CRISTALIZACION DE PROTEINAS PROTEINAS Las proteínas son compuestos químicos muy complejos que se encuentran en todas las células

vivas: en la sangre, en la leche, en los huevos y en toda clase de semillas y pólenes. Hay ciertos elementos químicos que todas ellas poseen, pero los diversos tipos de proteínas los contienen en diferentes cantidades. En todas se encuentran un alto porcentaje de nitrógeno, así como de oxígeno, hidrógeno y carbono. En la mayor parte de ellas existe azufre, y en algunas fósforo y hierro. Las proteínas son sustancias complejas, formadas por la unión de ciertas sustancias más simples llamadas aminoácidos, que los vegetales sintetizan a partir de los nitratos y las sales amoniacales del suelo. Los animales herbívoros reciben sus proteínas de las plantas; el hombre puede obtenerlas de las plantas o de los animales, pero las proteínas de origen animal son de mayor valor nutritivo que las vegetales. Esto se debe a que, de los aminoácidos que se conocen, que son veinticuatro, hay nueve que son imprescindibles para la vida, y es en las proteínas animales donde éstas se encuentran en mayor cantidad. El valor químico (o "puntuación química") de una proteína se define como el cociente entre los miligramos del aminoácido limitante existentes por gramo de la proteína en cuestión y los miligramos del mismo aminoácido por gramo de una proteína de referencia. El aminoácido limitante es aquel en el que el déficit es mayor comparado con la proteína de referencia, es decir, aquel que, una vez realizado el cálculo, da un valor químico mas bajo. La "proteína de referencia" es una proteína teórica definida por la FAO con la composición adecuada para satisfacer correctamente las necesidades proteicas. Se han fijado distintas proteínas de referencia dependiendo de la edad, ya que las necesidades de aminoácidos esenciales son distintas. Las proteínas de los cereales son en general severamente deficientes en lisina, mientras que las de las leguminosas lo son en aminoácidos azufrados (metionina y cisteina). Las proteínas animales tienen en general composiciones mas próximas a la considerada ideal. El valor químico de una proteína no tiene en cuenta otros factores, como la digestibilidad de la proteína o el hecho de que algunos aminoácidos pueden estar en formas químicas no utilizables.. Sin embargo, es el único fácilmente medible. Los otros parámetros utilizados para evaluar la calidad de una proteína (coeficiente de digestibilidad, valor biológico o utilización neta de proteína) se obtienen a partir de experimentos dietéticos con animales o con voluntarios humanos.

Tanto la nucleación del cristal como el crecimiento ocurren en soluciones supersaturadas donde la concentración de proteína es mayor que su valor de solubilidad en equilibrio. La solvatación es un factor vital para la cristalización de macromoléculas. La cristalización se produce cuando.La característica principal de un cristal es su estructura interna periódica y ordenada en tres dimensiones. se logra a altas concentraciones de macromoléculas y a valores crecientes de parámetros de solución reductores de la solubilidad macromolecular. La formación de un cristal de proteína macroscópico que contiene hasta 1015 moléculas. una soluble y una sólida. bajo ciertas condiciones (de supersaturación). el sistema se dirige hacia el estado de equilibrio entre dos fases. 1. la inclusión de aditivos tales como . por tanto. Una vez formado un núcleo estable (nucleación). cristalizan minimizando su energía libre al disponerse periódicamente en unidades repetitivas y simétricas en el estado sólido. En soluciones extremadamente concentradas. establecen al mismo tiempo nuevas interacciones. sin embargo. Las moléculas. la cristalización de moléculas es un fenómeno espontáneo y reversible cuyos parámetros cinéticos y termodinámicos dependen de las propiedades químicas y físicas del solvente y del soluto involucrados. A pesar de que las moléculas individuales pierden libertad rotacional y translacional. Para ello pueden aplicarse distintos métodos que se diferencian por las condiciones y solutos que emplean. El hecho de que un sistema renuncie a sus grados de libertad parece una contradicción desde el punto de vista entrópico y. Para lograr que las moléculas tengan oportunidad de formar el mayor número de interacciones favorables con los vecinos se modifican las propiedades del solvente con agentes precipitantes o se alteran algunas propiedades físicas como la temperatura. disminuyendo así la entropía del sistema. Esto reduce la energía libre del sistema y provée la fuerza directriz del proceso de ordenamiento. empieza con la aparición de agregados de proteína mediante contactos intermoleculares (agregación). Para decidir el método mejor para cristalizar una proteína determinada debemos entender los fundamentos de la cristalización. las moléculas pueden o bien agregar como un precipitado amorfo o bien cristalizar (figura 1). En general. donde no hay agua suficiente para mantener la hidratación. La región del parámetro de solución aconsejable para la cristalización viene recogida en el diagrama de fase (figura 2). La supersaturación es una función de la concentración de la macromolécula y de diversos parámetros que afectan su solubilidad. La estrategia para inducir la cristalización consiste en llevar al sistema hacia el estado de mínima solubilidad lentamente y lograr así un grado limitado de supersaturación. maximizando las interacciones intermoleculares favorables. el crecimiento prosigue por la adición de moléculas a la red cristalina. Estos agregados prenucleares eventualmente alcanzan el tamaño nuclear crítico. MÉTODOS PARA CRISTALIZAR La determinación de la estructura cristalográfica empieza con el crecimiento de un cristal adecuado. Los factores que pueden influir en la solubilidad proteica son por ejemplo.

Esto ocurre porque el vapor de agua de la gota que contiene la proteína se deshidrata buscando el equilibro con la solución de reserva más higroscópica. La diferencia es que en este método la composición de la solución es alterada difundiendo componentes de bajo peso molecular a través de una membrana semi-impermeable. Esto se muestra en el diagrama de fase donde la región de supersaturación es además dividida en regiones de más alta supersaturación (región lábil) donde tanto el crecimiento como la nucleación ocurren y la disminución de supersaturación (fase metastable) donde sólo se alcanza el crecimiento. Las condiciones dentro de una solución que contiene proteína son manipuladas mediante la difusión a través del aire (figura 3). Como con los otros métodos de cristalización. Separación del proceso de nucleación y crecimiento. el objetivo inicial es formar núcleos. y posteriormente cambiada para disminuir la supersaturación y permitir solo el crecimiento. Como los métodos de baño. la nucleación ocurre cuando se aumenta la concentración de proteína por medio de la reducción del volumen de la solución. que varía generalmente como una curva asimétrica en forma de campana indicando que la solubilidad decrece tanto a altas como a bajas concentraciones de sal. Parámetros de la solución tales como pH o temperatura también pueden afectar dramáticamente a la solubilidad macromolecular. Estos métodos se basan en la capacidad de alcanzar condiciones de nucleación transitoria o local en una solución suficientemente supersaturada. que por el contrario promueve sólo el crecimiento. Métodos de cristalización que permiten nucleación transitoria y localizada en soluciones supersaturadas que promueven sólo el crecimiento. Métodos de diálisis. pudiendo causar la precipitación macromolecular. catalasa y citocromo c554. La técnica puede miniaturizarse sumergiendo gotas pequeñas de proteína dentro de un aceite inerte. El método de cristalización más simple. Dado que las condiciones ideales para la nucleación y crecimiento difieren. Como muestra la figura 3. una técnica donde los cristales son transferidos de condiciones de nucleación a aquellas que sólo soportan el crecimiento. Métodos de difusión de vapor. Otro factor que influye sobre la solubilidad proteica es la presencia de sal.alcoholes. En este método. Los métodos de cristalización en baño (“batch”) consisten mezclar y dejar reposar todos los componentes en una sola solución. Este método funciona bien con la lisozima de huevo. polímeros hidrofílicos y detergentes que puedan disminuir la solubilidad proteica. una vez que se han alcanzado las condiciones de nucleación. Las condiciones de supersaturación óptimas para la nucleación y para el crecimiento del cristal son diferentes. la concentración macromolecular permanece constante durante la cristalización por diálisis. La temperatura de la solución es inicialmente ajustada para inducir la nucleación. la solución permanece altamente . Estos son agentes precipitantes ya que influyen en la solubilidad. una estrategia lógica de cristalización involucra la optimización separada de esos procesos. Esto puede lograrse por siembra (“seeding”).

de modo que puede producirse simultáneamente la nucleación y el crecimiento de cristales. Figura 2. (g) factor de elongación Tu. incluso la disminución de concentración de macromolécula debido a la formación de núcleos o precipitados. El hecho que la mayoría de gotas de difusión de vapor no estén llenas de cristales microscópicos sugiere que el alto grado de supersaturación que motiva nucleación no es mantenido a lo largo del experimento de cristalización. La curva de supersolubilidad (líneas entrecortadas) divide además la región supersaturada en condiciones de más alta supersaturación donde compiten la nucleación y crecimiento (fase lábil) y niveles menores donde sólo crecerán . se han diseñado métodos para alcanzar muy lentamente el equilibrio. Algunos cristales de proteínas crecidos mediante una variedad de técnicas y usando diferentes agentes precipitantes. (b) fructosa 1. (c) proteína de unión a cortisol.6-difosfatasa. Diagrama de fase. (i) proteína de desenrollamiento de DNA. (f) proteína de función desconocida de piña. (e) catalasa de hígado. Figuras Figura 1. (j) glicerol 3-fosfato deshidrogenasa. A pesar que dentro de un marco teórico pareciera que las condiciones no son óptimas para cristalizar una proteína. Para evitar que los valores de supersaturación excedan los requeridos para la nucleación. (k) canavalina. La curva de solubilidad (sólida) divide el espacio de fase en regiones que promueven el proceso de cristalización (soluciones supersaturadas) de aquellas donde se disolverá el cristal (soluciones insaturadas).supersaturada. (a) catalasa de hígado. la incorporación en cristales crecientes o la desnaturalización macromolecular en la interfase solución-aire podría disminuir la concentración proteica a valores menos propicios para la nucleación y más adecuados para el crecimiento. (d) concanavalina. la difusión de vapor por gota colgante (“hanging drop”) y gota posada (“sitting drop”) son amplia y muy exitosamente usados para el crecimiento de cristales de proteína. Varios factores. (h) tRNA fenilalanina.

por medio de vapor de la gota y el reservorio. como un ácido liberando protones y quedando (-COO'). los grupos -NH2 captan protones. los aminoácidos muestran un comportamiento anfótero. El equilibrio. las soluciones de proteína que contienen precipitante insaturado (indicado en el diagrama de fase por círculos abiertos) son suspendidos sobre un reservorio. o como base . o pueden aparecer como ácido y base a la vez. es probable que cambios en la concentración de la gota disminuyan la supersaturación a lo largo del tiempo del experimento (círculos sólido de izquierda). quedando como (-NH3+ ). a mayores concentraciones macromoleculares. causa que la solución de la proteína alcance un nivel de supersaturación donde ocurren la nucleación y el crecimiento inicial (círculos sólidos). Por ejemplo mayores concentraciones de sal (mayores valores de este parámetro reductor de solubilidad) son necesarias a menores concentraciones macromoleculares. apareciendo una forma dipolar iónica llamada zwitterion . Como se ve en el texto.cristales (fase metastable). Diagrama esquemático de la cristalización por difusión de vapor. ocurre la supersaturación a medida que los valores de parámetros reductores de solubilidad disminuyen. En este caso los aminoácidos se ionizan doblemente. Figura 3. Como se muestra. En este método de cristalización. En disolución acuosa. es decir pueden ionizarse. dependiendo del pH.

de algún modo. según alguno de estos procesos: Precipitación (por evaporación del agua de una disolución). la tendencia de las moléculas a depositarse en las superficies compuestas por moléculas semejantes produce un notable incremento en la pureza del material cristalino obtenido" (Pasto J. Si posteriormente se fuerza un incremento paulatino de concentración y se controlan las condiciones normalmente se generan diminutos núcleos cristalinos cuyo lterior crecimiento puede dar lugar a cristales de tamaño adecuado para los experimentos de difracción (entre 0. fundamentalmente.1 y 0. con la intención de reducir la solubilidad de la proteína y generar una precipitación controlada de la misma. Cuanto mejores sean las condiciones. sublimación (paso de gas a sólido).CRISTALIZACION La cristalización es un proceso por el cual esos átomos. El experimento de cristalización comienza con una solución de proteína relativamente concentrada (entre 2 y 50 mg/ml) a la que. No es objeto de estas páginas hacer una presentación exhaustiva de las diferentes técnicas de cristalización que se pueden encontrar en muchos libros de texto o en diferentes páginas web. 2003) La formación de cristales minerales tiene lugar en la naturaleza. solidificación (paso de líquido denso a sólido por enfriamiento) En todos los casos se requieren las adecuadas condiciones de espacio y tiempo. a los que se añade a veces carbón activo como absorbente de las impurezas" (Hans Beyer. . "No es raro conseguir una sustancia pura después de varias recristalizaciones en distintos solventes. iones o moléculas se ordenan de tal forma que llegan a constituir cristales (formas geométricas que podemos apreciar a simple vista). mayores serán los cristales que se obtengan. La purificación de moléculas por cristalización está basada en la diferencia de solubilidad que presenta en distintos disolventes o en una mezcla de ellos.5 mm). se le añade lentamente algún reactivo. manifestación visible de la estructura cristalina de sus componentes. Daniel. "Si el proceso de cristalización se conduce en condiciones de casi equilibrio. y sólo nos detendremos brevemente en algunas de las técnicas más extendidas que se usan para obtener cristales de proteínas. 1987) La cristalización es el proceso mediante el cual las moléculas se ordenan de un modo natural formando un retículo repetitivo que denominamos cristal.

. • Filtración de la solución en caliente para eliminar las partículas insolubles o impurezas • Enfriamiento de la solución para permitir que cristalice el compuesto • Separación de los cristales de las aguas madres por filtración • Determinación del punto de fusión del compuesto para comprobar su pureza • Repetición del proceso en caso de no haber conseguido la pureza deseada Las características que debe presentar el disolvente para la cristalización son las siguientes: • Gran poder de disolución de la sustancia a su temperatura de ebullición pero bajo a temperatura ambiente • Bajo poder de disolución de las impurezas • Permitir la formación de buenos cristales de la sustancia • Facilitar una buena separación de los cristales.El proceso de cristalización conlleva las siguientes etapas: • Disolución de la molécula impura en un disolvente a la temperatura de su punto de ebullición o próxima a ella.

Como resultado de este proceso. todas ellas basadas en alcanzar de una forma u otra un grado de sobresaturación de la disolución de proteína de forma que se formen unos pocos núcleos a partir de los cuales crecerán los cristales. GOTA COLGANTE El método más común para estos experimentos es el basado en la técnica de la gota colgante. El cubre-objetos que contiene a la gota de mezcla se le da la vuelta y con él se tapa el pocillo mencionado. . En el mercado existen cajas que contienen un número elevado de estos pocillos (24 o más). al cual previamente se le ha equilibrado su pH mediante un tampón. de tal modo que se puedan etiquetar y almacenar con facilidad para su ulterior observación a través de una lupa-microscopio. la concentración de la proteína y del precipitante aumentarán lentamente en la gota. tal como se muestra en la figura de abajo. se formarán cristales. DIALISIS La diálisis es en método de separación liquido liquido similar a la ósmosis porque son dos líquidos de diferente concentración separados por una membrana semi permeable que en que la solución mas concentrada atraviesa la membrana para diluirse con la menos concentrada y así estar ambas concentraciones con la misma concentración. el agua de ésta se evaporará. Este sistema cerrado evolucionará por equilibrio de vapor y como la mezcla de proteína y precipitante en la gota está menos concentrada que la solución de precipitante en el pocillo. y si las condiciones son las adecuadas.Técnicas de cristalización de proteínas Existen varias técnicas para cristalizar las proteínas. uniéndose a la solución del pocillo. GOTA SENTADA Es el mismo proceso que la gota colgante pero esta se encuentra en la base del posillo. Se colocan unos pocos microlitros (1-2 μl) de la solución de proteína en el centro de un cubre-objetos de vidrio y se le añaden otros tantos microlitros de la solución del precipitante contenido en un pocillo.