la expresión youtube
𝑚 +[𝑆]

Características de la Km

Esta constante tiene unidades de concentración y es característica de cada enzima

para un sustrato en unas determinadas condiciones. Los valores se mueven en torno a 10 -3
y 10-6 M. Esta representa la concentración de sustrato para la que la enzima trabaja a la
mitad de la velocidad máxima o lo que es lo mismo, la concentración de sustrato para la
que la enzima está saturada a la mitad. Se corresponde con la constante de disociación del
complejo ES si:

𝒌𝟐 +𝒌𝟑
k3<<k2; 𝑲𝒎 = = 𝒌𝒅 Mide la afinidad de enzima por sustrato (A  Km  afinidad)
𝒌𝟏

Los valores próximos a la concentración fisiológica de sustratos son determinados

por Km, lo que es importante para la regulación. La Km de un enzima para un sustrato natural
siempre es menor que para sustratos análogos. La ecuación se cumple si:

- [P]<<[S] en velocidades iniciales, es decir, solo válida la ecuación en los momentos

iniciales de la reacción.
- Se alcanza el estado estacionario ([ES]=cte.)
- La concentración de enzima es mucho menor que la de sustrato.

Determinar Km y otros parámetros cinéticos

Esto se puede realizar a través de ensayos enzimáticos que determinen la velocidad

de aparición de productos o desaparición de sustratos a diferentes concentraciones de
sustrato.
Métodos de linearización

Son transformaciones matemáticas de una hipérbole a una recta del tipo Y = aX + b

y para realizar esto hay tres métodos:

 Lineweaver-Burk: Consiste en la obtención de dobles recíprocos a partir de la

ecuación de Michaelis-Menten:

1 𝐾𝑚 + [𝑆] 𝐾𝑚 1
= = +
𝑣 𝑉𝑚á𝑥 · [𝑆] 𝑉𝑚á𝑥 · [𝑆] 𝑉𝑚á𝑥

 Eadie-Hofstee: Deriva de la ecuación anterior multiplicando los dos términos por

Vmáx:

𝑣
𝑣 = −𝐾𝑚 + 𝑉𝑚á𝑥
[𝑆]
  Hanes: Derive de la ecuación de Lineweaver-Burk multiplicando ambos términos
por [S]:

[𝑆] [𝑆] 𝐾𝑚
= +
𝑣 𝑉𝑚á𝑥 𝑉𝑚á𝑥

Otras constates cinéticas son por ejemplo la constante catalítica (Kcat) que es el
número máximo de moléculas de sustrato que se pueden transformar por centro activo por
unidad de tiempo, también puede ser la capacidad de la enzima para transformar el sustrato
en productos. Las unidades en la que se mide es el s -1, se determina en condiciones de
saturación y se calcula con su fórmula.

La constante de especificidad o eficacia catalítica por otra parte es la relación entre

la constante catalítica y la de Michaelis-Menten, siendo Kesp=Kcat/Km, las unidades en la que
se mide es el M-1 · s-1 y los valores máximos que alcanza son de 108-109 M-1 · s-1. Da una idea
de la especificidad y si las condiciones son óptimas para realizar su función. Esta constante
puede ser muy alta si la catalítica es alta y la de Michaelis-Menten es muy baja.

REACCIONES BISUSTRATO

Están involucradas 2 moléculas en la reacción:

A +B E -----> P + Q + E

Con la formación de un complejo ternario (EAB) que puede ser ordenado o al azar o
sin esta formación (mecanismo ping-pong).

Ordenado

Se usa un diagrama de Cleland

Al azar

Sin formación del complejo ternario

Ej.: Acetilcolinesterasa

Si la enzima no tiene comportamiento de hipérbole no podemos aplicar lo que

aprendimos para las reacciones enzimáticas monosustrato. En el caso de las enzimas
bisustrato se produce una sigmoide que es el tipo de cinética propia de enzimas alostéricas.