Métodos de separación y purificación de enzimas

Para fines científicos es importante purificar un preparado de enzimas para llegar lograr
extraer las enzimas indeseables. Cada tipo de enzima y tejido requieren un tipo de tratamiento
distinto.

Métodos de aislamiento

1.Molienda con abrasivos:

Ruptura de la pared celular por tensión y corte (mortero y pistilo).

1.2. Congelación y descongelación:

La congelación causa una tensión en la membrana celular (ruptura) y la descongelación causa

la fusión del hielo (homogenato crudo).

1.3. Largos períodos de mezclado:

Se rompe por la colisión entre las paredes del mezclador .

1.4. Adición de perlas de vidrio durante el mezclado:

Amentar el esfuerzo mecánico.

1.5. Enzimas hidrolíticas:

Las proteasas y lipasas forman poros o huecos, donde las células y organelos rotos pueden ser
puestos en solución.

1.6. Homogenización ( Homogenizador Potter- Elvenhjem):

El tejido al ser homogenizado es picado y mezclado (solución isotónica).

1.7. Soluciones hipotónicas:

Las células se revientan por la absorción de agua (hinchazón).

1.8. Vibraciones ultrasónicas:

Alteración de la células y formación de un homogenato

1.9. Alteración del pH de la solución:

Causa la coagulación de las proteínas, formando poros , por donde las células rotas exudan un
homogenato.

1.10. Solventes orgánicos:

Se emplean para disolver los lipídicos conduciendo a la formación de poros.

Métodos de purificación

2.1. Por el tamaño o masa

2.1.1. Centrifugación

-Se utiliza en moléculas grandes y pequeñas

- Remueve los restos celulares después de la homogenización

- La centrifugacion zonal

- Separa no solo proteínas, macromoléculas sino también organelos y virus.

2.1.2. Filtración en gel

-.Se utiliza en moléculas pequeñas

- Es un metodo de separación dependiente del tamaño molecular

- Características del gel

- Debe ser químicamente inerte

- Debe tener un número pequeño de grupos iónicos

- Debe tener poro y el tamaño de la partícula uniformes.

- Alta rigidez mecánica

- Los geles más usados son:

- Dextranos entrecruzados (Sephadex)

- Geles poliacrilamida

-Geles de agarosa

- Styragel

-Perlas de vidrio de poro controlado

2.1.3. Diálisis o ultrafiltración

- La membrana de diálisis (celofán) se usa para separar proteínas globulares o moléculas

(200000) Da.

- El método es usado para separar pequeñas moléculas orgánicas, sales y solventes orgánicos
de los extractos crudos.

- En la ultrafiltración las pequeñas moléculas e iones pasan por la membrana de diálisis bajo la
influencia de presión

2.2. Por la carga

2.2.1Cromatografía de intercambio iónico

-Moléculas grandes y pequeñas

- Intercambio reversible de iones en solución, con iones enlazados a un medio de soporte

inerte.

-Es útil en la separación de compuestos cargados y no cargados.

2.2.2. Electroforesis

- Moléculas pequeñas

- Es la migración de moléculas cargadas en un medio

- La movilidad electroforética se afecta por:

- Carga: A mayor carga, más grande es la movilidad

- Tamaño: Las partículas grandes se mueven más lentamente que las pequeñas

- Forma: Los contornos redondos generan menor retardo friccional

- Electroforesis de zona

- En la separación, las moléculas son inmovilizadas mediante fijación en diferentes zonas y son
detectadas tiñiendolas

- Métodos para detectar las moléculas separadas

2.2.3. Enfoque isoeléctrico

- Tiene un alto poder de resolución y resuelve en al menos 40 bandas

- El pH se incrementa gradualmente del ánodo al cátodo

- El electroenfoque se realiza por tres vías

- Gradiente de densidad

- Geles

-Electroenfoque de convección de zona

2.3. Por el cambio de solubilidad

2.3.1. Cambio de pH

- El ajuste del pH se usa para precipitar la enzima

2.3.2. Cambio en fuerza iónica

-A altas concentraciones de sal, la concentración de agua se reduce

- Disminuyendo las interacciones soluto-solvente y la solubilidad de las proteínas

2.3.3. Disminución en la constante dieléctrica

-Al añadir solventes solubles en agua disminuirá la constante dieléctrica e incrementará las
fuerzas electrostáticas

2.4. Por sitios de enlazamiento específico

2.4.1. Cromatografía de afinidad

- Enlazamiento específico no covalente de las enzimas con moléculas ( ligandos)

2.4.2. Elución de afinidad

- Es más ventajosa que la cromatografía de afinidad

- Reacciones complejas de enlazamiento

- Las columnas son más baratas