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PRCTICA DE LABORATORIO DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y Escherichia coli

INTRODUCCIN El agua potable de suministro pblico y de uso domiciliario debe estar libre de microorganismos patgenos, minerales y sustancias orgnicas que puedan producir efectos fisiolgicos adversos; adems, debe ser estar exenta de turbidez, color, olor y sabor desagradables (Borchardt y Walton, 1971). En Venezuela, el Decreto 883, promulgado en el ao 1995, hace referencia a Normas para la Clasificacin y el Control de los Cuerpos de Agua y Vertidos o Efluentes; en l se presenta lo concerniente al rango de medicin y control de los parmetros para el agua potable. La Norma Covenin 3047:1993. Agua Potable. Mtodo de Determinacin del Nmero Ms Probable de Bacterias Coliformes contempla el mtodo de ensayo de rutina para la determinacin del Nmero Ms Probable de Bacterias coliformes. La Norma Covenin 1104:1996, Determinacin del Nmero Ms Probable de Coliformes, Coliformes Fecales y de Escherichia coli (2da Revisin), contempla el mtodo de ensayo para la determinacin del Nmero Ms Probable (NMP) de bacterias Coliformes, Coliformes Fecales y de Escherichia coli en alimentos mediante la utilizacin de medios lquidos. Los aspectos contemplados en estas normas deben ser tomados en cuenta para el control y monitoreo de la calidad del agua de consumo. La tcnica del Nmero ms Probable o NMP para el contaje de Coliformes Totales, Coliformes Fecales y Escherichia coli, a travs del mtodo de dilucin en tubos mltiples, adems de estar contemplado en las Normas COVENIN 3047:1993 y 1104:1996, est sealado en el Standard Methods bajo el cdigo 9221B y para Escherichia coli el cdigo 9223 (APHA y col., 2005).

OBJETIVOS Determinar los organismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli en una muestra de agua. Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante la indagacin coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli. Realizar el informe de las actividades. de los

FUNDAMENTO La determinacin de microorganismos coliformes totales por la tcnica del Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35 C, durante 48 h, utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. En esta tcnica los resultados de la fermentacin en tubos mltiples se expresan en trminos de Nmero Ms Probable (NMP) de microorganismos existentes. La determinacin de NMP consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio, el cual permite la activacin de los microorganismos en la muestra que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo bilis verde brillante, el cual es selectivo y slo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la fase presuntiva en la cual se emplea como medio de cultivo caldo bilis verde brillante el cual es selectivo y slo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44,5o C por un perodo de 24 a 48 h. La Escherichia coli se determina a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por extensin en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina

azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioqumicas bsicas del IMVIC (Indol, Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato) a las colonias tpicas.

PROCEDIMIENTO 1. Prueba presuntiva Agitar la muestra y transferir 1mL (y/o sus diluciones) en cada uno de los 10 tubos volmenes con caldo lauril sulfato de sodio. Agitar los tubos para homogeneizar la muestra. Incubar los tubos a 35 0,5 C. Examinar los tubos a las 24 h y observar si hay formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa produccin de gas, incubar 24 h ms. Observar nuevamente y considerar como tubos positivos, aquellos que presenten gas en la campana de Durham.

2. Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a otro tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante, con campana de Durham. Agitar los tubos para su homogeneizacin. Incubar a 35 0,5 C durante 24 a 48 h. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h. Consultar la Tabla de NMP para conocer el nmero ms probable de organismos coliformes totales/100 mL.

3. Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de Durham. Agitar los tubos para su homogeneizacin.

Incubar a 45 0,2 C en incubadora o un bao de agua durante 24 a 48 h. Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h. Consultar la tabla de NMP para conocer el nmero ms probable de organismos coliformes fecales/ 100 mL.

4. Prueba confirmativa para Escherichia coli Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento. Incubar las placas invertidas a 35 1 C por 18-24 h. Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metlico. Si no hay colonias con morfologa tpica, probar una o ms colonias lo ms parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar de conteo estndar para realizar las pruebas de morfologa microscpica y pruebas bioqumicas. Incubar las placas a 351 C por 18-24 h. Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos.

4. Identificacin bioqumica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC). a. Produccin de indol (I) Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35 C por 24 2 h. Adicionar entre 0,2 y 0,3 mL de reactivo de Kovacs. La presencia de un color rojo oscuro en la superficie del tubo se considera una prueba positiva.

b. Produccin de cidos mixtos (Rojo de metilo, RM) Inocular (1 mL) a un tubo adicional con caldo RM-VP e incubar a 35 C por 48 2 h. Adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo.

Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo es una prueba negativa.

c. Produccin de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP) Inocular (1 mL) a un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35 C por 48 2 h. Adicionar 0,6 mL de solucin alfa naftol al 5% y 0,2 mL de solucin Hidrxido de Potasio al 40% agitar. Dejar reposar durante 2 a 4 h sin agitar el tubo; se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.

d. Utilizacin del citrato (C) Inocular un tubo con agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se inocula en lnea recta en el centro del bisel (pico de flauta). Incubar a 35 C de 24 a 48 h. El desarrollo del cultivo en la superficie y la presencia de una coloracin azul, debido al viraje del indicador que contiene el medio, indica prueba positiva.

CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS Calcular la densidad microbiana con base en el nmero ms probable conforme al procedimiento sealado en la Tabla 1, (que se muestra a continuacin y es utilizado para el anlisis de agua), para estimar la poblacin de bacterias coliformes totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia coli de acuerdo con el nmero de tubos positivos. Expresar en NMP/100 mL. Utilizando volmenes 10 mL de muestras de agua en 10 tubos, aplicar la Tabla 1:

TABLA 1. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua.
No. de Tubos Positivos 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NMP/100 mL <1,1 1,1 2,2 3,6 5,1 6,9 9,2 12 16,1 23 <23 95% de Lmite de Confianza (aproximado) Inferior Superior 0 3 0,03 5,9 0,26 8,1 0,69 10,6 1,3 13,4 2,1 16,8 3,1 21,1 0,4 27,1 5,9 36,8 8,1 59,5 13.5 Infinito

Tabla 2. Requisitos Microbiolgicos para el agua potable segn la Norma COVENIN 1431:1982 para NMP
Producto Agua Potable Anlisis Coliformes Mtodo de n Referencia DTM 10 c 1 Lmite por 100 mL m M 0 4

n: Nmero de muestras del lote, c: Nmero de muestras defectuosas, DTM: Mtodo de Dilucin en Tubos Mltiples (NMP), m: Lmite Mnimo, M: Lmite Mximo.

Tabla 3. Perfil bioqumico de pruebas IMViC para Escherichia coli


Microorganismo E. coli Indol + Rojo de Metilo + Voges-Proskauer Citrato -

EQUIPOS Y MATERIAL Autoclave. Horno de aire caliente o estufa para esterilizacin. Destilador de agua. Potencimetro o cinta de pH universal. Frasco de vidrio estril y de boca ancha para el muestreo. Equipo de bao Mara con una temperatura estable a 44,5 0,2 C Incubadora a 35 0,5 C.

Mechero Bunsen. Tubos de 16 x 150 milmetros (o de mayor medida) con tapones de vaquelita. Tubos Durham. Pipetas serolgicas de 10 mililitros. Asa de inoculacin con aro de nquel, cromo o platino. Material para la preparacin de medios de cultivo: esptulas, matraces, probetas,

SOLUCIONES Y MEDIOS DE CULTIVO Caldo lauril sulfato (caldo lauril triptosa) a doble concentracin (para la prueba presuntiva del grupo coliformes). Caldo verde brillante lactosa bilis 2% a concentracin simple para la prueba confirmativa de coliformes totales (en funcin de que todos los tubos presuntivos den resultados positivos). Caldo EC para la prueba confirmativa de coliformes termotolerantes (en funcin de que todos los tubos presuntivos den resultados positivos). Agua destilada para la preparacin de los medios.

PREPARACIN DE MATERIAL Preparar el caldo lauril triptosa (lauril sulfato) doble concentracin y dispensar segn el volumen de muestra que se va a sembrar (en este caso 10 mL), de tal manera que las porciones de muestra inoculadas al medio no reduzcan la concentracin de ingredientes del medio, la cual debe mantenerse constante. En cada tubo colocar un tubo Durham invertido y esterilizar en autoclave. Tener la precaucin de que en el momento de iniciar la prueba no estn a la temperatura de refrigeracin y cuidar de que ninguno de los tubos presente burbujas producidas en el momento del autoclavado. Proceder al marcado de los tubos, anotando el nmero designado por el laboratorio, el volumen seleccionado de muestra que va a ser inoculado y la fecha del anlisis. Esta marcacin podr hacerse solamente en el primer tubo de la derecha en la primera fila.

Si se van a emplear diluciones, identificar los frascos de agua de dilucin con el nmero de muestra y las diluciones seleccionadas.

PREPARACIN DE LAS MUESTRAS COVENIN 1126-89. Alimentos. Identificacin y Preparacin de Muestras para el Anlisis Microbiolgico (1ra Revisin).

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES Covenin 1104:1996. Determinacin del Nmero Ms Probable de Coliformes, Coliformes Fecales y de Escherichia coli (2da Revisin).

BIBLIOGRAFA Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed. Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiologa Mdica de Jawetz. Pelczar COVENIN 1431:1982. Agua Potable Envasada. Requisitos. COVENIN 3047:1993. Agua Potable. Mtodo de Determinacin del Nmero Ms Probable de Bacterias Coliformes. COVENIN 1104:1996. Determinacin del Nmero Ms Probable de Coliformes, Coliformes Fecales y de Escherichia coli (2da Revisin). COVENIN 1126-89. Alimentos. Identificacin y Preparacin de Muestras para el Anlisis Microbiolgico (1ra Revisin).

DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA POTABLE

Incubacin a 37 C durante 24 - 48 h

Incubacin a 37 C durante 24 - 48 h

Incubacin a 37 C durante 24 - 48 h

Tubos con 10 mL doble concentracin de caldo lauril sulfato de sodio (CLSS)

CLSS + 10 mL de muestra

Siembra con asa bacteriolgica de los tubos positivos (produccin de gas) de caldo lactosa a caldos verde brillante bilis 2% y EC

2 3 asadas/Tubo

2 3 asadas/Tubo

Tubos con 10 mL de caldo lactosa verde brillante bilis 2%

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes totales /100 ml de muestra

Tubos con 10 mL de caldo EC o EC- Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes MUG fecales /100 ml de muestra.

Siembra de tubos positivos en placas de Agar EMB para la bsqueda de Escherichia coli