UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE QUMICA

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

EXAMEN TERICO-PRCTICO DETERMINACIN DE MICROORGANISMOS CONTAMINANTES EN UNA MUESTRA DE COCTEL DE FRUTAS

EQUIPO 5

ARANDA GONZLEZ MARA MONTSERRAT SOLIS BAEZ ILSE TORIZ GUERRERO PAOLA
GRUPO: 01

Fecha de entrega: 21 de mayo del 2012

OBJETIVOS

Aplicar adecuadamente las tcnicas tanto cualitativas como cuantitativas para la deteccin de microorganismos causantes de intoxicaciones alimentarias. Conocer el tipo de microorganismos, que debido al manejo de la muestra y al tipo de ingredientes que la conforman, puede contener. Decir si el alimento es apto para consumo humano, en base a las NOMs correspondientes y en los microorganismos que sea posible cuantificar, expresar la cantidad de UFCs/gramo de alimento. Explicar si el alimento y sus ingredientes fueron tratados con higiene durante todo el proceso de coccin, elaboracin y preparacin.

METODOLOGA Y FUNDAMENTO DE LA METODOLOGA La muestra asignada fue un cocktel de frutas por lo tanto los microorganismos que se decidieron analizar y el fundamento se mencionan a continuacin: Cuenta de mesfilos aerobios Esto es para determinar la cantidad total de microorganismos que contiene la muestra. En general es para saber si el proceso de preparacin y los manipuladores estn teniendo una correcta higiene al interactuar con la muestra. Como es un cocktel de frutas, hay demasiada interaccin con los ingredientes, se necesita pelarlos, cortarlos, etc y si en dichos pasos de la preparacin no se hace con higiene puede existir la contaminacin de la muestra. Cuenta de coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por NMP Esta tcnica la hacemos ya que la contaminacin por coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli es por transmisin fecal-oral. Las frutas es muy probable que hayan sido regadas con aguas tratadas as que si no hubo un perfecto lavado y desinfectado de las frutas al preparar el cocktel es casi seguro que al final del proceso de preparacin el cocktel est contaminado con dichos microorganismos. La deteccin de estos microorganismos es muy importante ya que es muy frecuente encontrarlos en diferentes tipos de alimentos y son causantes de la mayor cantidad de enfermedades gastrointestinales. Deteccin de Salmonella spp Este microorganismo al encontrarse en el tracto intestinal de humanos tambin es de transmisin oral-fecal. Por lo tanto las frutas tambin pueden ser fuentes de salmonelosis humana debido a la fertilizacin de los sembrados con lodo sin tratamiento pero sobre todo el riego de las frutas con

aguas negras y que no sean lavadas y desinfectadas de manera adecuada como sucede con los coliformes. A continuacin se explica la metodologa a seguir para la deteccin y/o cuantificacin de cada uno de los microorganismos a detectar: Cuenta de mesfilos aerobios 1.- Pesar 10 gramos de muestra de manera homognea (un poco de todos los ingredientes) y homogenizar con 90 mL de solucin amortiguadora de fosfatos o agua peptonada. Dicha solucin es la dilucin 10-1. 2.- Realizar 3 diluciones decimales ms (10-2, 10-3 y 10-4) empleando tubos con 9mL de solucin amortiguadora de fosfatos o agua peptonada y transfiriendo 1 mL de la dilucin 10-1 al primer tubo con solucin y del primer tubo se toma 1 ml y se transfiere al segundo tubo y as sucesivamente hasta conseguir las 3 diluciones. 3.- Depositar 1 mL de cada dilucin en cajas Petri estriles por duplicado. 4.- Adicionar de 15 a 20 mL de agar triptona-glucosa-extracto de levadura (agar para cuenta estndar) fundido y enfriado a 45C en cada caja Petri. 5.- Homogenizar la muestra y el agar mediante movimientos rotatorios. 6.- Incubar las cajas en posicin invertida cuando ya hayan solidificado a 37C por 24-48 horas. 7.- Contar aquellas placas que tengan entre 25 a 250 UFC y reportar como UFC/ gramo de muestra. Nota se describe la tcnica de vertido en placa, pero tambin es posible realizar la tcnica de extensin superficial. Los pasos 1 y 2 son iguales la diferencia es que en las placas Petri ya debe estar el agar de cuenta estndar solidificado y por lo tanto se inocula 0.1 ml igual por duplicado por cada dilucin y se extiende con una varilla en L estril. Las cajas tambin se incuban invertidas a 37C de 24.48 horas y tambin se cuentan las placas que tengan entre 25 a 250 y se reporta como UFC/ gramo de muestra. Cuenta de coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por NMP 1.- Pesar 10 gramos de muestra de manera homognea (un poco de todos los ingredientes) y homogenizar con 90 mL de de agua peptonada al 0.1% o solucin amortiguadora de fosfatos. Dicha solucin es la dilucin 10-1. 2.- Realizar 2 diluciones ms (10-2 y 10-3) en tubos con 9 ml de agua peptonada al 0.1% o solucin amortiguadora de fosfatos. De la dilucin 10-1 se toma 1 ml y se transfiere al tubo 2, de dicho tubo se toma 1 ml y se transfiere al tubo 3.

3.- Sembrar por triplicado con asada simple cada dilucin en tubos de caldo lauril sulfato de sodio (1X). Dejar incubar a 35C por 24-48 horas. 3.- De los tubos positivos despus de la incubacin (que presenten crecimiento y gas) sembrar con asa bacteriolgica en caldo lactosa verde brillante bilis 2% y en caldo EC. Los tubos con caldo lactosa verde brillante bilis 2% se dejan incubar a 35C por 24-48 horas y los tubos con caldo EC se dejan a 44C de 24-48 horas. 4.- A partir de los tubos positivos de caldo lactosa verde brillante bilis 2% reportat NMP de coliformes totales / gramos de muestra y de los tubos positivos de caldo EC reportat NMP de coliformes fecales / gramo de muestra. 5.- Para realizar la prueba confirmativa de Escherichia coli se toma una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y se siembran por estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento. Incubar a 35C por 18-24 horas. 6.- Seleccionar de cada placa colonias sospechosas de ser Escherichia coli para realizarles las pruebas bioqumicas IMVIC. Deteccin de Salmonella spp 1.- Pesar 25 gramos de muestra de manera homognea (un poco de todos los ingredientes) y homogenizar con 225 mL de caldo lactosado. Incubar de 18-24 horas a 37C. 2.- Sembrar con asa bacteriolgica en caldo tetrationato, Vassiliadis y caldo selenito cistina. Incubar 18-24 horas a 37C. 3.- Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (XLD, SS, Hecktoen, VB y sulfito bismuto). Cada medio dividirlo en 3 para sembrar proveniente de los 3 caldos que sembramos al principio. Incubar las cajas 18-24 horas a 37C. 4.- En las cajas buscar las colonias tpicas para Salmonella y de dichas colonias sembrar en las pruebas bioqumicas presuntivas Kigler y Lia. Incubar las pruebas 18-24 horas a 37C. 5.- Si los resultados son caractersticas para Salmonella sembrar las pruebas bioqumicas complementarias (malonato, citrato, RM-VP, urea, SIM y manitol). Dejar incubar 18-24 horas a 37C. 6.- Determinar o no la presencia de Salmonella spp en la muestra.

RESULTADOS Cuenta de mesfilos aerobios por la tcnica de vertido en placa en ACST Dilucin Resultados

>250

>250

160

74

Por lo tanto mesfilos aerobios igual a 16x104 UFC/g Caractersticas morfocoloniales y microscpicos de una colonia aislada en medio ACST Descripcin macroscpica Colonia blanca redonda y plana Descripcin microscpica Cocos en forma de racimo Gram (+)

Cuenta del grupo Coliforme en placa Dilucin Resultados

>250

>250

>250

196

Por lo tanto coliformes totales igual a VE 20x105 UFC/g Caractersticas morfocoloniales y microscpicos de una colonia aislada en medio ABRV Descripcin macroscpica Colonias redondas butirosas y rojas Descripcin microscpica Bacilos cortos Gram ()

Cuenta de hongos Dilucin Resultados

Por lo tanto hongos igual a hongos VE 10 UFC/ g Descripcin macroscpica Descripcin microscpica Colonia verde de aspecto aterciopelado Se observa un conidiforo junto con conidiosporas unidas al esterigmata.

Cuenta de levaduras
Dilucin Resultados

Por lo tanto levaduras igual a VE < 10 UFC/ g Determinacin de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la tcnica de diluciones en tubo mltiple (NMP) Prueba presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio): Dilucin Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

+ + +

+ + +

+ + +

Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales (caldo bilis verde brillante):

Dilucin Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

+ + +

+ + +

+ + +

Por lo tanto coliformes totales igual a VE > 1100 NMP / gramo de coctel de frutas Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales (caldo EC)
Dilucin Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

+ + +

+ + +

+ + +

Por lo tanto coliformes fecales igual a VE > 1100 NMP/gramo de coctel de frutas A partir del caldo EC realizamos un aislamiento en medio EMB. Los datos microscpicos y macroscpicos son los siguientes:

Descripcin macroscpica Descripcin microscpica

Colonias redondas de color morado-vino Bacilos cortos Gram ()

Aislamos nuevamente en medio TSA para purificar y realizar pruebas bioqumicas (IMVIC) y tira API 20E. Los datos microscpicos y macroscpicos son los siguientes: Descripcin macroscpica Descripcin microscpica Colonias redondas de color beige Bacilos cortos Gram ()

Pruebas bioqumicas IMVIC:

Prueba Indol Rojo de Metilo Voges Proskauer Citrato Resultado + +

Tiras Api 20E: Beta galactosidasa (ONPG) Arginina deshidrolasa (ADH) Lisina descarboxilasa (LDH) Ornitina descarboxilasa (ODC) Utilizacin del citrato (CIT) Produccin de H2S (H2S) Ureasa (URE) Triptfano + + Gelatinasa (GEL) Fermentacin/oxidacin de glucosa (GLU) Fermentacin/oxidacin de manitol (MAN) Fermentacin/oxidacin de inositol (INO) Fermentacin/oxidacin de sorbitol (SOR) Fermentacin/oxidacin de ramnosa (RHA) Fermentacin/oxidacin de sacarosa (SAC) Fermentacin/oxidacin + + +

+ -

+ + + +

desaminasa (TDA) Produccin de indol (IND) Produccin de acetoina - Voges Proskauer (VP)

de melobiosa (MEL) Fermentacin/oxidacin de amigdalina (AMY) Fermentacin/oxidacin de arabinosa (ARA)

+ +

Mtodo para la determinacin de Salmonella en la muestra Primero realizamos un preenriquecimiento en caldo lactosado, posteriormente un enriquecimiento en caldo tetrationato y caldo selenito-cistina. Las caractersticas de los caldos de enriquecimiento son las siguientes:
Caldo Selenito- cistina Tetrationato Resultado Presento una coloracin ms opaca gracias a la turbidez causada por el crecimiento microbiano El caldo se volvi turbio

Despus realizamos aislamientos en los medios selectivos diferenciales XLD, Hektoen y sulfito bismuto a partir de los caldos selenito-cistina y tetrationato. Las caractersticas microscpicas son las siguientes: Nota El primer cuadro es en el medio XLD, el segundo cuadro es en el medio Hektoen y el tercer cuadro corresponde al medio sulfito bismuto. Caractersticas macroscpicas (A partir de caldo selenito-cistina) Caractersticas microscpicas (A partir de caldo selenito-cistina) Caractersticas macroscpicas (A partir de caldo tetrationato) Caractersticas microscpicas (A partir de caldo tetrationato)

Colonias redondas amarillas brillantes

Bacilos cortos Gram ()

Colonias redondas amarillas brillantes

Bacilos cortos Gram ()

Caractersticas macroscpicas (A partir de caldo selenito-cistina) Caractersticas microscpicas (A partir de caldo selenito-cistina) Caractersticas macroscpicas (A partir de caldo tetrationato) Caractersticas microscpicas (A partir de caldo tetrationato)

Colonias redondas amarillas Bacilos cortos Gram ()

Colonias redondas anaranjadas Bacilos cortos Gram ()

Caractersticas macroscpicas (A partir de caldo selenito-cistina) Caractersticas microscpicas (A partir de caldo selenito-cistina) Caractersticas macroscpicas (A partir de caldo tetrationato) Caractersticas microscpicas (A partir de caldo tetrationato)

Colonias redondas verdes

Bacilos cortos Gram ()

Colonias redondas verdes

Bacilos cortos Gram ()

Ya que en ningn medio se presento el crecimiento caracterstico de Salmonella tomamos una colonia del medio XLD y una de Hektoen, purificamos en el mismo medio y seleccionamos 2 colonias, una de cada medio, y realizamos pruebas bioqumicas as como tira Api 20E. Las caractersticas microscpicas de dichas colonias se mencionan a continuacin: Medio XLD: Caractersticas macroscpicas Caractersticas microscpicas Medio Hektoen: Caractersticas macroscpicas Caractersticas microscpicas

Colonias redondas y amarillas brillantes Bacilos cortos Gram (-)

Colonias redondas y amarillas Bacilos cortos Gram (-)

Pruebas bioqumicas: Prueba Glucosa Lactosa H2S Glucosa Lisin H2S Colonia 1 + Voges proskauer Urea Indol Movilidad H2S Malonato Manitol Tiras Api 20E: Beta galactosidasa (ONPG) Arginina deshidrolasa (ADH) Lisina descarboxilasa (LDH) Ornitina descarboxilasa (ODC) Utilizacin del citrato (CIT) Produccin de H2S (H2S) Ureasa (URE) Triptfano desaminasa (TDA) + + Gelatinasa (GEL) Fermentacin/oxidacin de glucosa (GLU) Fermentacin/oxidacin de manitol (MAN) Fermentacin/oxidacin de inositol (INO) Fermentacin/oxidacin de sorbitol (SOR) Fermentacin/oxidacin de ramnosa (RHA) Fermentacin/oxidacin de sacarosa (SAC) Fermentacin/oxidacin de melobiosa (MEL) + + + + + Colonia 2 + -

Kligler LIA

Rojo de metilo

SIM

+ + -

+ + + +

Produccin de indol (IND) Produccin de acetoina - Voges Proskauer (VP)

Fermentacin/oxidacin de amigdalina (AMY) Fermentacin/oxidacin de arabinosa (ARA)

+ +

Mtodo para de determinacin de Staphylococcus aureus en la muestra Se realizo un enriquecimiento en agua peptonada estril al 0.1% para posteriormente realizar un aislamiento selectivo en agar Baird Parker. Dilucin Resultados

>150

>150

207

63

La totalidad de colonias desarrolladas en las placas de todas las disoluciones presentaban las caractersticas coloniales tpicas de Staphylococcus aureus en agar Baird Parker. Por lo tanto:

Caractersticas microscpicas

Caractersticas morfocoloniales

Nmero total de colonias sospechosas en una caja representativa 63 UFC

Colonias sospechosas a caracterizar bioqumicamente 5

Cocos en forma de racimos Gram (+)

Colonias negras circulares, brillantes, convexas, lisas con un halo claro alrededor de la colonia.

Resultados de las pruebas bioqumicas que realizamos a 5 colonias diferentes sospechosas:

Colonia Prueba bioqumica Presencia de la enzima coagulasa Presencia de la enzima termonucleasa Fermentacin de manitol en anaerobiosis Catalasa

Determinacin de el numero de UFC toxignicas que hay en 1 gramo de alimento: 5UFC---------100% 5UFC---------X X=100% 63UFC------0.0001g X------1g X=630000 UFC/g de coctel de frutas Por lo tanto cantidad de S. aureus es igual a 63x104 UFC/gramo de coctel de frutas. 630000UFC/g----------100% X----------100% X= 630000UFC/g Por lo tanto cantidad de S. aureus enterotoxignica es igual a 63x104 UFC enterotoxignicas /gramo de coctel de frutas.

ANLIS DE RESULTADOS El objetivo del examen terico-prctico que realizamos fue determinar si la muestra obtenida es apta o no para consumo humano. Adems de tratar de identificar mediantes pruebas bioqumicas tradicionales y tiras Api 20E del microorganismo o de los microorganismos que fueron inoculados en la muestra. La muestra que se utiliz fue un coctel de frutas que se compr un da antes en la noche y que inmediatamente que se adquiri fue puesto en refrigeracin para evitar el crecimiento de microorganismos que no tuvieran nada que ver con el proceso de preparacin y elaboracin de la muestra. La primera parte consisti en la determinacin de los microorganismos indicadores de calidad, as que hicimos pruebas para determinar mesfilos aerobios, coliformes totales, hongos y levaduras. Para los mesfilos aerobios se realizaron 4 diluciones (10-1, 10-2, 10-3 y 10-4) a partir de 10 gramos de la muestra y 90 ml de agua petonada. A partir de dichas diluciones se inoculo 1ml en cajas petri estriles y se agrego agar triptona fundido y enfriado. Se homogenizo la muestra y se dejo incubar de 24 a 48 horas a 37C. Se utiliza este medio ya que en el agar cuenta estndar se facilita el crecimiento de dichos microorganismos por la presencia de peptona de casena que proporciona compuestos nitrogenados as como aminocidos. El extracto de levadura aporta vitamina B y la dextrosa es la fuente de energa. Como no es un medio diferencial o selectivo, lo que se cuenta es el nmero total de microorganismos en la muestra principalmente de bacterias mesoflicas aerobias. Y de esta manera podemos obtener la cantidad de dichas bacterias y saber si el alimento entra o no en el rango. Para la determinacin de coliformes en placa a partir de las diluciones previamente hechas se inoculo tambin 1 ml en cajas Petri y se agrego agar bilis rojo violeta con doble capa para crear condiciones de anaerobiosis. Se dejo incubar 24 horas a 37C. El agar bilis rojo violeta es un medio selectivo para la cuantificacin, como ya se mencion, de microorganismos coliformes totales. Las sales biliares y el cristal violeta del medio inhiben el desarrollo de microorganismos Gram positivos. El medio es selectivo, ya que todos los microorganismos entricos poseen la capacidad de fermentar la lactosa, pero dichos organismos formaran colonias incoloras, rosas o rojas por el vire del indicador rojo neutro a comparacin de los microorganismos coliformes que aunque tambin son capaces de fermentar la lactosa formaran colonias rojo prpura con halo de precipitacin de sales biliares. Por lo tanto las sales biliares es lo que nos permite la diferenciacin entre microorganismos solo entricos de los coliformes. Como nosotras si obtuvimos colonias rojas con halo de precipitacin en dicho medio, sabemos que tenemos la presencia de coliformes en la muestra y por lo tanto por eso tambin podemos obtener el conteo numrico de dichos microorganismos. Ahora para la cuenta de hongos y levaduras se vuelven a utilizar las diluciones previamente hechas y se inocula 1 ml en cajas Petri estriles pero se agrega de agar papa dextrosa. Dicho medio se

utiliza ya que la infusin de papa se utiliza como fuente de almidones y la dextrosa son la base para el crecimiento de hongos y levaduras. El bajo pH (3.5) que se logra aadiendo cido tartrico evita el crecimiento de las bacterias. Se deja incubar de 3 a 5 das a 28C. Al trmino de la incubacin se cuentan la cantidad de levaduras y hongos obtenidos para poder determinar el cmputo de las mismas. Ya que se tiene el conteo de los microorganismos indicadores de calidad tambin se realizo la tcnica del nmero ms probable para la deteccin de coliformes totales, fecales y ver la posible presencia de Escherichia coli. A partir de la primera dilucin realizada para la determinacin de los microorganismos indicadores se inoculo 1 ml en tres tubos con caldo lauril sulfato de sodio, esto es para la prueba presuntiva dejando incubar de 24-48 horas a 35C. Se utiliza dicho caldo ya que el caldo lauril sulfato de sodio es un medio selectivo que nos permite slo el crecimiento de microorganismos coliformes totales. Este medio esta adicionado de lactosa ya que los microorganismos que pertenecen a la familia de las Enterobacterias tienen la capacidad de fermentar la lactosa produciendo gas. El lauril sulfato de sodio nos inhibe el crecimiento de fauna indeseable. De esta manera si observamos presencia de gas y turbidez en los tubos sembrados proseguimos a la siguiente parte que es la prueba confirmativa de coliformes totales y de coliformes fecales. Como a nosotras los 3 tubos nos resultaron positivos ahora sembramos en caldo verde bilis brillantes para los coliformes totales dejando incubar de 24 a 48 horas a 35C, esto debido a que el caldo verde bilis brillante es un medio selectivo para la confirmacin del grupo coliforme ya que la bilis y el verde brillante son capaces de inhibir el crecimiento de fauna indeseable y hasta de algunos microorganismos capaces de fermentar la lactosa, diferentes a las Enterobacterias. Por lo tanto si hay presencia de gas en los tubos podemos decir que hay presencia de microorganismos coliformes y podemos establecer el nmero ms probable de coliformes totales sobre gramo de muestra. Para los coliformes fecales sembramos en medio EC dejando incubar 24 horas a 44.5C es importante respetar dicha temperatura ya que si no se respeta es posible que estemos cuantificando de nuevo coliformes totales en lugar de fecales. El caldo EC tambin es un medio selectivo para determinar la presencia de coliformes y de coliformes fecales. Este medio simplemente se basa en la fermentacin de la lactosa y las sales biliares inhiben el crecimiento de dems microorganismos que no sean Enterobacterias o Escherichia coli. Como hubo produccin de gas en los 3 tubos podemos afirmar la presencia de algn coliforme fecal ya sea E. coli o Klebsiella spp. Para identificar de que microorganismos coliforme fecal se trataba se realizaron pruebas IMVIC a alguna colonia aislada que se obtuvo primero de un aislamiento en medio EMB y a partir de ah otro aislamiento en medio TSA. Se utilizo el medio EMB ya que es un medio ligeramente selectivo y diferencial para el aislamiento de microorganismos entricos ya que permite una diferenciacin muy clara entre las colonias de organismos fermentadores de lactosa y aquellos que no la fermentan; el contenido de

eosina y azul de metileno inhiben en cierto grado organismos Gram positivos. La presencia de sacarosa permite para algunos miembros del grupo coliforme fermentarla con ms facilidad que la lactosa. Las colonias lactosa positiva son azules a moradas con brillo metlico o poseen centros oscuros con periferias transparentes incoloras y las que son negativas en lactosa o sacarosa, se observan incoloras o rosa plido transparentes. Como obtuvimos colonias color moradas reiteramos la presencia del algn coliforme fecal en la muestra pero si dichas colonias hubieran tenido un color metlico sera casi segura la presencia de E. coli en la muestra. Despus de aqu se tomo una colonia asilada y despus de comprobar la pureza (en microscopio slo debe de existir un solo tipo de Gram y morfologa) se sembr en medio TSA para que a partir de ah realizar las pruebas IMVIC y tiras API 20E. Es posible observar que los resultados de las tiras API coinciden con las pruebas IMVIC y por los resultados que arrojan las pruebas IMVIC se puede decir que hay presencia del coliforme fecal Klebsiella spp. Pero debido a que las pruebas, por los mltiples das feriados que se atravesaron, no fueron revisadas el da que necesitaban ser revisadas, los resultados no pueden ser correctos en su totalidad. Por lo tanto slo diremos que hay presencia de coliformes fecales en la muestra. Otra cosa que es importante recalcar es que hay coherencia en lo que esta prueba nos arroja con la prueba de determinacin de coliformes en placa, ya que la segunda prueba nos dice de la existencia de coliformes en la muestra mientras que la primera prueba nos dice tambin de la presencia de coliformes en la muestra y ya ms especfico de coliformes fecales pudiendo ser E. coli o Klebsiella spp. Tambin se realizo la metodologa para determinar o no la presencia de Salmonella en la muestra. Para esta tcnica ya no se pudieron utilizar de las diluciones previamente hechas ya que primero se requiere de un enriquecimiento en caldo selenito-cistina y caldo tetrationato para restaurar las clulas daadas por el tratamiento y manejo que ha recibido la muestra y a partir de ah se siembra en medios diferenciales que va a ser el primer paso que nos va a permitir decir si hay presencia o no de Salmonella, todo esto es debido al aspecto de las colonias. A partir del agar XLD se obtuvieron colonias amarillas esto nos indica que no hay presencia de Salmonella ya que el gnero Salmonella desarrolla colonias rojas con centro negro por la produccin de cido sulfhdrico y nosotras obtuvimos de colonias color amarillo que por las caractersticas del medio podran ser E. coli, Klebsiella, Enterobacter y algunas especies de Proteus ya que pueden utilizar ms de un carbohidrato y por esta razn hay formacin de colonias amarillas. En el medio Hektoen para poder decir que hay presencia de Salmonella se necesita de colonias verdes-azuladas con o sin centro negro, como nosotras obtuvimos colonias naranjasrosadas podemos decir una vez ms que no hay presencia de Salmonella y dichas caractersticas de colonias que obtuvimos vuelven a coincidir con las caractersticas de los coliformes. Por ltimo para el medio sulfito-bismuto necesitbamos de colonias negras o

con centro negro para decir de la presencia de Salmonella pero en cambio obtuvimos colonias verdes que nuevamente nos confirma de que tenemos un microorganismo coliforme ya que por las caractersticas de dicho medio, este tipo de microorganismos genera colonias verdes. An as sin tener colonias sospechosas le realizamos las pruebas bioqumicas tradicionales slo para confirmar que no se trataba de Salmonella, y como era de esperarse los resultados de las pruebas bioqumicas ms caractersticas no coinciden en su totalidad con los resultados que debe de arrojar Salmonella. Una vez ms vemos coherencia con los resultados del tipo de colonias que creci en las placas para Salmonella con los que se ha obtenido con la tcnica de NMP y la cuenta de coliformes en placa. El ltimo microorganismo a detectar y cuantificar fue Staphylococcus aureus. A partir de las diluciones que realizamos para el conteo de los microorganismos indicadores se puede inocular 0.1 ml en agar Baird Parker para despus con una varilla en forma de L distribuir el inculo y poder detectar la presencia o no, y si hay presencia poder obtener la cantidad de E. aureus y en su defecto de E. aureus enterotoxignica. Se utiliza del agar Baird Parker ya que cuenta con piruvato de sodio y glicina que estimulan selectivamente el crecimiento de Staphylococcus aureus. El cloruro de litio y el telurito actan como inhibidores de microorganismos contaminantes. Debido a la reduccin del telurito a teluro Staphylococcus aureus desarrolla colonias negras que es lo que nos permite observar el desarrollo caracterstico del microorganismo en cuestin. La peptona, el extracto de carne y el extracto de levadura son la fuente de carbono y el azufre y el nitrgeno la fuente de vitaminas y minerales respectivamente. Todas las cajas de las diluciones se dejan incubar de 24-48 horas a 37C. A partir de aqu se cuentan las colonias negras para poder determinar a cuantas colonias diferentes se les hace las pruebas bioqumicas (coagulasa, termonucleasa, manitol en anaerobiosis y catalasa). En nuestro caso fue necesario hacerle pruebas a 5 colonias diferentes y de esas 5 colonias las 5 dieron positivas para las pruebas termonucleasa y coagulasa as que se trata de una cepa enterotoxignica. De esta manera al tener colonias negras en agar Baird Parker y salir positivas en las pruebas bioqumicas de termonucleasa y coagulasa podemos afirmar la presencia de S. aureus en la muestra. CONCLUSIONES En base a las tcnicas realizadas de la muestra (coctel de frutas) podemos decir que: Tenemos la presencia de Staphylococcus aureus enterotoxignica en la muestra con una cantidad de 63x104 UFC enterotoxignicas /gramo de coctel de frutas. No tenemos la presencia de Salmonella spp en la muestra. Contamos con una cantidad de mesfilos aerobios de 16x104 UFC/g

Contamos con una cantidad de coliformes totales de VE 20x105 UFC/g obtenidos por la tcnica de conteo en placa Contamos con una cantidad de hongos de VE 10 UFC/ g que al ser muy poco descartamos que haya sido inoculado en nuestra muestra, ms bien creci por alguna contaminacin o por venir directamente de la muestra. Segn las caractersticas microscpicas se trata de Penicillium spp. Contamos con una cantidad de levaduras de VE < 10 UFC/ g Contamos con una cantidad de coliformes totales de VE > 1100 NMP / gramo de coctel de frutas obtenido por la tcnica de NMP. Contamos con una cantidad de coliformes fecales de VE > 1100 NMP/gramo de coctel de frutas obtenido por la tcnica de NMP. A partir de las pruebas bioqumicas IMVIC y de las tiras API 20E nos arroja el resultado que se nos inoculo el coliforme fecal Klebsiella spp. pero como ya se mencion anteriormente hubo muchos das feriados y eso evito que las pruebas se revisaran el da que realmente deba ser as que los resultados obtenidos no pueden ser del todo correctos as que se concluir de la presencia de un coliforme fecal, ya sea Klebsiella spp. o Escherichia coli. Es importante destacar que en el desarrollo de toda la prctica siempre hubo coherencia en los resultados obtenidos pudindose observar en la gran cantidad de coliformes que se obtuvo por el mtodo en placa y por el mtodo en el NMP y por que en los medios diferenciales de Salmonella se obtuvieron colonias que correspondan a coliformes. Si no supiramos que la muestra fue inoculada, es evidente que no sera apta para consumo humano ya que se necesita que no haya presencia de coliformes ni de Salmonella y ni de S. aureus enterotoxignica y una muy pequea cantidad de mesfilos aerobios, hongos y levaduras. BIBLIOGRAFA Madigan, Michael. et.al., Brock Biologa de los Microorganismos. Editorial Pearson Addison Wesley. 12 Edicin. Mxico. 2009. Manual de Microbiologa Experimental de la Facultad de Qumica. Camacho, Alejandro. et.al. Tcnicas para el anlisis microbiolgico de alimentos. Editorial de la Universidad Nacional Autnoma de Mxico. http://www.dibico.com Consultado el da: 20-05-2012