7.- No debe ser patógeno.

La denominación “Coliformes totales” y “Coliformes fecales” no tiene

validez taxonómica, estos términos sirven mas bien para designar a
grupos de bacterias capaces de crecer en condiciones experimentales
específicas.

7.4 indicadores microbiológicos de la calidad del agua:

La evaluación de la calidad microbiológica del agua de abastecimiento
esta basada en la determinación de indicadores bacterianos que
permiten medir el grado de contaminación fecal. Estos indicadores
deben ser sensibles, económicos y sencillos. Los indicadores
bacterianos mas usados son:

a).- grupo coliforme:

● Coliformes termotolerantes (fecales) y Escherichia coli.

● Coliformes totales.

b) recuento en placa de bacterias heterotróficas.

7.4.1 grupo coliforme:

El grupo coliforme esta conformado por los siguientes géneros:
Klebsiella, Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, los cuales
utilizan la lactosa para producir acido y gas.

7.4.1.1 Coliformes termotolerantes (fecales):

Se denomina Coliformes termotolerantes a ciertos miembros del

grupo de bacterias Coliformes totales que están mas estrechamente
relacionados con la contaminación fecal. Los Coliformes
termotolerantes generalmente no se multiplican en los ambientes
acuáticos. También se los conoce como bacterias Coliformes fecales.

Los Coliformes termotolerantes crecen con una temperatura de

incubación de 44.5˚C. esta temperatura inhibe el crecimiento de los
Coliformes no tolerantes. Se miden con pruebas sencillas, de bajos
costos y ampliamente usados en los programas de vigilancia de la
calidad del agua. Los métodos de análisis son la prueba de tubos
múltiples y la filtración con membrana.
Escherichia coli es el principal indicador bacteriano de contaminación
fecal en el agua. Estudios efectuados han demostrado que la E. coli
esta presente en las heces de humanos y animales de sangre caliente
entre 10 y 10 por gramo d heces.

7.4.1.2 Coliformes totales:

Los Coliformes totales se emplean para la evaluación sanitaria de los
efluentes finales de la planta de tratamiento. En su determinación se
utilizan los mismos métodos propuestos para la determinación de
Coliformes termotolerables.

7.4.2 recuento en placa de bacterias heterotróficas:

El recuento en placa de bacterias heterotróficas detecta una amplia
variedad de microorganismos, principalmente bacterias que son
indicadoras de la calidad microbiológica general del agua.

Se ha comprobado que el conteo total es uno de los indicadores mas

confiables y sensibles de la desinfección del agua. Para su
determinación se emplea una prueba sencilla y de bajo costo. Los
métodos son:

● El vertido en placa.

● La difusión en superficie.

● la filtración con membrana.

Como se puede apreciar la evaluación de la calidad microbiológica del

agua se basa en la determinación de indicadores bacterianos
Coliformes totales y Coliformes termotolerantes, los cuales son
removidos con mayor facilidad que los quistes de protozoarios, por lo
cual la ausencia de Coliformes no indica de forma absoluta la
ausencia de quistes. Ante un brote epidémico de enteroparasitos, no
bastaría la determinación de Coliformes en el agua, sobre todo
cuando esta es de origen superficial y ha sido únicamente sometida a
desinfección.

Estudios efectuados han demostrado que en el agua superficial sin

tratamiento existe una mediana correlación entre la presencia de
algas y protozoarios enteroparasitos. En el agua tratada se presenta
una buena correlación entre la presencia de protozoarios y niveles de
turbiedad, como también con el conteo de partículas de cinco micras.
7.5 Envío de muestras al laboratorio:
Una vez tomada la muestra, esta debe enviarse al laboratorio lo mas
rápido posible.

7.5.1 Agua muy contaminada:

Las muestras deben llegar al laboratorio antes que transcurran 6
horas desde la toma, aunque se puede aceptar 8 horas como plazo
máximo.

7.5.2 Agua tratada o libre de contaminación:

Las muestras deben llegar al laboratorio antes que pasen 24 horas
desde la toma, aunque se puede aceptar 30 horas como plazo
máximo.

7.5.3 Conservación de la muestra:

La muestra debe conservarse en refrigeradoras portátiles hasta que
se haga el análisis

8.- Tipo de estudio:

Se realizó un análisis observacional, retrospectivo, transversal en la
determinación microbiológica y control de calidad del agua potable.

9.- Delimitación del problema:

9.1Delimitación espacial:

El análisis se realizara en instalaciones de laboratorios BIOCENTER de

la ciudad de Santa Cruz De La Sierra.

9.2 Delimitación temporal:

El análisis se realizara entre los meses de enero a marzo del 2013.

9.3 Delimitación sustantiva:

Se utilizaran muestras de agua potable provenientes de distintas

fuentes y procesamientos, con probabilidades de contaminación fecal.

10.- materiales y métodos.-

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES, FECALES Y
ESCHERICHIA COLI MEDIANTE EL NUMERO MAS PROBABLE
10.1 OBJETIVO
Este procedimiento establece la metodología para realizar el recuento
de Coliformes totales, fecales y Escherichia coli.
10.2CAMPO DE APLICACIÓN
Este procedimiento se aplica a los Alimentos y aguas que de acuerdo
a norma utilicen esta técnica.
10.3REFERENCIAS
NB 32002 Ensayos microbiológicos - Preparación de muestras para
el análisis microbiológico

NB 32005 Ensayos microbiológicos - Recuento de bacterias

coliformes

Manual de Técnicas microbiológicas para alimentos y aguas.

Ministerio de Salud Instituto de Salud Pública de Chile. 1998.

SIGLA SIGNIFICADO
SGC Sistema de Gestión de la Calidad
LMA Laboratorio de Medio Ambiente y Alimentos

10.4 RESPONSABILIDADES
La responsabilidad por el cumplimiento del presente documento es de
todo personal técnico analista del laboratorio de microbiología

10.5 PRECAUCIONES
 El personal analista debe seguir todos los pasos de la técnica
10.6 MATERIAL Y EQUIPOS
 Autoclave
 Balanza
 Baño de agua, regulado a 44,5oC
 Homogenizador Stomacher
 pHmetro
 Estufa de incubación regulada a 35oC±2oC
 Mechero Bunsen

Material y reactivos
 Tubos de cultivo de 150 mm x 15 mm
 Tubos Durham o de fermentación
  Frascos y tubos de dilución
 Gradilla para tubos
 Pipetas graduadas de 10 ml y 1 ml (estériles)
 Asas de inoculación
 Marcador indeleble
 Propipeta
 Puntas estériles
 Medios de cultivo y reactivos:
 Diluyente: agua peptonada al 0.1 %,
 Caldo laurilsulfato triptosa
 Caldo verde Brillante - bilis 2%
 Caldo E. coli EC
 Agua triptonada al 1%
 Reactivo de Kovacs
 Caldo RM-VP (Caldo Rojo de Metilo según Voges Proskawer)
 Agar Citrato de Simmons
 Solución indicadora de Rojo de metilo
 Solución al 5% de alfa naftol
 Solución al 40% de hidróxido de potasio
Modo de preparación de los reactivos y medios de cultivo ver en PRO-
24
10.7 PROCEDIMIENTO
Pre tratamiento de la muestra y diluciones:

10.7.1 Prueba presuntiva:

Inocular 9 tubos con caldo lauril sulfato de la siguiente manera:

3 tubos con 1 ml de la dilución 10-1

3 tubos con 1 ml de la dilución 10-2

3 tubos con 1 ml de la dilución 10-3

Mantenga la pipeta en un ángulo de modo que su borde inferior se

apoya contra el tubo.

Incubar a 35oC por un periodo de 24 a 48 horas.

Lectura de tubos de la prueba presuntiva

- Anotar la formación de gas en los tubos de fermentación

- Anotar los tubos en los que se ve presencia de gas al cabo de 24
horas, incubar los negativos, 24 horas adicionales.
- La ausencia de gas a las 48 horas significa prueba presuntiva
negativa para Coliformes.
 - Si existe la formación de gas en los tubos registra el número de
tubos positivos de cada dilución.
-
Cuando la muestra a ensayar es agua, utilizar la serie de 5 tubos.
Trabajar inoculando 10 mL en 5 tubos de caldo Lauril Sulfato triptosa
doble concentración.

Inocular 5 tubos de caldo LTS concentración simple con 1mL de la

muestra en cada tubo.

Inocular 5 tubos de caldo LST concentración simple con 0,1 mL de la

muestra en cada tubo

10.7.2 Prueba confirmativa para Coliformes totales:

- De cada uno de los tubos con caldo de lauril sulfato que han
producido gas, se transfiere una asada en tubos con caldo verde
brillante - bilis 2%, con tubos Durham invertidos.
- Se incuban a 35oC±2oC de 24 a 48 horas, la formación de gas
confirma la presencia de bacterias coliformes, se anota el
número de tubos cuya reacción es positiva.
- Incluir tubos de control en la incubadora. Enterobacter
aerogenes como control positivo y Staphylococcus aureus como
control negativo. Inocular siempre primero el control negativo y
luego recién el positivo
-
10.7.3 Prueba confirmativa para Coliformes fecales:

De cada uno de los tubos con caldo de lauril sulfato que han
producido gas, se transfiere una asada en tubos con caldo E.coli EC
con tubos Durham invertidos (atemperados previamente a 44,5 oC por
30 minutos)

Los tubos sembrados se incuban en baño María con cubierta a 44,5 oC

por 24 horas. El nivel de agua del baño debe sobrepasar el nivel de
caldo de los tubos.

La presencia de gas indica una prueba positiva para coliformes

fecales Se debe incluir una cepa de Escherichia coli como control
positivo y una cepa de Enterobacter aerogenes como control
negativo.

Expresión final de resultados NMP de Coliformes:

El número de coliformes se expresa por el Número Más Probable

(NMP) por gramo o mL de producto, según la tabla NMP.
Índice del numero más probable ( NMP) y límite de confianza
(95 %) cuando se utilizan 3 tubos

Número de tubos positivos Índices de

confianza 95 %

1:10 1:100 1:100 NMP Inferior Superior

0 por g
10-1 10-2
o mL
10-3

0 0 0 3

0 0 1 3 0,5 9

0 1 0 3 0,5 13

1 0 0 4 0,5 20

1 0 1 7 1 21

1 1 0 7 1 23

1 1 1 11 3 36

1 2 0 11 3 36

2 0 0 9 1 36

2 0 1 14 3 37

2 1 0 15 3 44

2 1 1 20 7 89

2 2 0 21 4 47

2 2 1 28 10 150

3 0 0 23 4 120

3 0 1 39 7 130

3 0 2 64 15 380

3 1 0 43 7 210

3 1 1 75 14 230

3 1 2 120 30 380
 3 2 0 93 15 380

3 2 1 150 30 440

3 2 2 210 35 470

3 3 0 240 36 1300

3 3 1 460 71 2400

3 3 2 1600 150 4800

3 3 3 2400

Fuente: Anexo A, NB 32005

El número de tubos positivos por dilución permite obtener una cifra

compuesta de tres dígitos.

Ej. 3. 2. 0 esta combinación se consulta con la tabla de NMP y se

expresa como NMP = 93 coliformes fecales

Cuando se utilizan más de tres series de diluciones decimales, se

considera el resultado de tres series, eligiendo la dilución más alta
que da resultados positivos en los tres tubos y las dos diluciones
siguientes. El resultado de estas tres diluciones se leen en la tabla de
NMP.

Multiplicar por 10 si se utilizan las diluciones 10 -2,10-3 y 10-4; por 100

si se utilizan las diluciones 10-3, 10-4, 10-5 y así sucesivamente.

En caso de que las tres series de los tubos confirman positivos, se

debe hacer diluciones de menor concentración.

En el caso de ensayar muestras de aguas, utilizar la tabla del NMP

referida a 5 tubos. Utilizar la tabla de Métodos Normalizados para el
análisis de aguas potables y residuales. APHA, AWWA, WPCF.

10.7.4 Prueba confirmativa para E. coli

De cada tubo que contiene caldo Escherichia coli con formación de

gas, se extrae una porción con el asa de inoculación y se siembra por
agotamiento sobre la superficie de placas de agar EMB, es esencial
que una porción de la placa muestre colonias bien aisladas.
Incubar las placas a 35oC±2oC de 24 a 48 horas y luego se examinan
las colonias sospechosas de E. coli

Se pican dos colonias típicas de cada placa para realizar las pruebas
bioquímicas IMVIC.

Pruebas bioquímicas (Prueba IMVIC)

Se hacen los ensayos de Voges Proskawer, citrato, rojo de metilo e

indol con las colonias desarrolladas en el agar para recuento
bacteriano en placa.

Prueba de rojo de metilo

Inocular un tubo que contiene caldo MR-VP incubar 48 horas a la

temperatura de 35oC±2oC, luego, asépticamente y a temperatura
ambiente, transferir a un tubo de ensayo 1 ml del cultivo incubado y
agregar 0,6 ml de solución de alfa naftol y 0,2 ml de la solución de
KOH al 40%, agitando luego de la adición de cada solución.

Leer el resultado a partir de los 15 minutos hasta un periodo máximo

de 2 horas de haber agregado los reactivos.

Prueba positiva color rosado

Prueba negativo color pardo

Prueba de Indol

Inocular un tubo que contenga caldo triptona. Después de 24 horas

de incubación a 35oC±2oC, añadir 02, a 0,3 ml del reactivo de Kovacs,
para la investigación del indol mezclar bien y examinar.

Prueba positiva formación de un anillo rojo (anillo o solución

alcohólica)

Prueba negativa se mantiene el color del reactivo

Prueba del citrato

Inocular suavemente en línea recta un tubo con agar citrato

deSimmons, incubar 35oC±2oC de 24 a 48 horas

Prueba positiva color azul

Prueba negativa color verde

Interpretación de pruebas bioquímicas

Todos los tubos que fermentan lactosa con producción de gas a
35oC±2oC en 48 son bacilos gram negativos cuyas pruebas
IMVIC sean ++-- biotipo I ó -+-- biotipo II Son considerados E
coli, según tabla

INDOL ROJO DE VOGES CITRATOS TIPO

METILO PROSKAWER SIMMONS

+ + - - E. coli típico

- + - - E. coli
atípico

+ + - + Típico
intermedio

- + - + Atípico
intermedio

- - + + E.
aerógenes
típico

+ - + + E.
aerógenes
típico

Calcular el NMP de Escherichia coli, basándose en el número de tubos

de caldo EC en que se confirmó su presencia.