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ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LA LECHE FRESCA

I. OBJETIVOS
 Familiarizarse con los métodos de recuento,con el de NMP, Hongos y
levaduras, RTBMAV.
 Detectar bacterias coliformes totales y fecales.
 Detectar si la muestra traída es apta para el consumo humano.

II. FUNDAMENTO TEORICO

CALDO BRILLA (NMP)


El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y
actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este
método fue empleado para estimar el número de microorganismos en
muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que
también puede ser aplicado para la determinación de microorganismos
aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos
contaminados, por tanto este método es aplicable para estimar el número
de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias
aerobias como anaerobias.
Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces
de fermentar la lactosa a 44º C en vez de 37 ºC como lo hacen los totales.
Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces
están formados por Escherichiacoli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que
los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de
los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la
presencia de contaminación fecal. Éstos últimos se denominan
termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas más elevadas.
Esta es la característica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La
capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de
los animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de condiciones
adecuadas de materia orgánica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo
se han utilizado como indicador ideal de contaminación fecal. Su presencia
se interpreta como una indicación de que los organismos patógenos
pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento
estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades.
BAIRD PARKER
En el medio de cultivo preparado y completo la peptona y el extracto de
carne constituyen la fuente de carbono y nitrógeno, el extracto de levadura
aporta vitaminas del complejo B, la glicina y el piruvato estimulan el
crecimiento de los estafilococos.
Este medio de cultivo es selectivo y diferencial debido al telurito de potasio
y al cloruro de litio, los cuales inhiben el desarrollo de la flora acompañante.
La yema de huevo permite demostrar la actividad lecitinásica.
Los estafilococos coagulasa positiva reducen el telurito a teluro y originan
colonias de color grisáceo-negro, y dan reacción sobre la yema de huevo
produciendo alrededor de la colonia una zona opaca que a menudo tiene
una zona clara más externa.
Se pueden encontrar cepas no lipolíticas, que presentan igual
características de colonias pero sin la zona opaca y clara.
Se debe confirmar la presencia de S. aureus mediante pruebas
bioquímicas.

MEDIO VRBA
El agar biliado-rojo neutro-cristal violeta o medio VRBA es un medio de
cultivo de microorganismos, tanto selectivo, como diferencial ,que se usa
para la identificación y enumeración de coliformes.

Esquema de crecimiento de microorganismos coliformes (Lac+) y no


coliformes (Lac-) en VRBA
Está formado por cierto número de componentes que favorecen el
crecimiento bacteriano, y por otros componentes que dotan a este medio de
sus características diferenciales y selectivas

Componentes que favorecen el crecimiento bacteriano:


-Lactosa (fuente de carbono)
-Extracto delevadura(fuente de vitamina B)
-Peptona (fuente de nitrógeno y en menor medida de carbohidrato y
vitamina.)
Componentes de medio VRBA
Elementos selectivos del medio VRBA:
Sales biliares y cristal violeta (ambos compuestos inhiben en buena medida
el crecimiento de bacterias Gram +, de modo que solo se selecciona el
crecimiento de Gram -, grupo bacteriano en el cual se encuentran las
bacterias coliformes,que son las que se quieren seleccionar en este medio
para su identificación,observación,aislamiento o recuento.)

Elementos diferenciales del medio VRBA:

Indicador de pH rojo neutro, cuyo modo de funcionamiento es el siguiente:


Las bacterias coliformes son fermentadoras de lactosa, al crecen en VRBA
y fermentar lactosa reducen el PH del medio de modo que el indicador rojo
neutro vira a rojo/rosado intenso. Así, de las colonias Gram - que han
crecido en la placa,lascoliformes,pueden ser diferenciadas de otras
colonias Gram -.

PLATE COUNT
Es idóneo para Recuento total en alimentos (FIL,IDF,AOAC,APHA,ICMSF),
diferenciando las colonias, incluso las más diminutas, de las partículas y del
medio. Con este novedoso medio de MICROKIT, distinguirá a simple vista
las colonias, rojas, de las partículas de muestra y del medio, agilizando los
recuentos sin desgastar su vista.

MEDIOS CON EL TIEMPO DE INCUBACION Y SU TEMPERATURA


MEDIO DE CULTIVO T. DE INCUBACION TEMPERATURA
CALDO BRILLA 48 Horas 37°C
PLATE COUNT 48 Horas 30°C
VRBA 48 Horas 37°C
ASN 72 – 120 Horas 28°C
BAIRD PARKER 48 Horas 37°C

III. MATERIALESY MUESTRA

Leche fresca
- Caldo Brilla- Tubos de ensayo
- Platecount- Placas Petri
- VRBA- Extensor
- Baird Parker- Matraz Erlenmeyer
- ASN- Mechero Bunsen
- Pipetas
IV. PROCEDIMIENTO
PREPARACION DE LA DILUCION

a) Caldo Brilla:
Se toma los tres tubos del -3, -2 y -1 (Dilución de H₂O peptonada + leche
fresca); y se procede a tomar 1 ml de cada tubo para trasvasarla otro tubo
previamente ya rotulado con las mismas concentraciones.
Posteriormente añadir 1 ml de Caldo brilla a cada uno de los tubos en los
cuales se añadió la dilución (1ml)
Se debe trabajar con distintas pipetas ya esterilizadas y borear con la
ayuda del Mechro Bunsen la boquilla tanto como la del matraz (Caldo brilla)
y el tubo a trabajar.(encubar)

b)PlateCount:
Tomar placas Petri y rotularlas (-1,-2,-3,-4,-5,-6); tomar 1 ml de cada tubo y
trasvasarla a cada placa predeterminada.Posteriormente añadir 1 ml de
PlateCount a cada uno de las placas en los cuales se añadió la dilución
(1ml) dejar en reposo 10min y después encubar.

c) VRBA
No se realizo
d) ASN
Tomar placas Petri y rotularlas (-1,-2,-3,-4,-5,-6); tomar 1 ml de cada tubo y
trasvasarla a cada placa predeterminada. Posteriormente añadir 1 ml de
ASN a cada uno de las placas en los cuales se añadió la dilución (1ml).

e) Baird Parker
Se toma los dos tubos del -2 y -1 (Dilución de H₂O peptonada + leche
fresca); y se procede a tomar 1 ml de cada tubo para trasvasarla a una
placa previamente ya rotulado con las mismas concentraciones.
Posteriormente añadir 0,1 ml de Baird Parker a cada uno de las placas en
los cuales se añadió la dilución (1ml).

V. RESULTADOS

Determinación de Coliformes Totales de la leche


Método de recuento por dilución en tubo: NMP
De los tubos sembrados en el caldo brilla (prueba presuntiva), se obtuvo los siguientes
resultados(a las 48 horas) para coliformes totales.

DILUCIONES

𝟏𝟎−𝟏 A 10−1B 10−1C 10−2A 10−2B 10−2C 10−3A 10−3B 10−3C


+ + + + + + - - -
3 3 0

Tabla NMP

Tres tubos Tres tubos Tres tubos NMP de

1 ml 1 ml 1 ml gérmenes por
1:10 1:100 1:1000 gramo o ml

3 3 0 240
Recuento Total de Bacterias Aerobias Mesófitas Viables de la leche 20°C
De las placas sembradas en el agar PC, se obtuvo los siguientes resultados(a las 48
horas) paraRTBMAV.

Ufc / ml de N° de colonias
muestra
40 * 4 * 103 160000 +
10 * 4 * 103 400000
Ufc / ml de 560000 _
muestra
280000
280000
4
Resultado 28 * 10 Ufc / ml

Recuento Mohos y Levaduras de la Leche

Numeracion de StaphylococcusAureusde la leche

De las placas sembradas en el Baird Parker, se obtuvo los siguientes resultados(a las
48 horas) paraStaphylococcusAureus.
DILUCIONES

𝟏𝟎−𝟏 10−2
15 colonias El recuento era muy dificultoso

Ufc / ml de N° de colonias Factor de Como se trabajó con


muestra dilución 0.1 ml Resultado

Ufc / ml de
muestra 15 * 102 * 10 15 * 105 Ufc / ml

VI. RECOMENDACIONES Y DISCUSIONES


 Se recomienda el correcto uso de los materiales y el medio de cultivo para
evitar errores de lectura de las colonias formadas en las distintas placas.

VII. CONCLUSIONES
 Se logró conocer y aprender los métodos de recuento, con el de NMP,
Hongos y levaduras, RTBMAV.
 Se logró detectar colonias desarrolladas en las distintas placas Petri.
 La muestra de leche la cual se desarrolló en la práctica es apta para
el consumo humano, ya que cumple con los requisitos microbiológicos ya
establecidos en la NTP.