UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

LABORATORIO DE BIOQUIMICA

Cintica enzimtica
Medicin de la Actividad Enzimtica (AE)
Factores que afectan la AE
Inhibicin enzimtica
Regulacin enzimtica
Problemas

Pedro Coila

Cintica enzimtica
Estudia la velocidad de las
reacciones enzimticas y los
factores que la afectan.
La Velocidad o Actividad
Enzimtica (AE) puede ser
determinado midiendo la
cantidad de S consumido
(o P formado) en una
unidad de tiempo bajo
condiciones adecuadas de
T y pH.

En la prctica es muy difcil determinar la cantidad de

enzima, ya que se encuentran en cantidades muy
pequeas y por que la mayora se encuentran
formando complejos. Tambin pueden existir enzimas
que no estn catalizando.
Por eso es ms fcil determinar la AE ya que es
directamente proporcional a su concentracin.

Expresiones de Actividad Enzimtica (AE)

La AE o velocidad de las enzimas puede ser expresado de
las siguientes formas:
Nomenclatura comn Unidades Internacionales de AE
(UI o U).- Son los micromoles de S
transformado (o P formado) en un
minuto (mol/min).
Nomenclatura SI Katal (kat).- Son los moles de S
transforma-do (o P formado) en un
segundo (mol/s). Se pueden usar
prefijos SI.
Problema: Cierta enzima cataliza a una velocidad inicial (vo) de
5,7 x 10-5 UI, exprese esta velocidad en katales y
microkatales.

Actividad molecular
ACTIVIDAD MOLECULAR = NUMERO DE RECAMBIO = CONSTANTE CATALITICA (Kcat)

Es el nmero de molculas de S transformado por una sola molcula

de enzima en un tiempo dado (min o s).

Enzimas

Sustrato

Catalasa

H2O2

Anihidrasa carbnica

HCO3-

Acetilcolinesterasa

kcat (s-1)

40,000,000

Acetilcolina

b-Lactamasa

Benzilpenicilina

Fumarasa

Fumarato

Protena RecA (ATPasa)

ATP

400,000
140,000

2,000
800
0.4

Factores que afectan la AE

Numerosos factores influyen en la velocidad de las
enzimas, entre ellas:
1. Temperatura
2. pH
3. Concentracin de enzima

4. Tiempo de incubacin
5. Inhibidores
6. Electrolitos y fuerza inica

7. Sustancias qumicas
8. Concentracin de sustrato

Velocidad de reaccin

1. Efecto de la temperatura
Vmx
Desnaturalizacin
de la enzima

T ptima

10

20

30

40

Temperatura (C)

50

60

70

A medida que aumenta la T

la AE tambin sube, pero
solo hasta cierto grado, ms
all de ese lmite, la enzima
se desnaturaliza.
Cada enzima tiene su propia T ptima, al cual tiene mxima AE.
Para la mayora de enzimas de mamferos la T ptima est entre
35 y 40C.

Velocidad de reaccin

2. Efecto del pH
Vmx

pH ptimo

pH

10

11

Cada enzima tiene

un pH ptimo, al
cual tiene mxima
actividad. Por
debajo y encima de
este pH la actividad
declina.

Los pH extremos generalmente inactivan a las enzimas.

Algunas enzimas tienen un pH ptimo amplio. P. ej. Sacarasa: 3 7,5 de pH
Cmo afecta el pH?
Modifica la ionizacin de ciertos grupos del sitio activo, del S o de
ambos.

100

150

Bajo condiciones
saturantes de S,
la velocidad de
reaccin, es
directamente
proporcional a la
[E].

50

Velocidad de reaccin

3. Efecto de la [E]

10

20

30

40

Concentracin de enzima (mM)

Luego, la recta declina

debido a:
- Deplecin del S
- Inhibicin por el P

Problema: Si una enzima cataliza a una vo = 2,7 x 10-3 UI

Cul ser su velocidad si la [E] se triplica?

Velocidad de reaccin

4. Efecto del tiempo de incubacin

10

20

Tiempo (min)

30

40

En los momentos iniciales, la

AE es directamente
proporcional al tiempo de
incubacin, pero solo hasta
cierto lmite.

VO tiempo
Luego, la AE declina debido a:
- Agotamiento del S
- Desnaturalizacin de la E
- Inhibicin por el propio P

5. Inhibidores enzimticos
Los inhibidores son sustancias orgnicas o inorgnicas que unidos
a la enzima disminuyen su AE.

6. Electrolitos y fuerza inica

Los iones (p.e. cationes) muchas veces son requeridos en el sitio
activo de la E.
La fuerza inica de la solucin en donde est la E influye en la AE
(salting in y sallting out)

7. Sustancias qumicas
La presencia de diversos qumicos afectan la AE, sobre todo:
-Agentes quelantes y
-Agentes reductantes

8. Efecto de la [S]
En 1912, en la Universidad de
Berln, los investigadores que
realizaron el primer estudio
(cintico y matemtico) del
efecto de la [S] sobre la
velocidad de las reacciones
enzimticas, fueron:
Leonor Michaelis y Maud
Menten
Ellos observaron que cuando se mantena constante la
[E], y se aumentaba progresivamente la [S] se obtena
una grfica hiperblica.

EXPERIMENTO DE MICHAELIS-MENTEN

S
+
E

80
60

AE (UI)

40
20

0
0

Sustrato (mol)

Inicialmente, la v aumenta proporcionalmente a la [S]

(cintica de primer orden), luego va disminuyendo
(cintica de orden intermedio) hasta que la velocidad
se hace constante, as haya fuerte [S] (cintica de
orden cero).

Grfica y ecuacin matemtica de la

hiprbola rectangular

Grfica y ecuacin enzimtica de la

hiprbola rectangular

Curva de Michaelis-Menten

Ecuacin de
Michaelis-Menten

Constante de
Michaelis-Menten

Velocidad mxima (Vmx)

Es la mxima velocidad de una reaccin enzimtica.
En este momento, todas las enzimas estn
trabajando (no hay enzima disponible).

Constante de Michaelis-Menten (Km)

Funcionalmente, es la [S] al cual se alcanza el 50% de la Vmx.
Es una medida de la afinidad de la enzima por un determinado S.
Todas las reacciones enzimticas tienen su Km caracterstico.
Cuanto > es la afinidad < es el valor de Km (y viceversa)

Si el Km es alto: menor velocidad

Si el Km es bajo: mayor velocidad
Problema: Cul es el S preferido
para la hexokinasa, cuyos
sustratos y Km se
muestran en la siguiente
tabla?

Sustrato
Galactosa
Fructosa
Glucosa
Manosa

Km (M)
1 x 10-1
1,6 x 10-3
8 x 10-6
5 x 10-6

NOTA: Los valores Km de muchas enzimas son prximos

a los de la concentracin fisiolgica de sus sustratos, de
forma que pequeas variaciones en la [S] pueden suponer
grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metablica.

En todo estudio enzimtico, los dos parmetros cinticos

que deben ser determinados son: Vmx y el Km.
Pero en la prctica, estos
dos parmetros no
pueden ser
determinados, en forma
exacta, utilizando la
grfica de MichaelisMenten, debido a:

La curva hiperblica realmente nunca llega a contactar con

la asntota de la curva (que es el valor de la Vmx).
Y, si no se conoce el verdadero valor de la Vmx, tampoco
se podr determinar el verdadero valor de Km.

Entonces, Cmo poder determinar exactamente estos dos

parmetros enzimticos (Km y Vmax)?
Frente al problema, muchos investigadores plantearon mtodos
matemticos (conocidos como ploteos) para resolver este
problema, entre ellos:
El Ploteo de Lineweaver-Burk
El ploteo de Eddie-Hofstee
El ploteo de Hanes-Woolf
El ploteo de Eisenthal y Cornish
Programas computarizados
Mtodos disponibles en:
http://www.sbu.ac.uk/biology/enztech/determination.html

Ploteo de Lineweaver-Burk (1934)

Tambin conocido como el ploteo del doble recproco.
El mtodo consiste en aplicar el recproco (inverso) a la ecuacin
de Michaelis-Menten (1/vo versus 1/[S]), obtenindose una recta.

Ploteo del doble recproco

Doble recproco

Ploteo directo

Vmax
vo

1
vo

1/2
-1
Km

1
Vmax

1/S

Km

Ejemplo de cintica enzimtica y ploteo de Lineweaver-Burk

Sustrato

Velocidad

Doble recproco

[S] Absorbance v (mmole/min)

0.25
0.21
0.42
0.50
0.36 0.72
1.0
0.40 0.80
2.0
0.46
0.92

No

1
2
3
4

Datos

Producto

1/S
4
2
1
0.5

1/v
2.08
1.56
1.35
1.16

1.0

Doble recproco

Ploteo Directo

(1) El producto fue medido por espectrofotometra a 600 nm para 0.05 por mol
(2) El tiempo de reaccin fue de 10 min

v
0.5

2.0

1/v

1.0

1.0

0
-4

[S]

-3.8

-2

Inhibicin enzimtica
Los inhibidores son sustancias (orgnicas o inorgnicas)
que al ser aadidos al medio donde est actuando una E
determinan su menor AE.

Modo de accin de los inhibidores

Los inhibidores se unen a la enzima lo que ocasiona la
prdida parcial o total de la AE formando los complejos
EI o ESI

Aplicaciones
El estudio de los inhibidores es importante por que proporciona
informacin sobre:
El mecanismo de catlisis enzimtica
La especificidad de la enzima
La naturaleza de los grupos funcionales del sitio activo

Aplicaciones del estudio de inhibidores:

Muchos compuestos actan inhibiendo ciertas
reacciones enzimticas; y, por lo tanto, de toda una va
metablica. Entonces, tiene aplicacin en:
Medicina.- Antiinflamatorios, analgsicos,
antibiticos, interferones, anticancergenos, etc
Agricultura.- Herbicidas, insecticidas, plaguicidas, etc.
Guerras biolgicas.- Gases nerviosos, venenos, etc.
Industria alimentaria
Biotecnologa, ect.

Tipos de Inhibicin
1. Inhibicin Irreversible.- Al retirar del medio el
inhibidor, la enzima no recupera su AE. Entonces, el
inhibidor ha destruido algn grupo funcional necesario
para la actividad cataltica de la E. A menudo la unin
la EI es covalente. Ejemplos:
- Los organofosforados inhiben a la acetilcolinesterasa.
- Agentes alquilantes como el yodoacetato (se unen a
SH)
- La penicilina inhibe enzimas que sintetizan la pared
bacteriana
- Los metales pesados (Pb, As, Hg) .

Tipos de Inhibicin
2. Inhibicin Reversible.- Si el inhibidor es retirado del
medio (por dilisis u otros medios) en donde est
actuando, la enzima recupera su AE. Entonces, se dice
que la E se ha reactivado. La unin EI es laxa. Existen 3
subtipos:
-Competitiva
-No Competitiva
-Acompetitiva

Inhibicin reversible (Mecanismo)

I

Competitiva

No competitiva

Ecuacones y Descripciones

Esquemas

Sustrato

E
I

Compiten por
Inhibidor el sitio activo
E + S
ES E + P
+
I

EI
[I] slo se une a [E] libre,
y compite con el [S];
incrementando la [S] se
revierte la Inhibicin.

Acompetitiva
E
I

Diferente sitio
E + S
ES E + P
+
+
I
I

EI + S EIS
[I] se une a [E] libre o al
complejo [ES] ; aumentando
la [S] no se revierte la inhib.

E + S
ES E + P
+
I

EIS
[I] slo se une al complejo
[ES], aumentando la [S] se
favorece la inhibicin.

Inhibicin enzimtica (Ploteos)

I

Competitiva

No competitiva

Ploteo de Lineweaver-Burk

Ploteo directo

Vmax

vo

vo

Km Km

[S], mM

Km = Km

Vmax disminuye
Km no cambia

1/vo

1/vo

Vmax

Vmax

Vmax

Km Km

[S], mM

Vmax y Km disminuyen
1/vo

Dos lneas
paralelas

Intersect
en el eje Y

1/ Vmax

1/Km

Acompetitiva

Vmax

[S], mM

Vmax no cambia
Km aumenta

1/[S]

Intersect
en el eje X

1/Km

1/ Vmax

1/[S]

1/ Vmax
1/Km

1/[S]

Ejemplo de un inhibidor competitivo

Domagk (1939)

Acido para-aminobenzoico (PABA)

H2N-

-COOH

La bacteria requiere PABA para

la biosntesis de cido flico

Acido
flico

Precursor

H2N-

-SONH2

Sulfanilamida

Acido
tetrahidroflico

Las sulfas tienen similar

estructura con el PABA e
Inhiben el crecimiento de
la bacteria..

Ejemplo de algunos inhibidores

aplicados en medicina
Droga
Lovastatina
5-fluouracil
Metrotexate
Alopurinol
Cumadin
Aspirina
Captopril

Uso teraputico
Hipercolesterolemia
Cncer
Cncer
Gota
Anticoagulante
Antiinflamatorio
Hipertensin art.

Enzima afectada
HMGCoA reductasa
Timidilato sintetasa
Dihidrofolato reductasa
Xantino oxidasa
Glutamil carboxilasa
Ciclooxigenasa
Enz.convert.angiotensina

Tipo de inhibidor
Competitiva
Irreversible
Competitiva
Irreversible
Competitiva
Irreversible
Competitiva

Regulacin enzimtica
El funcionamiento celular u orgnico requiere que todas las
reacciones estn controlados, de modo que las vas
metablicas estn activas en ciertos momentos e inactivas
en otros.
Todas las enzimas pueden ser reguladas por factores
como T, pH, [S], [E], cofactores, etc. Pero estos
factores en el organismo animal son casi constantes,
por lo que poco influyen en la regulacin.
Existen otros mecanismos intracelulares que permiten la
regulacin de la velocidad de las reacciones enzimticas

La regulacin enzimtica se refiere a la posibilidad que

tienen las enzimas de variar la velocidad de las
reacciones que catalizan al producirse determinados
cambios en el medio.
Existen dos tipos de enzimas especializadas
denominadas enzimas regulatorias (o moduladoras) que
intervienen en la regulacin del metabolismo y estn
ubicadas estratgicamente en las vas metablicas:
1. Las enzimas alostricas Regulacin Alostrica
2. Las enzimas reguladas por unin covalente
Regulacin Covalente

Ubicacin de las enzimas regulatorias

Generalmente, catalizan las

primeras reacciones,
permitiendo una regulacin de
una va desde el inicio (principio
de mxima economa)

1. Regulacin alostrica
Las enzimas alostricas presentan
2 sitios de unin funcionalmente
distintos y separados:
-Sitio activo.- Con actividad
cataltica, sierve la unin con el S.
-Sitio alostrico o regulador.- Sin
actividad cataltica, sirve para la
unin con una molcula efectora
(= efector, modulador o
regulador) por enlaces no
covalentes.

Tipos de efectores
1. Efectores negativos o inhibidores.- Disminuyen
la AE
2. Efectores positivos o activadores.- Aumentan la
AE

Si la enzima posee:
-Un solo efector (+ -) = monovalente
-Dos o ms efectores (+ -) cada uno con su
sitio = polivalente

Caractersticas de las enzimas

alostricas
1. Generalmente, son polimricas

Alto PM
2. No cumplen la clsica cintica

micheliana.

3. Presentan 2 estados interconformacionales

interconvertibles. Ambos estn en equilibrio.

- R (relajado).- Es activo. Tiene alta afinidad por el S
- T (tenso).- Es inactivo. Baja afinidad por el S

4. Pueden ser homeotrpicas (si su propio S acta

como efector) o heterotrpicas (si el efector es una
molcula distinta al S)
6. Son bastante inestables o lbiles

Mecanismo y ejemplo de regulacin alostrica

Cintica
R = Relajado
(activo)

Modelos

Cooperacin

Sitio alostrico

vo

(+)

[S]

(+)
vo
S

Sitio alostrico

Heterotrpico
(+)
Secuencial

Heterotrpico
(-)
Concertado

(+)

[S]

T
T = Tenso
(inactivo)

Homotrpico
(+)
Concertado

I
vo

(-)

(-)

T
[S]

2. Regulacin covalente
Son enzimas que presentan 2 formas interconvertibles, con
diferente composicin, lo que origina cambios
conformacionales en la molcula (estructura 3ria o 4ria).
En la mayora de los casos, las 2 formas de la enzima
slo se diferencia en la presencia de un grupo fosfato el
cual se une covalentemente a la protena. Entonces, las
formas seran:
1. Forma fosfatada o
forma a
2. Forma no
fosfatada o forma
b

Las kinasas: Son enzimas

que agregan el grupo
fosfato proveniente del
ATP.
Las fosfatasas: Son las
enzimas que retiran el
grupo fosfato.
Las 2 formas difieren en su grado
de actividad, siendo una muy
activa y la otra poco activa.
Algunas veces la forma a es la
activa y en otros casos la forma
b.

Regulacin covalente (por fosforilacin)

Fischer, Kreb (1978)

OH

Kinasa
(fosforilacin)

Protein

Fosfatasa

Conformational
Change

(defosforilacin)
Glycogen phosphorylase b

Glycogen phosphorylase a

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